Способ прогнозирования врожденной патологии у детей

 

Использование: в медицине и может применяться при диагностики в неопатологии , в том числе и в медицинской генетике. Сущность изобретения: проводят фенотипическую оценку количества микроаномалий развития у новорожденных с последующим микрофлуориметрическим исследованием структурно-функциональных особенностей хроматина лимфоцитов периферической крови, регистрируемых по изменению связывания флуорохромного красителя акридинового оранжевого с ДНК хроматина лимфоцитов. При выявлении у новорожденного 5-ти и более микроаномалий развития и изменений связывания с ДНК красителя более чем на 16% по сравнению с контролем ребенка выделяют в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии. Способ позволяет повысить точность прогноза. 3 табл.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1817854 А3 (я)5 6 01 N ЗЗ/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4799190/14 (22) 05.03,90 (46) 23.05.93. Бюл. М 19 (71) Республиканский научно-исследовательский центр охраны здоровья матери и ребенка Минздрава Республики Казахстан (72) В,Ю.Сосновская, Н.П,Михайличенко и

В, С,Толмачев (73) Республиканский научно-исследовательский центр охраны здоровья матери и ребенка Минздрава Республики Казахстан (56) Неопатология под ред. Гаврюшина З.А., Сошниковой Н.А.— Л.: Медицина, 1985, с.

334, (54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВРОЖДЕННОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ (57) Использование; в медицине и может применяться при диагностики в неопатолоИзобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике.

Цель изобретения — прогнозирование врожденной патологии у детей путем фенотипической оценки микроаномалий развития и микрофлуориметрии ядер лимфоцитов препаратов крови.

Поставленная цель достигается тем, что новорожденные обследуются клинически и при выявлении у них пяти и более фенотипических признаков микроаномалий развития проводится анализ крови, суть которого заключается в определении интенсивности свечения комплекса: дезоксирибонуклеиновая кислота — флуорохромный основной краситель акридиновый оранжевый {ДНКгии, в том числе и в медицинской генетике.

Сущность изобретения: проводят фенотипическую оценку количества микроаномалий развития у новорожденных с последующим микрофлуориметрическим исследованием структурно-функциональных особенностей хроматина лимфоцитов периферической крови, регистрируемых по изменению связывания флуорохромного красителя акридинового оранжевого с ДНК хроматина лимфоцитов. При выявлении у новорожденного 5-ти и более микроаномалий развития и изменений связывания с

ДНК красителя более чем на 16% по сравнению с контролем ребенка выделяют в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, Способ позволяет повысить точность прогноза. 3 табл.

° Ъ

АО). При изменении связывания флуорохро- О© ма с ДНК, регистрируемого микроцитсфлуо. риметрией ядер лимфоцитов, свыше 16% по сравнению с контролем (клинически здоро- СО вые индивиды), выделяют ребенка в группу (ЛП риска по реализации наследственной и р врожденной патологии, Способ осуществляется следующим образом: проводят оценку фенотипических проявлений микроаномалий развития у но- Сд ворожденных. Перечень используемых микропризнаков включает микроаномалии развития шеи и туловища, кожи, волос, головы и лица, глаз, ротовой полости, ушей, позвоночника, конечностей, живота и пзловых органов. Цитохимический анализ крови про1817854 водят так; мазок готовят непосредственно из 20 — 15 мкл цельной крови, взятой из пальца. Мазки не подсушивая, фиксируют в смеси абсолютного этанола и ацетона (1:1) не менее 30 минут при комнатной температуре (при температуре+4 С возможно хранение препаратов в фиксирующей смеси до 72 ч).

Затем проводят гидратацию препаратов, последовательно инкубируя их по 5 мин в спиртах понижающей концентрации (100, 90О, 60О, 30 ), промывают в дистиллированной воде 1 мин. После этого препараты инкубируют 5 минут в ацетатном буфере (рН

4,4) (5,5 r ацетата натрия — СНзСООИа ЗН2О и 6,8 r хлорида натрия — NaC1 растворяют в дистиллированной воде, конечный объем раствора — 1 л, к нему необходимо добавить 4,9 мл ледяной уксусной кислоты — СНэСООН). Затем проводят окраску препаратов в течение 15 минут в растворе флуорохромного красителя акридинового оранжевого (АО), который готовят на ацетатном буфере — рН 4,4 (молярность раствора 10; 30, 1 мг красителя

