Способ определения биохимических нарушений в рнк-азе l при вирусных и онкологических заболеваниях
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21) 4356183/13 (22) 15.07.88 (31) 074649 (32) 17.07.87 (33) US (46) 30.08.93. Бюл. N. 32 (71) Хем Рисерч, Инк. (US) (72) Вилльям А.Картер (US) (56) Lancet, ч,1, 06,87, р.1286. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В PHK-АЗЕ L ПРИ ВИРУСНЫХ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ В заявке раскрыт новый химический дефект в PHK-азе L, а также способ определения указанного дефекта. Стабильная коррекция дефекта с помощью ds PHK в целом и неспаренных ds PHK в частности ассоциирована как с драматическими клиническими изменениями, такими как возобновление различных опухолей организмом, так и с восстановлением способности широкого спектра ингибировать различные вирусные и грибковые патогены, которые часто беспокоят как раковых больных, так и других индивидуумов в различных группах с высокой степенью риска. Лимфокины имеют ограниченную эффективность при контроле как опухолей человека (Carter et al. 3. Biol. Res. Mod., vol. 4:613, 1985), так и вирусов человека (см. ссылки, приведенные в статье Montefiori а 0 Mitchell, Proc. Natl. head. Sci. U.S., vol. 84, р. 2985, 1987). В попытке усилить их „„Я2„„1838419 А3 (57) Использование: онкология и вирусология. Сущность изобретения: Определяют биохимические нарушения в PHK-азе при вирусных и онкологических заболеваниях путем инкубации 28 S и 18 S РНК-азой 1, содержащейся в цитоплазматическом экстракте мононуклеарных клеток пациента, электрофоретическое разделение фрагментов PHK в полиакриламидном геле с последующим выявлением дефекта в ферменте по наличию зон специфического распределения полученных форограмм и дополнительно обнаруживают новые зоны расщепления в течение нескольких минут после инкубации. 4 ил. активность ученые искали сочетания этих природных полипептидов с другими различными соединениями. 2-5А Синтетаза: например (Rosenblum and Gutterman. Proc. Am. Assoc. Cancer Research, vol. 26, March 1985, page 280), при сочетании интерферона (ИФН) с ds PHK наблюдается "высокая синергитическая антипролиферативная активность" на человеческой меланоме в культуре клеток при суб-эффективных концентрациях ds PHK и ИФН, взятых вместе. Однако, синергизм был "ограничен антипролиферативной антивирусной активностью ИФН", Наблюдалоь повышение в 2-5 олиго А синтетазе при попытке объединения, но признавалось, что "синергические антипролиферативные свойства этого сочетания не могут быть опосредованными через действие на 2,5 А". Напротив, повышенная 2-5 А синтетаза появляется 1838419 20 после ИФН терапии с дним ИФН при лечении вирусной инфекции хронического гепатита В (СНВ) (Furuta е: al. J. Interfегоn Res„ vol. 7, page 111). Однако в общем попытки использовать активность 2-5 А синтетазы в лимфоцитах периферического кровообращения (P B L) в качестве маркера для оценки до какой степени различные опухоли и вирусы являются чувствительными к лимфокинам оказались неудачными. Заявитель полагает, что это является случайностью, потому что 2 5 А синтетаза является только одним из ферментов, биохимического каскада, индуцируемого лимфокинами, и особенно потому, что 2 5 А синтетаза может оказывать антивирусное и противоопухолевое действие через активацию более позднего фермента в пути(ях), заканчивающемся PHK-азой L. Недавнее описание очищенной 2 5 олиго А синтетазы показало, что она является очень нестабильной в присутствии ds PHK (Rovnak and Вате, J. Interfегоn Res., vol. 7, р. 231, 1987). Заявитель обнаружил новую роль ds PHK в отношении коррекции различных нарушений в PHK-азе L, что как также показано заявителем, является терапевтически важным для успешного лечения рака, иммунологических и вирусных заболеваний. PHK-аза L:PHK-аза L в активированном состоянии ассоциирована со специфическим расщеплением вирусной