Способ получения химопапаина

 

Использование: биотехнология, может найти применение в клинической практике. Сущность изобретения: сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в буферном растворе - фосфатном или ацетатном с рН между 5-7. Прозрачную надосадочную жидкостьподвергают хроматографической очистке методом гельфильтрации на сефадексе G-25 или сефадексе G-50, содержащие фермент активные фракции собирают и сушат вымораживанием . Получают химопапаин G удельной активностью 51-70 Е.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (! I) (э))э С 12 и 9/50, А 61 К 37/54

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ О (21) 4355835/13 (22) 01.06.88 (46) 30.08,93. Бюл. М 32 . (71) Жиноин Дьедьсер еш Ведьесети Термеке к Дья ра PT (Н О) (72) Ласло Полгар, Йожеф Гаал, Шандор Вираг, Ласло Йожа, Тибор Визкелети, Бенце

Ашбот и Эржебет Фейер (HU) (56) Zangen Е.P., Ваиэ А.К, J.Biol, Cgem. 137, 459 — 460, 1941.

ЕР М 0065395, кл. С 12 N 9/50, опубл. 1982,, {54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМОПАПАИНА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения химопапаина высокой чистоты с высокой

I. специфической активностью из сырого химопапаина посредством гель-хроматографии.

Цель изобретения — ускорение способа и увеличение удельной активности целевого и родукта.

Сущность изобретения заключается в том, что сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в воде или в буферном растворе, прозрачную надосадочную жидкость раствора подвергают гель-хроматографии, и содержащие активный фермент фракции собирают и подвергают сушке вымораживанием. Сырой химопапаин обычно растворяют в фосфатном или ацетатном буферном растворе с величиной рН 5 — 7, который содержит в качестве восстановителя цистеин, меркаптоэтанол или сульфит натрия. В качестве хроматографической колонки обычно находит применение колонка из Сефадекса G-50 (57)Использование: биотехнология, может найти применение в клинической практике.

Сущность изобретения: сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в буферном растворе — фосфатном или аце.татном с р Н между 5 — 7. Прозрачную надосадочную жидкость подвергают хроматографической очистке методом гельфильтрации на сефадексе G-25 или сефадексе G-50, содержащие фермент активные фракции собирают и сушат вымораживанием. Получают химопапаин в удельной активностью 51 — 70Е. или Сефадекса G-25, которую предварительно уравновешивают при помощи буферного раствора или солевого раствора, преимущественно при помощи содержащего цистеин фосфатного буферного раствора. В интересах эффективной хроматографии колонку выбираюттаким образом, чтобы длина относилась к диаметру как 5 — 50:1, предпочтительно как 20:1.

Замораживание проводят при -20 до700С, предпочтительно при -40 С, лед удаляют в вакууме при давлении между 1,333

Рв и 13,33 Ра, предпочтительно 6,666 Ра, известным образом, Дающее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее вещество находится в хроматографическом пике, который следует эа активным ферментом.

Способ по изобретению имеет следующее и реимущество.

Удаление ответственной за вредные побочные действия, дающей с хлористым барием осадок белковой компоненты путем гель-хроматографии дешевле, мягче и в де1838407 сять раз быстрее, чем известные способы.

Поэтому способ по изобретению также значительно пригоднее для осуществления в крупном промышленном масштабе, чем ионообменная хроматография. которая продолжается около.40 ч. 3а это продолжительное время фермент неизбежно повреждается. Гель-хроматография, напротив, может осуществляться в течение 4 часов и дает возможность защищать фермент химическим путем — физиологически безвредными, ионными восстановителями. Так как гель-хроматография имеет более высокую степень разделения, полученный продукт гораздо чище, что — как и следует ожидать — приводит к существенному ослаблению побочных. действий, Способ поясняется чертежом.

Пример 1, 2,5 г сырого химопапаина .. растворяют в 135 мл содержащего 10 мМ цистеинфосфатного буферного раствора (3 мМ.рН 6,5). Если раствор мутный, то его фильтруют. Через 10-30 мин хроматографируют 135 мл раствора на колонке с Сефадексом G-25 (4 х 100 см) с буферным раствором, который содержит 3 ммол фосфата и 1 ммол цистеина и имеет величину рН 6,5, Первый пик (обозначенный на фиг, 2 при помощи А) содержит химопапаин, около

1,3 r. Пик В содержит образующее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее, неактивное вещество.