-л растворяют в ацетатном буфере, доводя объем раствора до 1 л). После окраски препараты 3 раза по 5 мин промывают в ацетатном буфере, содержащим акридиновый оранжевый в концентрации 10 M (2 мл раствора АО 10 M и 198 мл раствора ацетатного буфера) и заключают в каплю того же раствора под покровное стекло, края которого окантовывают резиновым клеем, Интенсивность связывания красителя ядрами лимфоцитов регистрируют на зондовом цитофлуориметре типа Люмам-И 3, Люминесценцию возбуждают светом с длиной волны

436 нм при помощи интерференционного опак-иллюминатора. Интенсивность зеленой {530 нм) люминесценции выражается в условных единицах, снимаемых со световога индикатора числового вольтметра, Изменение флуоресценции комплекса ДНК-AO y обследуемых оцениваю.r в процентах относительно показателей контроля (донора).

Для сопоставления показателей нормы и патологии берут усредненные данные флуоресценции 10 клеток каждого образца, причем окраску сравниваемых препаратов производят одновременно. Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Ребенок Р-ко, родился

29.10.1985 г„от первых родов (N. ист. развития новорожденного — 4276). Беременность протекала без особенностей. Матери ребенка 22 года, отцу — 23, родители практически здоровы. Роды срочные. Родился живой доношенный ребенок мужского пола массой 3100 г, рост 50 см, с оценкой по шкале Апгар — 8-9 баллов, Период адаптации протекал благоприятно. На.3-и сутки была взята кровь на цитохимический показатель — изменение флуоресценции комплекса ДНК-AO в пределах нормы (2 ), Из микроаномалий развития у ребенка отмечалось высокое небо(количество микроаномалий развития (МАР) — 1). Объективно состояние ребенка расценивалось как удовлетворительное, На 7-е сутки ребенок выписан домой. При обследовании ребенка в

10 катамнезе (воэраст 1 г.) наблюдалось соответствующее возрасту физическое и психомоторное развитие. В момент осмотра ребенок практически здоров.

fl р и м е р 2. Ребенок М-ва, родился

15 26.12.1985 г., от вторых родов (N ист, развития новорохсденного — 5215), Первая беременность в 1982 г„от 1 брака закончилась срочными родами, ребенок здоров. Данная беременность — 2-я, от второго брака, Про20 текала с явлениями угрозы прерывания при сроке 7-8 недель, женщина находилась на стационарном лечении, получала сохраняющую терапию. Мать страдает экстрагенитальным заболеванием — эоб !! степени, 25 отец здоров. Роды при сроке 39-40 недель протекали беэ особенностей. Родилась живая доношенная девочка массой 3000 г, рост

50 см, с оценкой по шкале Апгар — 7-8 баллов. Состояние ребенка расценено какудовЗ0 летворительное. Фенотипически у ребенка

1 при рождении отмечено 6 МАР: телеангиэктаэии нз затылке, уздечка верхней губы, дизморфичные ушные раковины, клинодактилия мизинцев на руках, высокое небо, кожная синдактилия !1-!!! пальцев на стопах, На 3-и сутки у ребенка была взята кровь на цитохимический анализ — отличие интенсивности свечения ядер лимфоцитов от контроля составляло 18 Д. С учетом вы40 явленных MAP и цитохимического показателя крови ребенок был выделен в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, В катамнезе, в возрасте 1 года, ребенок был повторно обсле45 дован, установлено, что становление опорно-двигательнои и речевой функции у ребенка идет с задержкой. Ребенок состоит на учете у невропатолога с диагнозом — перинатальная энцефалопатия неясного гене50 за. Также была выявлена патология со стороны мочевыделительной системы, ребенок состоит на учете у уролога с диагнозом — аномалии развития мочеточников, вторич ный пиелонефрит.

55 Пример 3. Ребенок Б-в, родился

6,10.1985 r., от 3-й беременности, 2 срочных родов. Матери ребенка 31 год, отцу — 31 год.