PHK и, по-видимому, оберрантные клеточные PHK ассоциированы с фенотипом злокачественной клетки (неконтролируемая пролиферация), В недавней публикации (Lancet 1987 г„ vol. 1, р. 1286) заявитель описал различные дефекты в PHK-азе L, вторичные к выработке ингибитора НИ (вируса человеческого иммунодефицита) PHK-азы L. Заявитель разработал успешный терапевтический режим, который заключается в графике дозирования ds PHK, который позволяет как при прямом, так и непрямом механизмах действия вытеснять ингибитор НИ из PHК-азы L, приводя в результате к улучшению клинического состояния пациента и снижению нагрузки НИ. Изобретение иллюстрируется следующими рисунками и примерами, На фиг, 1-3 представлены фотографии пластин электрофореза в полиакриламидном геле, показывающие указанное количество треков и полос или зон, соответствующих продуктам расщепления специфического PHK-азой L вдоль каждого трека; нэ фиг. 4 — график из трех частей, 25 55 имеющих отношение к трем различным пациентам, где сравниваются количества белых кровяных клеток (линия, соединяющая кружки) с количеством 2-5 А синтетаэы (линия, соединяющая треугольники) в зависимости от времени лечения. Изобретение включает диагностические процедуры для оценки дефектов и биохимических нарушений в PHK-азе L и может быть использовано для коррекции таких дефектов, с помощью ds PHK, предпочтительно неспаренной ds PHK, назначаемой необязательно до или конкурентно с введением лимфокина, такого как интерферон или интерлейкин. Процедуры определения наличия недостатка характерных продуктов расщепления PHK-азой L в образце крови пациента, в частности в мононуклеарных клетках пациента, и использование наличия и/или времени образования таких продуктов расщепления в качестве маркера для начала лечения с помощью ds PHK также описаны, Терапевтические методы лечения раков, особенно имеющих опухолевые клетки, устойчивые к лечению одним интерфероном, и вирусных состояний, включая заболевания, вызванные членами семейства ретровирусов, также описаны, В ранее цитированной статье из Lancet образцы PHK-азы L от индивидуумов, зараженных НИ, не показывают какой-либо детектируемой биоактивности. В частности "SCP" зоны, т,е. зоны продуктов специфического расщепления, лишены фрагментов РНК, которые показывают, что PHK-аэа L y этих пациентов была эффективно инактивирована ингибитором, В противоположность этому, у здоровых нормальных субъектов in vivo активированную PHK-азу L обнаружить очень легко, Следовательно, отклонение от нормы РНК-азы L в человеческих опухолях ассоциировано с новыми продуктами расщепления (N CP). Новые продукты расщепления (N CP) отличаются от продуктов специфического расщепления (S CP) и идентифицируются человеческими клетками без нормальных механизмов контроля роста клеток и пролиферации вируса. На фиг.1 показана кинетика активности PHK-азы L, полученной иэ периферических лимфоцитов нормального индивидуума, подобно Полосе 2 из указанной выше статьи заявителя (Lancet). Как описано ранее, аналитический метод заключается в измерении активированной РНК-аэы L в цитоплаэматическом экстракте мононуклеарных клеток путем определения способности генериро1838419 55 вать продукты специфического расщепления при инкубации с источником 28 S и 18 S РНК. Примененные процедуры соответствуют описанным К,Kariko and J.Ludwig, Вiochem. Biophysics. Research Communication, vol, 128, 695, 1985 и P/reschner et al, Nucleic Acid Research, vol. 9, 1571, 1981. Рибосомальная РНК получена из HL 929 клеток, которые генетически утратили PHK-азу L. Эти Н929 клетки депонированы в соответствии с Будапештским договором в )коллекции американских типовых культур, Рокквилл, Мэрилэнд, США под номером АТСС ¹ СК L 9659, При наблюдении в течение продолжительного периода времени 1700 минут (около 26 ч) заявитель обнаружил, что PH К-аза L от нормальных индивидуумов в некоторых случаях способна образовать