Штамм гриба gliосlаdiuм сатеnulатuм gilмаn. ет аввотт для получения препарата против грибных возбудителей картофеля
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕ НТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ Со GD ,© 1 0 1 С) 4 (21) 4865244/13 (22) 10.09.90 (46) 30.08.93. Бюл. ¹ 32 (71) Институт экспериментальной ботаники им.В.Ф. Купревича и Главный ботанический сад АН СССР (72) Н,А. Дорожкин, Т.П. Алексеева, Ю.М, Плотникова, В,М. Гораль, Н.В, Лаппа, Т.Г. Омельянец, Г.П. Мельник и Г,Т, Архипчук (56) Микология и фитопатология, 1989, т.23, в.2, 167 — 172. Микробиологический журнал, 1988, т.50, ¹ 6, 63 — 67. Acta Phytopath,et Entomologica, 1988, н,23, ¹ 1 — 2, 133 — 135. Авторское свидетельство СССР N 1771639, кл. А 01 N 63/00, 21.05.90. (54) ШТАММ ГРИБА G LlOCLADIUM CATENULATUM GlLMANN ЕТ АВВОТТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГРИБНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биологическому способу защиты растений, и может быть использовано против грибных возбудителей картофеля, Цель изобретения — получение нового штамма Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott В Н И И СХМ-В ИЗ P Д-43, облада ющего широким спектром антагонистической активности по отношению к ряду грибов, возбудителей клубневых гнилей картофеля, а также микопаразитной активностью по отношению к возбудителю фузариоза, вертициллиоза, резиновой гнили. Это достигается тем, что в качестве антагониста грибов, возбудителей клубневых гнилей картофеля используется штамм „5U „„1836907 A l (57) Использование; микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, производство средств защиты растений против возбудителей заболеваний, в частности грибных фито пати феля, Сущность изобретения: штамм Gliocladium catenu1atum Gilmann et, Abbott. ВНИИСХМВИЗР Д-43 культивируют на картофельноглюкозном агаре при 25 С в течение 2 — 3 недель, смывают опоры с агара. Титр биопрепарата 6,5.10 конидий в 1 мл. Норма расхода — 10 мл на 1 кг картофеля. Обработка полученным препаратом клубней картофеля снижает развитие болезни, возбудителем которой является Fusarium Sambucinum, на 81,37 „а препаратом на основе известного штамма Bacillus mycoides лишь на 51,4, 5 табл. Gliocladium catenu1atum Gilmann. et Abbott. 453, депонированный в объединенной коллекции микроорганизмов ВНИИСХМ-ВИЗР 27 апреля 1990 года под регистрационным номером Д-43, выделенный с поверхности клубня сорта Невский с симптомами фузариозной гнили, отобранного в Ленинградской области, Идентифицирование штамма прово- j дилось по определителю 6 V. Subramanian "Hyphomycetes" indian Council of. Agricultural Research. New Delhi, 1971, . р.644. Штамм Gllocladium catenulatum Gilmann е1 Abbott, ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 относится к классу Deutегоmyces, порядку Moniliales, роду Giicladium. 1836907 Ш i BMM имеет следующую характеристику, l. Кул ьтурал ьно-морфологические признаки, На картофельно-глюкоэном arape колония клочковато-пушистая, белая, с оливково-зелеными концентрическими зонами спороношения в центре колонии, Конидиеносцы шероховатые около 100 мкм длиной. Кисточка трехярусная, веточки 15 — 20х4 мкм, метулы 7 — 10х2,5 мкм, фиалиды 10 — 20х2 мкм, Конидии зллипсоидные, 4 — 8х3 — 4 мкм, гладкие, светло-зеленные в длинных слизистых колонках. )линейный рост колонии на агаризованных средах: 1.Íà сусло-агаровой среде — на 5-ый день роста — 21 мм, на 10-ый день — 30 мм, на 20-ый день — 90 мм; 2.На картофельном агаре — на 5-ый день роста — 28 мм, на 10-ый — 44 мм, на 20-ый день — 80 мм; 3,На среде Чапека на 5-ый день роста— 21 мм, на 10-й день — 33,5 мм, на 20-ый день — 63,5 мм; 4.На овсянном агаре на 5-ый день роста — 24,5 мм, на 10-ый день — 43 мм; на 20-ый день — 75,5 мм; 5,На картофельно-глюкозном агаре на 5-ый день роста — ЗО мм, на 10-ый — 45,5 мм, на 20-ый день — 90 мм. Спорообразование гриба на агаризованных средах на 21-ый день роста 1,На сусло-агаровой среде — 6,5х10 ко6 нидий в 1 мл; 2,На агаре Чапека — 7,2х10 конидий в 1 3,На картофельно-глюкозном агаре— 6,5х10 конидий в 1 мл; 4,На картофельном агаре — 4,4x10 конидий в 1мл; 5.На овсяном агаре — 1,2x10 конидий в 1 мл. Спорообразование начинается на 5-ый день роста, максимум спорообразования на 21 день, ll, Физиолого-биохимические свойства, Из источников углерода усваивает глюкозу, галактоэу, сахарозу.