Находящийся в пике А фермент фильтруют а стерильных условиях и подвергают лиофилизации.

Активность химоппаина в любом случае определяли при насыщении субстратом (сложном бензилоксикарбонилглицин-рнитрофениловом эфире (ZGN) в следующей реакционной смеси;

100,ил приготовленного с ацетонитрилом ZGN-раствора с концентрацией 1 мгlмл, 2,8 мл 0,1 M ацетатного буферного раствора с величиной рН 5,5 который содержит

1 мМ ЕОТа, 100 рл химопапаина.

Для характеристики препаратов указывают ниже измеряемое при 25ОС в течение

1 мин при длине волны 340 нм изменение оптической плотности (экстинкции). которую вызывает 1 мг химопапаина на 1 мл реакционной смеси (Е).

Полученный фермент имеет активность

62 Е.

Пример 2. Работают по описанному в примере 1 методу, но колонка имеет больший диаметр (5 х 100 см). Удельная активность 70 Е, Пример 3, Работают по описанному в примере 1 методу, но применяют короткую колонку (10 х 16 см). Здесь не происходит никакого отделения образующего с хлористым барием осадок вещества от химопапаина. Удельная активность 42 Е, Пример 4. Работают по описаннол1у в примере 1 методу, но примененный для хроматографии буферный раствор не содер10 жит цистеина, удельная активность 51 Е.

Пример 5. Работают по описанному в примере 1 методу, но приготовляют более концентрированный раствор из химопапаина (содержание белка 5ф, — вес/объем. ).

15 Удельная активность 55 Е, П р и. м е р 6, Работают по описанному в примере 1 методу, но выделение производят не при комнатной температуре, а при

2 — 10 С. Удельная активность 65 Е.

20 Пример 7. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо Сефадекса

G-25 применяют Сефадекс G-50. Удельная активность 53 E.

Пример 8, Работают по описанному в примере 1 методу, но концентрация фосфатного буферного раствора составляет не

3 мМ, а 10 мМ. Удельная активность 63 Е.

П р» м е р 9. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо фосфатного

30 буферного раствора с рН 6,5 применяют ацетатный буферный раствор с величиной рН 5,5; Удельная активность 67 Е;

Пример 10. Работают по описанному в примере 1 методу, но буферный раствор

35 содержит не 1 мМ цистеина, а 5 мМ цистеина. Удельная активность 64 Е.:

Пример 11. Работают по описанному в примере 1 методу, но к содержащей активное вещество фракции (пик А) в пересчете

40 на имеющийся белок, добавляют 10 вес. )ь цистеина. Удельная активность 63 Е, Пример 12. Работают по описанному в примере 1 методу, но в качестве восстановителя вместо цистеина применяют сульфит

45 натрия. Удельная активность 60 Е, Пример 13. Работают по описанному в примере 1 методу, но из всех трех хроматографических пиков отбирают пробу по 1 мл обьемом и к каждой пробе добавляют 0,2 мл- н соляной кислоты и 0.2 мл 12 — ного раствора хлористого бария. Осадок образуется только во фракции В.

Пример 14. Активность примененного в качестве эталона препарата химодиактив55 íà 8 (Smith Laboratories ins.. США) измеряют укаэанным в примере 1 методом. Она составляет 28 Е.

Таким образом, испольэова.к":. предложенного способа позволяет F. hler po отделить с помощью гель фи льтрации

1838407

40

Составитель P. Смирнова

Редактор В. Трубченко Техред М, Моргентал Корректор T.Âàøêoâè÷

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ингибирующий компонент (в 10 раз быстрее. чем с помощью ионообменной хроматографии) и получить препарат с более высокой активностью, чем известные (51-70 .

Е вместо 28). 5

Формула изобретения

Способ получения химопа паина, предусматривающий растворение неочищенного папаина в буфере. хроматографическую очистку в присутствии восстанОвителя SH-группы и лиофильную сушку, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа и увеличения удельной активности целевого продукта, растворяют химопапаин в фосфатном или ацетатном буфере с рН

5 — 7, а хроматографическую очистку проводят методом гель-фильтрации на сефадексе

G-25 или сефадексе G-50.