N CP (Полоса 8 на фиг. 1). Отметим, что самая ранняя точка детекции N СР у нормального индивидуума отмечается после многих часов инкубации. Однако N СР видны в течение нескольких минут инкубации PHK-азы L, когда используют лимфоциты от пациентов с лейкемией, Это четко показывает фиг.2, когда клетки от 3 лейкемических пациентов (пациенты А и В с хронической миелогенной лейкемией CML) сравнивают со сравнимыми от нормального индивидуума, пациента С. Отметим, что у пациента с лейкемией (пациенты А и В, фиг.2), S CP никогда не видны, à N CP видны после такой короткой инкубации, как 1-4 мин. Поразительный контраст наблюдается у нормального индивидуума (доброволец, обозначенный С), только S СР ... и нет никаких N CP видны в кинетических образцах, выдержанных до 60 мин. Следовательно, наблюдается ранее недетектируемая биохимическая аномалия, с которой ключевой фермент (PHK-аза L), ассоциированный с механизмами защиты организма против рака, иммунологических и вирусных заболеваний, работает ускоренным и, по-видимому, неконтролируемым образом, В отдельных экспериментах проведено сравнение относительных способностей двух различных клеток (клетки с аномальной PHK-азой L) отклонять вирусное заражение. Было обнаружено, что титры потомства, вирусов были значительно выше у клеток с аномальной активностью PHK-азы L, которая так быстро генерируют N CP. Заявителем продемонстрировано и Описано как двунитевые РНК, особенно не. спаренные, нарушают нормальную кинети5 45 ку PHK-азы и продуктов расщепления и что скорость нарушения функции ds PHK может быть увеличена предварительной экспозицией с лимфокинами. Под "неспаренными ds PHK" понимают те РНК, у которых водородные связи между нитями являются относительно интактными, т.е, прерываются в среднем не менее чем на одной паре оснований в каждых 29 последовательных остатках оснований, Термин "неспаренная ds РНК" следует понимать соответственно. ds PHK могут быть комплексом полиинозината и полицитидилата, содержащим некоторое количество оснований урацила или гуанидина, например, от 1-5 до 1 в 30 таких оснований (поли поли (С4-29х>И или G), АльтЕрнативнО, СООтвЕтСтвующие олигонуклеотиды (маленькие фрагменты нуклеотида) могут быть комплексно связаны с соответствующими комплементарными полинуклеотидами или олигонуклеотидами в определенных условиях, ds PHK могут быть поли поли С, U, в которых отношение С к 0 составляет примерно 13 к 1. а коэффициенты седиментации поли и поли С, U оба менее 9 и в пределах 2 единиц для каждого, и оба предпочтительно около 6,5-7,5. PHK могут иметь общую формулу r In r (С11-14, U)n И СПЕЦИФИЧЕСКИ r in Г(С1г, U)n. Другие подходящие примеры ds PH К описаны ниже. Неспаренные ds PHK, предпочтительные для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поли (Cn, U) и поли (Сл, G). в которых и является целым числом, имеющим величину от 4 до 29, и являются неспаренными аналогами комплексов полирибоцитидилата (гС,), например путем в кл ючен ия 2 -0-метил ри 6озил ьн ых остатков. Эти неспаренные аналоги г in г и, с предпочтительными среди которых являются аналоги общей формулы г in г и, описаны Carter and Ps 0 в патентах США 4 130 641 и 4 024 222. Описанные там ds PHK обычно пригодны для использования в соответствии с настоящим изобретением, Конкретные примеры неспаренных ds PHK для использования в соответствии с изобретением включают; пОли (i) пОли (С4 И) поли (i) поли (С7, И) пОли (!), пОли (С)з, И) пОли (!), пОли (С22, И) поли (!), поли (Сго, G) пОли (!), пОли (С29, G) и поли (!), поли (Ср)236>р, 1838419 Количество введенной неспаренной ds PHK предпочтительно является достаточным для достижения пика концентрации в крови от 0,1 мкг/мл ds PHK до 100 мкг/мл в системном кровообращении сразу после дистального введения от точки инфузии. Три индивидуума, о которых было сообщено ранее, с лейкемией (CML), продемонстрировали новый дефект PHK-азы L.