Способ получения рестриктазы s @ ii

 

Использование:биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: способ выделения рекстриктазы Sso II из клеток E.coli В 834 d 24, несущих плазмиду d 24, предусматривает трехстадийную схему хроматографической очистки: голубая сефароза. фосфоцеллюлоза Р II, аффинная хроматография на денатурированной ДНК- целлюлозе, причем активные фракции с фосфоцеллюлозы подвергают диализу против 5-30 мМ К-фосфатного буфера. Получают рестриктазу с высокой степенью чистоты, полностью свободную от неспецифических нуклеазных примесей Фермент как и аналогичные препараты коммерческих фирм, обладает высокой удельной активностью и стабилен в течение 12 месяцев. Фермент Sso II узнает последовательность СС N GG, в которой центральный нуклеотид вырожден по всем четырем основаниям. Фермент может быть использован в генной инженерии для клонирования индивидуальных генов , создания гибридных молекул и в тонких структурных исследованиях, при картировании генома 1 табл. 5 ил (/ С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ а

Л

ОС

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4920753/13 (22) 20.03.91 (46) 23.06.93. Бюл, М 23 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР и Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И, И.Мечникова (72) И,И.Никольская-Санович, T.М,Упорова.

Е.С.Громова, И.Я.Левченко, Е.Е.Арутюнян.

И. М. Грубер и Е.А.Кубарева (56) Roberts R,J. Restriction and modification

enzymes and their recognition sequence.

Nucl. Acids. Res„1983, 11. М 1, р, 135-166.

Косых А.М„Пунтежис М,А. Выделение рестриктирующей эндонуклеазы Есо R ll.

Биохимия, М 47, с.619-624.

Упорова T.M.. Карташева И.М., Скрипкин Е.А., Лопарева Е.Н„Никольская И.И., Дебов С,С. Рестриктирующие эндонуклеазы из sonnei 47, Вопр. мед. химии, 1985, т.

31, с, 131-136. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ

Sso II (57) Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: способ

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии и касается способа получения рестриктирующей эндонуклеазы

Sso II, которая может быть использована для определения первичной структуры ДН К, рестрикционного анализа. создания гибридных молекул.

Целью изобретения является повышение степени очистки целевого продукта, Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцирующего микроорганиз„„. Ж„„1822877 Al выделения рекстриктазы Sso ll из клеток

Е.coli В 834 d 24, несущих плазмиду d 24, предусматривает трехстадийную схему хроматографической очистки: голубая сефароза, фосфоцеллюлоза P II, аффинная хроматография на денатурированной ДНКцеллюлозе, причем активные фракции с фосфоцеллюлозы подвергают диализу противв 5-30 м M К-фосфат ного буфе ра. Пол уча ют рестриктазу с высокой степенью чистоты, полностью свободную от неспецифических нуклеазных примесей. Фермент как и аналогичные препараты коммерческих фирм, обладает высокой удельной активностью и стабилен в течение 12 месяцев. Фермент

Sso II узнает последовательность СС N GG, в которой центральный нуклеотид вырожден по всем четырем основаниям. Фермент может быть использован в генной инженерии для клонирования индивидуальных генов, создания гибридных молекул и в тонких структурных исследованиях, при картировании генома. 1 табл.. 5 ил. ма используют штамм Е. соii В834/024. несущий рекомбинантную плазмиду d 24, ответственную за синтез R Sscll (4). Активные фракции с фосфоцеллюлозы P 11 подвергают диализу против 5 — 30 MM К-фосфатного буфера и проводят дополнительную аффинную хроматографию на денатурированной

ДН К-целлюлозе.

3а единицу активности рестриктазы принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепле1822877 ния 1 мкг ДНК фага в течение 1 ч при 37 С.

Активность фермента определяется в инкубационной смеси объемом 50 ml, содержащей 1 — 2 ml ферментного препарата, 1 мкг

ДН К фага А и буферный раствор следующего состава: 0,1 М трис-HCI, 0,01 М MgClz, 0,001 М меркаптоэтанола, 50 мМ NaCI pH7,4. Время инкубации 1 час при 37 С.

Фрагментацию ДНК тестируют в 0,8 агарозном геле. Гель окрашивают раствором этидия бромида в концентрации 3 мкг/мл в течение 15 мин и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нм с красным светофильтром.

Примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1. Клетки Е.coll выращивают в ферментере AHKYM-2 на среде Лурия до конца экспоненциальной фазы роста. Разрушение клеток проводят методом ультразвуковой дезинтеграции при +4 С в течение

5 мин в режиме 12 кГц, Обломки клеток удаляют центрифугированием при 40000 об/мин. Хроматографическую очистку фермента на ГС и ФЦ Pll проводят аналогично способу-прототипу, Фракции после Ф Ц P I I. содержащие рестриктазную активность, диализуют против рабочего буфера (РБ) р Н 7,4. содержащего 5 мМ фосфата калия, 7 мМ мерка птоэтанола и 10 мМ ЭДТА, наносят на колонку с денатурированной ДНК-целлюлозой размером 1,2 х 36 см, уравновешенную тем же буфером. Белок элюируют градиенroM концентрации NaCI от0,0до 1,0 M. Фермент обнаруживается во фракциях, соответствующих 0,3 — 0,4 М NaCI, неспецифическая нуклеазная активность — в области

0.35 — 0,45 М NaCI.. частично перекрываясь с пиком ресктриктазной активности, Колонку уравновешивали РБ, содержащим 5 мМ фосфата калия, Элюирующая система представлена линейным градиентом концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 М. Скорость фракционирования 1,5 мл/ч. Объем промывочного буфера 12 мл, объем градиента 60 мл, объем одной фракции 1 мл (см.фиг,1).

