Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ соци листических

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) М I)<>

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ВйЮС 0(.,.:Ьм М9/*- ж(21) 4763976/13 (22) 28,11.89 (31) 200/88 (32) 12.12.88 (33) CU (46) 23,01.93.Бюл.N. 3 (71) МГУ им. М.B.Ëoìoíoñoâa (SU) и Гаванский Университет (CU) (72) Чавес Планес Мария де лос Ангелес, Мартинез Кабрера Илеана, Дельфин Гарсия

Хулиета, Диаз Брито Хоакин, Маркес Брето

Маргарита, Гонзалес Гонзалес Ямиле (CUj

Н.И.Ларионова и H.Ô.Казанская (SU) (56) Winder G., Machleidt Nl.. Pritz M. Methods

Enyrnol. 80, 1981. 816.

Peanasky R.J. Abu — Erreish G.M., Jaush

С.R., Hornandberg G.À,. О.Неегоп D., Llnkenheil R.Ê., Kucich U.. Bayer Symp. V.

Profeinase! nhibitors. 1974, 649, Beress L., 8eress R., Wunderer G., FEBS

Lett, 1975, 50, 311.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к.выделению и очистке полипептидов. обладающих способностью лнгибировать протеазы.

Ингибиторы широко применяются а биотехнологии при выделечии и очистке белков для предотвращения нежелательного действия протеаз. Ингибиторы также применяются при счистке протеолитических ферментов методом аффинной хроматографии, Ингибиторы широко используются в медицине при лечении заболеваний, связанных с дисбалансом системы протеолиза.

Известен способ очистки ингибиторов протеаз (-:етодом аффинной хроматографии с йоследующей ионообменной хооматографией.

Недостатками этого метода являк5тся многоступенчатос-,ь и невысокий выход ин„„5U„„1789525 А1 (51)5 С 07 K 3/02, 15/08 //А 61 K 37/64 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНГИБИТОРОВ

ПРОТЕАЗ ИЗ МОРСКОЙ АНЕМОНЫ (57) Использование: биохимия, а именно .

fl o л уч е н и е и о л и и е и ти д н ы х f l H r и б и то р о в : протеаз, Сущность изобретения: очистка заключается в выделенли ингибиторов из морской анемоны Stoichactis helianthus в сочетании с обработкой трихлоруксусной кислотой с хроматографией На трипсин-се фарозе G — 50, которые позволяют получить три ингибитора протеаз широкого спектра=. действия с удовлетворительной степенью чистоты. 2 табл, Ъ

1 ! гибитора на последней стадии очистки, составляющий 70%, QO

,Q

Ц1 . 3

Наиболее близким к предложенному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ очистки ингибитора протеаз из морской анемоны

Anemonia sulcata, состоящий из гомогенизации животного, экстракции ингибитора 96; этанолом, в проведении ионообменной хроматографии подготовленного экстракта на

СМ-целлюлозе, SP-сефадексе л гельхроматографии на сефадексе G — 50. Выход ингибиторов составляет 49%. Кроме того, этим способом были выделены только ингибиторы сериновых протеаз, активные по отношению к трипсину и химотрипсину.

Целью изобетения является увеличение выхода ингибиторов и обеспечение воз1789525 можности выделения ингибиторов более широкого спектра действия.

Поставленная цель достигается предложенным способом. состоящим в том, что проводят гомогенизацию морской анемочы Stolchactis nelianthus, экстракцию, обработку экстракта раствором трихлоруксусной кислоты до ее конечной концентрации 5-10%, афиинную хроматографию на трипсин-сефарозе в бикарбонатном или трис-HCI буфере 0,01-0,05 M в присутстйии одновалентной соли в концентрации 0,2-0.5М и ионов Са+ 10 — 30 mM, элюируют ингибитор раствором хлористого калия в1 онцентрации 0,5-1 М с рН 1.7 — 2, В качестве одновалентной соли могут быть использованы различные растворимые одновалентные соли, которые служат лишь для создания в растворах ионном силы, раВНОА

0,2 — 0,5. В частности, такими солями могут быть дешевые. доступные и стабильные реагенты. Наиболее часто применяемые в аффинной хроматографии, ",СС КМОз, КВг, МН4МОз, NH4CI, NaCI. МзБг, NaF, КаКОз.

Отличием предлагаемого способа является использование в качестве исходного сырья для получения ингибиторов протеаз морской анемоны Stoichactis ne! Ianthus. обработка экстракта раствором трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации

5 — 10%, осуществление аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе в бикарбонатном йли трис-HCI буфере 0,01-0,05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2 — 0,5М и ионов Са 10 — 30 mM, элюирование ингибитора раствором калия в концентрации 0,5-1М с рН 1,7 — 2.