â ассоциации с неконтролируемым ростом у них клеток злокачественной опухоли и значительным клиническим ухудшением (недомогание, потеря веса, неспособность противостоять многочисленным инфекциям) при различных сопутствующих вирусных инфекциях, включая герпес зостер, CMV EBV, герпес симплекс или гепатит. Некоторые пациенты также страдали хроническими грибковыми инфекциями рта. Заявителем оценено как новое биохимическое расстройство, так и разработана схема введения ds PHK, одной или в сочетании с лимфокином, которая эффективно корректирует аномальность PHK-азы L и в результате проводит к значительному клиническому улучшению, характеризующемуся значительным снижением тяжести опухоли и значительным улучшением общей антивирусной и иммунологической защиты как доказательства снижения взаимопротекания вирусных и грибковых инфекций, Лимфокины включают интерфероны (альфа, бета, гамма), предпочтительно интерферон альфа, интерлейкины, особенно интерлейкины (1, 2 или 3) и рекомбинатный интерлейкин-2 (plL-2), и фактор некроза опухоли (ФНО). Также включены активированные лимфокином киллерные клетки (клетки-убийцы) (L АК), образующиеся у животных в ответ на обработку лимфокином. При использовании интерферона (альфа) в качестве лимфокина должно быть обеспечено количество от 0,01 до 100000 МРЕ/мл жидкости тела пациента. Когда лимфокином является IL-2, предпочтительно plL, доза лежит в интервале от примерно 10 IL-2 единиц/кг массы тела г пациента до величины (достигающей неприемлемых уоовней токсичности у такого пациента) 10 IL-2 единиц. Однако наиболее эффективными и допустимыми с точки зрения токсичности величинами являются величины s интервале от примерно 10 до з примерно 10 IL-2 на кг массы тела. При введении обоих агентов, ds РНК и лимфокина, как описано ранее, они могут быть введены в виде смеси или раздельно, но одновременно или последовательно. Введение ds PHK и лимфокина "в сочетании" включает случай, когда оба агента 55 введены вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых оба агента вводят раздельно, но одновременно, например через отдельные внутривенные вливания одному и тому же индивидууму. Введение "в сочетании" также включает отдельное введение одного из лекарств, при котором одно из лекарств дается первым, а затем после короткогQ перерыва — второе. На фиг.3 показан типичный случай биохимического восстановления у 3 пациентов (ТАТК, ДЕГД, ДА(К), сначала подвергнутых действию низкой дозы лимфокина (альфа И Ф Н в дозах 0,5-3,0 миллиона MP Е/4-7 раз в неделю). Каждый пациент весил около б0 кг. Отметим, что в каждом случае введение одного лимфокина было явно недостаточно, чтобы вызвать любое детектируемое улучшение в дефекте PHK-азы. Все пациенты показали только N CP, когда получали только лимфокин. Пациент (ДАМ) имел короткий период ответа на традиционную химиотерапию (гидроксимочевина и т.п.), во время которой его лимфоциты временно вновь приобретают S CP активность; однако его заболевание дает рецидив с превращением из S CP в N СР, ассоциированный во времени с клиническим ухудшением, и он получал лимфокин с измеряемым клиническим или биохимическим улучшением, В каждом случае, в котором затем была введена ds PHK в сочетании с лимфокином, резкое клиническое улучшение и восстановление биохимической нормы PHК-азы L происходило по-видимому одновременно. На рис. 3 показана эффективность неспаре цчой ds РНК г1п г(С11-<4) или АМПЛИГЕНа /торговое название НЕМ Research, Роккевилл, Мэрилэнд, CLUA), даваемой в интервале доз от 40 до 300 мг (вводится внутренно дважды в неделю). Наблюдалось достижение подобных клинических эффектов путем контроля фермента (PHK-азы L) и введением одной неспаренной ds PHK, но при этом требовалось часто в 2-20 раз большее количество, а начало клинического отвеста значительно задерживалось, При сочетании анализа на PHK-азу L u разумного использования неспаренной РНК, одной или в