На фиг, 1 обозначены; Н вЂ” оттекающая жидкость П вЂ” промывочный буфер, à — градиент. По оси абсцисс — номера фракций, по оси ординат слева — активность фермента (ед/мл), справа — молярность элюирующего раствора NaCI (М), Облучен препарат R Sso II за 36 ч с удельной активностью 10 тыс,ед/мг белка, однако целевой продукт содержит нуклеазные примеси. Потери активности ферментного препарата составляют 25 .

Пример 2. Фракции градиента с ФЦ

Pl l, содержащие рестриктазную активность, диализуют против РБ. содержащего

10 MM фосфата калия, и проводят аффинную хроматографию на денатурированной ДЕКцеллюлозе, также используя 10 мМ К-фосфатный буфер. Остальные параметры фракционирования аналогичным примеру 1.

R Sso 11 обнаруживается в первых фракциях промывочного буфера, т.е. элюируется 0,0 М

NaCI, пик неспецифических нуклеаз — в области 0,35-0,45 М NaCI. Колонку уравновешивали РБ, содержащим 10 мМ фосфата калия. Элюирующая система и обозначения аналогичны примеру 1 (см.фиг.2). Фракции, обладающие рестриктаэной активностью диализуют против РБ, содержащего 50 глицерина, с целью концентрирования и стабилизации фермента.

3а 30 часов получен препарат R Sso II c удельной активностью 16 тыс, ед/мг белка, полностью свободный от неспецифических эндонуклеазных и экзонуклеазных примесей, и пригодный для любых видов структурных исследований, Потери активности фермента в процессе очистки составляют

20 .

Пример 3. Способ получения R SsO

II включает все названные стадии. При хроматографии на денатурированной ДНК-целлюлозе используют буфер, содержащий 30 мМ фосфата калия. R Sso II и неспецифические нуклеазы обнаруживаются в оттекающей жидкости в виде двух перекрывающихся пиков, Колонку уравновешивали РБ, содержащим 30 мМ фосфата калия. Обозначения те же (см.фиг.3). 3а 26 ч получен препарат R Sso II с удельной активностью 8 тыс. ед/мг белка. Целевой продукт содержит нуклеазные примеси, Потери активности Е SsOII составляет 25 .

Для стандартной процедуры выделения рестриктазы Sso II выбран пример 2, Преимущества предлагаемого способа получения R Ssoll по сравнению с прототипом заключаются в том, что фермент полностью свободен от примесей экзонуклеаз и пригоден для всех видов молекулярно-биологических работ, включая структурные исследования, например. картирование генома.

Препарат R Ssoll хранится при -20 С в течение 12 месяцев (срок наблюдения) без потери активности.

Сравнительные данные по прототипу и предлагаемому способу представлены в таблице, Для доказательства отсутствия примесей экзонуклеаэ в полученном ферментном препарате были использованы два теста: 1) на эффективность лигирования фрагментов

ДHK 2) тест короткими синтетическими мезг чеными P олигонуклеотидами, не имею1822877 структура ДНК при этом не нарушается, что говорит об отсутствии примесей неспецифических эндонуклеаз.

Данные по тестированию нуклеазных примесей в препарате R SsO II представлены на фиг.4 и 5.

Формула изобретения

Способ получения рестриктазы Sso II, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, разрушение клеток ультразвуковой дезинтеграцией, хроматографическую очистку на голубой сефарозе и фосфоцеллюлоэе Pll, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Escherichia coli B 834, несущий плазмиду d 24, активные фракции с фосфоцеллюлозы P II подвергают диализу против 5-30 мМ К-фосфатного буфера и проводят дополнительную аффинную хроматографию на денатурированной ДНК-целлюлозе.

Характеристика препарата R Sso ll. ас- ед/мл

18000

1500

16600

iaido щими сайта узнавания для исследуемого фермента. B случае присутствия экзонуклеаз в исследуемом препарате, при его инкубации с ДНК происходит отщепление 5 концевых нуклеотидов, 4о тестируется на электрофореэе в акриламидном геле.

Результатом первого теста явилась высокая степень лигирования (около 90 ) 10 фрагментов ДНК плазмиды pBR 322, что свидетельствует об отсутствии экзонуклеаэ в исследуемом препарате R Sso II.

Результатом второго теста было наличие лишь одной исходной полосы на автора- 15 диаграмме геля, что свидетельствует об исчерпывающем освобождении ферментов от примесей экзонуклеаэ, Тестирование в препарате R Sso II неспецифических эндонуклеаз осуществляли 20 путем длительной инкубации репликативной формы ДНК фага Х 174, не имеющей сайтов узнавания для R Sso 11, с 10-кратным избытком исследуемого фермента в течение

18 часов при 37 С. Суперспирализованная 25 активность ., нуклеазн. ед/мл пдимесеи

1822877

oooo

50о

+ãß (баб

/3 (I (/

puz3

Фиг Ф

Составитель М, Гусева

Техред М.Моргентал Корректор Е. Папп

Редактор

Заказ 2173 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101