Мать страдает хроническим заболеванием— неспецифический полиартрит, с обострением в 3-4 недели беременности. Отец -- инва1817854 лид It группы (после травмы). У женщины Медицина, 1978, с, 294). Для МАР значение первая беременность в 1977 г. закончилась границы проявления наследственной и срочнымиродамибезособенностей. разви- врожденной патологии равно 5 (выборка тие ребенка соответствуетвозрасту. Вторая здоровых-345чел.,детей с наследственной беременность — медицинский аборт без ос- 5 и врожденной патологией — 35; значимость ложнений. Данная беременность — третья, различий — 0,00001); для цитохимического прот кала с явлениями токсикоза t полови- теста — 167 (выборка здоровых составила ны беременности. Роды срочные без осо- 102 чел„детей с отклонениями в состоянии бенностей, родилась живая доношенная здоровья 109, значимость различий— девочка массой 3350 г, рост 50 см с оценкой 10 0,00001). по шкале Апгар 7 — 8 баллов. Фенотипически Учитывая данные вышеприведенных ису ребенка отмечалось 10 MAP: монголоид- следований было проведено комплексное ный разрез глаэнь.х щелей, гипертелоризм, клиника-лабораторное обследование 79 ноэпикант, узкое небо, дизморфичные ушные ворожденных в раннем неонатальном перираковины, четырехпальцевые борозды на 15 оде и повторно в годовалом возрасте обеих ладонях, брахидактилия, брахицефа- (только клинический осмотр). пия, выраженная общая гипотония, аускуль- Результаты обследования приведены в тативно выслушивается систолический шум табл, 2. на верхушке. Реб нку был выставлен клини- Наследственная и врожденная патолоческий диагноз синдром Дауна. На вторые 20 гия диагностирована у 35 детей (группы 1а, сутки жизни у ребенка было взята кровь на 16, 4а, 46), причем при рождении патология цитохимический и цитогенетический анали- была выявлена у 20 детей, в возрасте года— зы, Цитохимический тест показал отличие у 15. А предлагаемый способ позволил вьют контроля на 220 . Цитогенетический ана- делить в группу риска в раннем неонатальлиз крови получен через месяц, который 25 ном периоде из них 34 ребенка (30 подтвердил клинический диагноз: кариотип новорожденных проходили в группу риска

47хх + 21. по обоим критериям — группа 1а, 4-ро по

При обследовании новорожденных де- одному из тестов — группы t6, 4а). тей нами было обнаружено сочетание до- Из 34 новорожденных, имевших надпостоверного у.",еличения количества MAP и 30 роговые значения цитохимических показадостоверного (р 0,001) изменения связыва- . телей (группы с ta по Ga), 5 и более MAP ния флуорохрома АО с ДНК хроматина лим- обнаружено у 91,2 (31 ребенок — группы фоцитов у детей с врожденными и 1а,26), Иэ них врожденная и наследственнаследственными заболеваниями различ- ная патология диагностирована у 30 детей ного генеэа по сравнению со здоровыми 35 (группа 1а)..Структура потоков представлена: врожденные пороки сердца, ортопедиПроведена клиническая оценка состоя- ческая патология, патология органов слуха, ния здоровья детей в катамнезе (203 чел.). зрения, почек и мочевыделительной систеУстановлено, что физическое развитие де- мы, Лишь 1 ребенок (группа 4а) с врождентей взаимосвязано с количеством микро- 40 ной патологией имел меньше 5 МАР, но аномалий развития: так, только 26,80 детей цитологический тест у него превышал порос повышенной стигматизацией имели пока- говое значение. затели физического развития, соответству- Детей, изменения структуры хроматина ющие .их возрастной норме. Аналогичная которых не превышали 16 (по сравнению связь установлена при оценке психомотор- 45 с контрольными показателями), наблюданого развития детей; у 67,9 детей имею- лось 45 человек (группы с 16 по 66). Из них щих пять и более МАР, отмечалась задержка более 5 MAP было у 7 (15,6 ) (груп и ы 16, психомоторного развития, тогда как у де- 26, Зб), Причем, у 3-х из них была выявлетей, имеюших 1 МАР -лишь в 2,3 случаев. на врожденная патология (группа 16), 2-е

По оценке максимального расхождения 50 состояли на диспансерном учете у неврофункций распределения двух выборок (здо- патолога по поводу перинатальной энцефаровые и новорожденные с отклонениями в лопатии (группа 26) и лишь 2 ребенка были состоянии здоровья) определены статисти- практически здоровы (группа Зб). ческие высокоэначимые значения границ чувствительности предполагаемых диагно- 55 (группы 46, 56, 66) и только у 1 иэ них диагстических критериев: количество MAP и ци- ностиро али врожденную пагологию (врожтохимический показатель (Критерий денная глухота, возможно, тера — îãåííîão