мальтозу, фруктоэу, арабиноэу, рамнозу. Хорошо усваивает нитратный, нитритный и аммонийный азот. Растет в широких пределах рН от 2,0 до 9,0, Продукт синтезируемый штаммом не устанавливался. Признаки штамма устойчивые. Штамм периодически пересевается и хранится в пробирках на картофельно-глюкозной среде и сусло-агаровой среде при температуре 20 — 25 С. Штамм G I l oc la dium ca te nu l atum Gilmann. ес Abbott, ВНИИСХМ ВИЗР Д-43 не патогенен для теплокровных животных. Пример 1. Отбор штаммов грибов-антагонистов к возбудителю фузариоэа картофеля Fusarlum sambucinum Fuck. Основным и наиболее опасным патогеном картофеля при хранении является гриб Fusarlum sambuclnum Fuck. В связи с этим "0 отбор грибов-антагонистов проводился к наиболее вирулентному штамму Fusarium sambucinum Fuck. 34 Материалы и методы. Объектами исследования служили гри"5 бы рода Gllocladium, Fusarium, Моп!егеПа, Cladosporium, Verticillium, Penicillium, Tricbocladium, Scopulariopsis, Раес Ilomyces и др„выделенные по общепринятой методике из клубней картофеля из разных обла20 ЗО 55 стей Советского Союза, Всего проанализировано свыше 200 штаммов грибов. Штаммы предполагаемых антагонистов выращивали на картофельно-глюкозно-агаровой среде в течении 20 суток в чашках Петри, затем из образовавшегося газона вырезали блоки 0,5 см в диаметре. Тест-объект F.sambuclnum культивировали на картофель-глюкозном агаре в течение 14 суток. Из выросших культур готовили посевную суспензию с титром 1х10 макронидий в 1 мл. О 1 мл суспензии F,sambucinum высевали газоном на поверхность застывшего картофельно-глюкозного агара в чашках Петри. В центре засеянных тесг-объектом чашек Петри располагали блок с предполагаемым антагонистом. Чашки Петри оставляли при комнатной температуре 22-25 С. Учет результатов опыта проводили на 6-е сутки, Среди исследованных штаммов нами отобраны иэоляты, дающие зону задержки роста тест-культуры рабиусом не менее 10 мм (табл.1). Высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителю фузариоза F.sambucinum обладали грибы рода Glicladium и Paecillomyces, причем в отдельных случаях наблюдалось нарастание колонии антагониста на колонию тест-кул ьтуры, Наибольшей антагонистической активностью по отношению к F.samcinum обладает штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott. Д-43. Пример 2. Для анализа изменения репродуктивной активности F.sambucinum под действием грибов-антагонистов проводили учет количества конидий тест-культуры в зоне ингибиции и в контроле (культура F.sambucinum без антагониста) при помощи камеры Горяева. 1836907 Данные приведены в табл.2. Наибольшее снижение репродуктивной способности F,sambuclnum наблюдалось под действием гриба Gtlocladlum catenulatum Д-43. Пример 3. Микопаразитные свойства Gllocladlum catenulatum Д-43 по отношению к возбудителям клубневых гнилей картофеля. Для изучения микофильных свойств предметные стекла, покрытые тонким слоем картофельно-глюкозного агара, инокулировали одновременно (противоположные стороны) микопаразитом и тест-грибом. Совместные культуры инкубировали в стерильных чашках Петри на влажных фильтрах при температуре 25 С, B качестве тест-культур были взяты: Fusarium sambucinum, Geotrichum candidurn, Verticillium lateritlum. Через 5 — 7 дней препараты окрашивали метиленовой синькой, микроскопировали и проводили исследования с помощью светового микроскопа Leitz, Установлено, что под воздействием Gliocladium catenulatum Д-43 происходит разрушение конидий F.sambucinum, наблюдались случаи обвивания гифой микопаразита гиф Verticillium lateritium u F.sambucinum, их параллельный рост, при этом происходят изменения в цитоплазме гиф тест-культур, их вакуолизация, сужение, разрыв. При помощи сканирующего микроскопа обнаружены контактные органы этого микопараэита, представленные длинными, тонкими ветвями, обвивающие гифу хозяина (тест-культуру), а также специализированные органы — конические апрессории, внедряющиеся в гифу хозяина, разрушая локально его оболочку. Пример 4. Использование штамма Gliocladium catenulatum Д-43 при получении препарата. Для размножения штамм культивировали в пробирках на картофельно-глюкозном или сусловом arape в течение 2 — 3 недель при температуре 25 С. Препарат используют в виде суспензии спор. Для этого в пробирку с культурой гриба добавляют стерильную воду до верхнего уровня среды и встряхивают до образования суспензии. Подсчет конидий в полученной суспензии проводят в счетной камере Горяева, после чего доводят концентрацию до 10 конидий 6 в 1 мл воды. Титр биопрепарата 6,5х10 коб нидий в 1мл. При хранении штамма в холодильнике при температуре 5 — 10 С в пробирках на картофельно-глюкозном агаре пересев требуется раз в год. Приготовленный биопрепарат (суспензия штамма) используется в 35 течении 