сочетании с лимфокинами, создается возможность стойкого улучшения общего клинического состояния (снижения вирусных и грибковых инфекций), тогда как тяжесть опухоли существенно снижается (как показано на фиг,4, обсуждается ниже). Важно, что теперь имеется возможность вызвать эти значительные клинические изменения на основе стоимость/эффект, а также свести к минимуму, если не устранить, ток1838419 10 сичность для пациента этих реагентов. Таким образом данное изобретение является широко применимым с различными лимфокинами, а также с большим семейством двунитевых РНК, которые без разработанной 5 стратегии могли бы лишь в незначительной степени использоваться в клинике. График на фиг.4 иллюстрирует резкие биохимические и клинические эффекты, достигаемые на 3 пациентах с лейкемией, для 10 которых профили PHK-азы L приведены на фиг. 3. На фиг.4 представлены графики зависимости от времени количества белых кровяных клеток (клетки на кубический миллиметр, представлены соединенными "о"), и 15 активность 2 -5 А синтетазы периферических лимфоцитов (представлены соединенными треугольниками). Для выделения Лимфоцитов для измерения 2-5 А синтетазы приблизительно 1х10 мононуклеарных 20 6 клеток в периферическом кровотоке сначала очищают с помощью стандартной методики Фикло Гипак. Во всех трех случаях прежняя химиотерапия или прежняя терапия лимфокином дала очень ограниченную 25 пользу, как доказывается высоким количеством белых кровяных клеток 0/ BC), например, более 3000 на мм, и низким содержанием 2 -5 А синтетазой, выраженной в наномолях/мг клеточного белка, Од- 30 нако неспаренная ds PHK, добавленная к клеткам, которые сначала были "обработаны" низкой дозой лимфокина, показала конкурентное восстановление в ряде циркулирующих опухолевых клеток (счет W 35 BC), возвращая к нормальному состоянию РНК-аэу L лимфоцита и улучшая общее антивирусное состояние, Клиническая эффективность таких режимов дает необычно большую продолжи- 40 тельность и у некоторых пациентов в конце концов может встретиться строгий клинический критерий "вылечивание". Заявителем оценена эта возможность неарелевантной животной модели, на которой показано не только ингибирование роста опухоли, но повышение выживания (р<0,001) при схеме лечения ds РНК; одной или в сочетании с лимфокинами, исходя из относительного уровня РНК-азы L и оживления всего пути 2-5 А (синтетаза) PHK-азы L также отмечается, что такое лечение увеличивает природную иммуновыживаемость (N К клетки, LAK клетки и т.п.), а также является непосредственно благоприятными для снижения числа жизнеспособных опухолевых клеток, Дополнительные подтверждающие исследования указывают, что эти режимы лечения, а именно, ds P HK, одна или в сочетании с лимфокинами, действительно придают различными опухолевыми клетками большую чувствительность к лизису, даже хотя сами лимфокины обычно не повышают эффективно чувствительности опухолевых клеток-мишеней, как и не дает резкого усиления иммунной функции. Формула изобретения Способ определения биохимических нарушений в РНК-азе L при вирусных и онкологических заболеваниях, предусматривающий инкубацию 28 S и 18 S РНК с PHK-азой 1, содержащейся в цитоплазматическом экстракте мононуклеарных клеток пациента, электрофоретическое разделение фрагментов PHK в полиакриламидном геле и идентификацию дефекта в ферменте по наличию зон специфического распределения на полученных фореграммах, отличающийся тем, что на фореграмме дополнительно выявляют новые зоны расщепления спустя несколько минут после инкубации. 1838419 и ! ° сс.;. ., с "Жс4 ° с.:Ъ I "3;I с»" * 4 ) " ссссс Ъ с» L с (1) 4у . ь с сс CPM 2. 1 Ь„сс i Âßt; ; ьЩу;"-:, Иу. с б, Х . с с.с ":.: 1блбч 19 + + + + + — + + + — — — + + + о ю о ео Фиг. 4 Техред М.Моргентэл 80 100 Редактор Корректор И,Шмакова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 2906 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