Колмогорова-Смирнова-Гублер Е.В. Вычис- характера) (группа 46). лительные методы анализа и распознава- По данным ка д нным катамнеза выяснено, что ния патологических процессов.— M.: практически здоровых,".,етей было 35 чело1817854

Таблица1

Данные клинико-лабораторного обследования новорожденных

Средняя частота микроаномалий развития

Изменение и флуоресценц

ДНК-АО(в покээател

Группы обследованных новорожденных

1,87 +0,3 (и = 240) 7,96 «+0,4 (и 167) Здоровые

5,3 (и=

23,2 (и

С врожденной и наследственной патологией

Дастверность различий (р) 0,001

О, век (группы Зб, ба, 66): у 32 оба критерия (количество MAP и цитохимический показатель) имели значения соответствующие норме (группа 66), у 2-х детей количество MAP превышало 5 (группа Зб), у 1-го noporoaoe значение превышал цитохимический показатель (группа ба).

Чувствительность способа соответствует 70,5;(„т.к. ложно-отрицательный результат(хотя бы по одному из критериев) из 44 действительно больных детей (группы 1а, 16, 26, 26, 4а, 46, 5а, 56) наблюдался у 13 (группы 16, 26, 46, 56, 4а, 5а); а учет ложноотрицательного результата одновременно по двум критериям дает чувствительность предлагаемого способа 86,4 . Специфичность — 91,4 : ложнополажительные результаты иэ 35 здоровых детей (группы Зб, ба, 66) отмечены у 3-х (группы 36, ба) (по одному из двух учитываемых критериев; ложноположительных результатов по 2-м критерием одновременно среди здоровых не отмечено).

Данные клинико-лабораторного обследования детей представлены в табл. 3.

На основании представленных материалов можно заключить, что предлагаемый способ позволяет в ранние сроки выявлять среди здоровых новорожденных детей группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, что представляется важным для своевременного назначения коррегирующей терапии. Кроме того. отметим дополнительные преимущества предлагаемого способа: позволяет дать объективную оценку состояния новорожденного, выраженную в числовых значениях; относи5 тельная дешевизна способа (стоимость одного анализа составляет 2 рубля 80 коп.); позволяет значительно ускорить диагностическую процедуру (анализ проводится за 22,5 ч, тогда как на кариотипирование

10 затрачивается в среднем 101 ч на способ выбранный за прототип — 7 часов; 4- мало травматичен (для анализа достаточно капли крови), прост в исполнении и не требует высококвалифицированной подготовки ис15 нолнителя, импортных препаратов и аппаратуры, Формула изобретения

Способ прогнозирования врожденной

20 патологии у детей путем фенотипической оценки микроаномалий развития, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, у новорожденного при выявлении пяти и более фенотипических

25 признаков микроаномалий развития допол нительно проводят микрофлуориметрию ядер лимфоцитав препаратов крови, предварительно окрашенных акридиновым оранжевым, измеряют интенсивность флуо30 ресценции акридинового оранжевого и при ее увеличении относительно нормы на 16 и более прогнозируют врожденную патологию.

1817854

Таблица2

Распределение детей с учетом пороговых значений количества микроаномалий развития и цитохимического теста по группам в соответствии с состоянием здоровья (по данным ката мнеза) Обозначание групп

Цитохимический тест

Количество

Группы детей микроаномалий развития показатели показатели (16 ) 30

32

Табли ца 3

Показатели клинико- Наличие врожденной или лабораторного обсле- наследствен. патологии дования новорожденного

1 Регистр, NP У ) Фамилия ! матери ребенка при рожле- в катамнезе нии кол-во изменение флуоИРР ресценции РОпНК (в 00) 6

1 И-а 61

2 Б-а

3 А-а 103

4 Х-ч 10/200

5 T-р 17/214

6 О-и 143

7 К-а 71

8 М-а 85

104

9 Я-о

10 Р-о 3

Превышает пороговое значение(5) Ниже порогового значения (5) С наследственной и врожденной патологией