24 часов. Норма расхода 10 мл на 1 кг картофеля. Пример 5. Использование препарата (штамма) Gliocladlum catenuiatum Д-43 при проверке его антагонистической активности по отношению к Fusarium sambuclnum 34 (табл.3). Исследования проводили путем искусственного заражения клубней картофеля суспензией конидий грибов F,sambuclnum u предполагаемых антагонистов грибов рода Gliocladlum, Инфицировали картофель суспензией конидий в соотношении 1:1. Титр суспензии 1х10 конидий в 1 мл. Г1ромытые. обработанные спиртом и обожженные над спиртовкой клубни повреждали штампом на глубину 10 мм в пуповинной части. В полученные углубления пипеткой вводили до полного наполнения приготовленную суспензию. Для каждого образца брали по 10 клубней. В контрольные образцы с механическими повреждениями вводили стерильную воду совместно с суспензисй гриба F.sambucinum в соотношении 1:1. Клубни укладывали в выстланные фильтровальной бумагой зксикаторы, нижняя часть которых заполнялась стерильной водой. Эксикаторы накрывали крышками и помещали в термастат или помещение с температурой 23 — 25 С и в холодильные камеры с температурой 5 С. Учет загнивания клубней проводили через 10 дней после их продольного разреза через точку механического повреждения. Измеряли диаметр и глубину загнивания, с последующим вычислением площади некроза. Двухфакторный дисперсионный анализ данных по площади некроза картофеля при заражении возбудителем фузариоза совместно с грибами рода Fusarium позволяют говорить о достоверности различий и о более высокой антагонистической активности G.catenuiatum Д-43. Препарат (штамм) G,catenulatum снижает развитие болезни как при высоких температурах, так и при низких (5 С). Пример 6, Использование штамма Gliocladium catenuIatum Д-43 для подавления развития сухой фузариоэной гнили клубней картофеля по сравнени о с Bacillus mycoides (прототип). В табл.4 приведены данные по развитию патологического процесса в клубнях, инфицированных F,sambucinum, при внесении в гриб-суспенэию бактерии Bacillus mycoides 683 (прототип) и предлагаемого штамма Gliociadium catenul turn Д-43. 1836907 Таблица 1 Антагонистическая активность грибов рода ОНос!абйгп и Paecillomyces по отношению к возбудителю фуэариоэа картофеля Fusarium sambucinum Fuck. N 34 in vitro Из результатов опыта следует, что использованием штамма G,catenulatum Д-43 ведет к более значительному снижению развития болезни на 81,3 ф,, при примененйи ВасИШв mycoides эта величина составляет 51 4ф, Пример 7, Антагонистическая активность 6llociadlum catenulatum Д-43 по отношению к грибам возбудителям клубневых гнилей картофеля по сравнению с Bacillus mycoides 133 (прототип), Методика проведения опыта описана, выше, Повторность опыта 6-кратная, Из данных табл.5 видно, что предлагаемый штамм Gliocladium catenulatum Д-43 обладает большим антагонистическим эффектом по отношению к фитопатогенным грибам картофеля. а также более широким спектром действия по сравнению с Bacillus mycoides 133. 5 Таким образом, использование штамма Gliocladium catenulatum Д-43, обладающего антагонистическим и микопаразитным действием в отношении фитопатогенных грибов, позволяет расширить арсенал 10 биологических средств борьбы с возбудителями клубневых гнилей картофеля. Формула изобретения Штамм гриба Gllocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 15 для получения препарата против грибных возбудителей картофеля. 1836907 Таблица 2 Таблица 3 Влияние грибов рода Gliocladium на развитие болезни клубней картофеля сорта Огонек при разных температурах, инфицированных возбудителем фузариоза F.sambucinum 34 1836907 Таблица 4 Развитие болезни, Ва иант опыта 100 Fusarlum sambuclnum (контроль) Bacillus: mycoides + F.sambuclnum Gliocladium catenulatum D-43+ F,sambuclnum 48,6 18,7 Таблица 5 Зона отс тствия оста г иба по а и с, мм Текст-культура В.m соЫез и ототип G.catenulatum -43 15,0+ 2,0 17,0 2,0 18,0 + 1,5 14,0 + 2,0 - Fusarlum sambuclnum Fusarium avenaceum Fusarium culmorum Fusarium solanl 5,0 +1,0 4,0 +1,0 13,0 +. 2,5 5,0 "= 1,0 10,0 +. 2,0 Составитель Н. Дорожкин Техред М.Моргентал Корректор М, Максимишинец Редактор Заказ 2846 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Fusarium solanl var.argiliaceum Fusarium oxysporum Говагium gramenial Fusarlum lateritium Phoma exlgua чаг,exigua Geotrlchum candidum Alternarla alternata Verticilium lateritium Trichocladium asperum Scopulariopsis brevicaulis 25,0+ 0,0 18,7 +1,0 38,8 «-2,0 23,7 + 0,95 40,0 +.0,0 20,2 + 1,6 19,5 2,0 21,0+ 1,0 32,0 "- 2,0 21,0 + 1,0 350 й1 1 21,0 - 0,365 34,3 +0,7 20,04 0,0