Диспансерного наблюдения

Здоровые

С наследственной и врожденной патологией

Диспансерного наблюдения

Здоровые равны или превышают пороговое значение ниже порогового значения (16 ) 1817854

1 2 3

11. П-а 14/208

12 И "а Э/198

13

19 П-г 137

20 С-а 139

21 К-а 161

231

22 Х-а

4/188

23 А-а

24 И-а 21/224

25 К-а 23/226

26 Б-а 24/220

27 Т-а 133

28 Т-а 46

29 К-а 87

3

30 С-а 115

31 Щ-а 120

32 А-à 145

33 С-а

34 И-а 8

35 С-а 18

36 Б-а 40

37 С-а 59

38 Л-а 73

X-а 109

13

13 П-а

14 Д-х

15 Б-а

16 К-о

17 К-о

18 И-а

11/202

12/204

20/222

22/220

38

4 J 5

13

14

4

16

Продолжение табл. 3

"l детский церебральный паралич

Перинатальная энцефалопатия

Перинатальная энцефалопатия

Пери натальная энцефалопатия, пиелонефр.

Перинатальная энцефалопатия

Лисплаэия тазобедренных суставов

Перинатальная энцефалопатия

181 854

14

Пролопжение табл. 3 т r

4 5 P r, 7

40 H-a

41 Б-а

112

Перинатапьная энцефалопатия

13

34

Врожденный порок сердца

18

Перинатальная знцефалопатия

49 М-а

50 К-а

26

17

51 Л-я

52 Н-а

20

56 И-я

Врожденный Вы вих бедра

42 С-а 27

43 !11-а 28

44 Г-а 48

45 Д-я 207

46 Г-а 67

47 Р-а 117

48 К-а 237

53 В-î 191

54 И-à 19

55 -Ка 91

r Г

Дисплазия тазобедренных суставов,0исплазия тазобедренных суставов

Врожденный вывих бедра исплазия тазобедренных суставов

Врожденная катаракта

Врожденный порок серд«а перинатальная энцефалопатия

Врожденный порок сердца, задержка, психо-физического развития

Лномалия, развития мочеточника, вторичный пиелонефрит, перинатальная энцефалопатия

Перинатальная энцефалопатия, гипотрофия

Патология зрения

Патология опорнодвигательного аппарата

liPIlP неклассифицированный комплекс

Лисплазия тазобедренных суставов

Врожденный порок сердца, перинатальная энцефалопатия

1817854

16 табл. 3

ВПР

8

30

23 говая грыжа

18

165

67 А-а

Миопатия

68 Ч-а

176

МВПР

Болезнь

Дауна

10

33

Болезнь

Дауна

Болезнь

Дауна

МВПР

57 Ф-а 95

58 М-а 107

59 Ч-а 172

60 К-а

61 П-а 29

62 С-а 138

63 В-р 5

64 К-а 64

65 Ш-о 94

66 l.I я 98

69 Б-а 97

70 Н-а 6

71 Р-о 96

72 М-а 100

73 Т-а 132

74 К- 159

Продолжение

Спиномозго вая грыжа

Аномалад T.-IT. жаберных дуг

СпиномоэСпиномозговая грыжа

Косоглазие, миопия

Фиброзная дисплазия

Экзостаэы

Синдром ИерешевскогоТернера

Аномалад I-II жаберных дуг

МОПР (патология зрения, почек, врожденный парок сердца) Синдром ВидеманаБеквита

Спиномозговая грыжа

ВПР (патология опорно-двигательного аппарата, задержка психоречевого развития) ВПР ЦНС, миопатия

Дюшена

Синдром Шепешевского-Тернера

Болезнь Дауна

ВПР, патология обменного характера, миопатия

Болезнь Дауна

Болезнь Дауна

Синдром КоФФина-Сириса

Синдром Лоуренса-Муна-Бидля

1817854

Продолжение табл.3

6 7

76 Ч а 36 8

Синдром Нуннена

МВПР

МВПР

127

77 Р-ь

Болезнь Дауна

78 8-а 93

79 А-а

Составитель В, Сосновская

Техред М. Моргентал Корректор M. Куль

Редактор Т. Иванова

Заказ 1741 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

36

Болезнь

Дауна

Микроцефалия

Перинатальная энцефалопатия

Рото-пальцелицево" синдром

Синдром

Коккейна