Использование в качестве исходного сырья морской анемоны Stoichactis

melianthus обеспечивает получение ингибиторов протеаз широкого спектра действия, способных ингибировать три основных типа протеаз: сериновые (трипсин), цистеиновые (бромелаин) и аспартильные (пепсин)., Предлагаемая строгая последовательность стадии очистки; обработка трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 5 — 10%, аффинная хроматография на трипсин-сефарозе в бикарбонатном или трис-HCI буфере 0,01—

0,05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0.2 — 0,5М и ионов Са 10 30 гпМ, элюирование ингибитора раствором хлористого калия в концентрации 0,5 — 1M с рН 1,7-2, обеспечивают повышение выхода ингибиторов до 150 — 200% и получение высокой степени очистки, более 90% активного ингибитора от веса препарата.

Проведение элюирования ингибитора раствор ом KCI с рН<1,7 прив одит ic с яиженйю активности ингибитора из-за его нестабиль-ности в сильно кислой среде, а использова-. ние раствора с рН>2 приводит к уменьшению выхода.

Эта последовательность стадий обеспечивает разрушение комплексов ингибито ров с протеазами на начальном этапе, что дает выход. превышающий 100%, и благо-..., и риятствует эффекти в ному взаимодействию ингибиторов с трипсином и ри проведении аффинной хроматографии на.трипсин-сефарозе. При аффинной хроматографии осуществляют удаление всех других белков, включая токсины,:.; содержащихся в экстракте морской анемоны, и получение ингибиторов в виде одного. пика. В некоторых случаях эта смесь инги---" биторов может быть непосредственно использована, Использование на зт6й стадии системы равновесной элюции, которая сочетает в себе бикарбонатный буфер или трис-HCI от 0,01 до 0,05 М в присутствии--.;, одновалентной соли и ионов Са+ от 10 до 30

mM при рН 8, с последующей заменой элюирующего буфера на кислый раствор с рН

1,7 — 2, содержащий хлористый калий в концентрации 0,5-1М, позволяет получить выход свыше 100%, содержание активных ингибиторсв в препарате 50 — 70% (коммерческий уровень).

Смесь ингибиторов может быть эффективно разделена при однократной гельфильтрации на сефадексе G-50. При этом получают каждый ингибитор в отдельности и используют, если того требует применение, препарат более высокой ингибирующей способности. Использование 5 — 10 % уксусной кислоты в качестве элюэнтдпои хроматографии на сефадексе G-50 влияет

40 на стабильность, эффективное разделение трех ингибиторов и позволяет" проводить прямую лиофилизацию ингибиторов. Выход на этой стадии составляет 90 — 100%. Основной ингибиторный пик имеет мол.мас. 900045 10.000, содержит 93% активного ингибитора от веса препарата (коммерческий уровень), Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами, 50 Пример 1. Цельные тела морской анемоны Staichactis hellanthus разрезают на маленькие кусочки, гомогенизируют в собственной жидкости. при этом происходит экстракция ингибитора, центрифугируют, Супернатанты можно хранить до их последующего использования либо замороженными при -200 С, либо в лиофилизованном виде.

Полученнь;й экстракт обрабатывают трихлорукс:,"сной кислотой (ТХУ) до ее конеч1789525 ной концентрации в смеси, равной 5% .

Осадки, полученные после центрифугирования, промывают ТХУ, Обьединенные супернатанты диализуют в течение 24 ч против буфера. использующегося при аффинной хроматаграфил, причем в начале диализа замену буфера производят через каждый час. Эта обработка позволяет получить выход по ингибирующей активности от 100 до

150% по отношению к начальному экстракту.

Аффинную хроматографию на трипсинсефарозе, содержащей 5-8 мг трипсина на

1 мл геля сефарозы, осуществляют в бикарбонатном или трис-HCi буфере 0,01М в присутствии одновалентной соли 0.2М и ионов

Са 10 mM при рН 7 8 — 8. После элюлрава+г ния первой белковой фракции проводят замену элюирующего буфера на кислый раствор, с рН 1,7. содержащий хлористый калий в концентрации 0,5М. Это дает выход

150% по отношени-о к начальному этапу.

Фракции, содержащие ингибиторную активность, диаллзуют против 5% уксусной кислоты, а затем лиафилизуют. Лиафилизаванный препарзт, содержащий 50% активного ингибитора, растворяют в 5,-нам растворе уксусной кислоты и подвергают гельхроматографии на сефадексе G-50, уравновешенном уксусной кислотой 5%, Гельхроматография позволяет осуществлть разделение трех изаингибиторов различного молекулярного веса. Основной ингибитарный пик с молекулярной массой 9000 получается с выхсдам 90% от общей ингибирующей активности и уровнем активности 93%, Его аминокислотный состав указан в табл. 1.

Пример 2. Выделение и очистка ингибитора из морской анемоны проведены

Формула изобретения

Способ очисткл ингибиторов протеаз из морской анемоны, предусматривающий го-могенизацию тела животного. зкстракцию ингибитаров, хроматографию и гель-хроматографию на сефадексе С-50, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с ц лью повышения выхода ингибиторов и обеспечения возможности выделения ингибиторов более широкого спектра действия, используют мооскую амемону с такой же последовательностью стадии, как и в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве однавалентной соли использовали раствор 0.35М КС!. Выход ингибитора 150%.

5 После проведения гельхроматографии на сефадексе G-50 препарат с м.м. 9000 содержит 93% активного ингибитора от веса препарата. Остальные примеры проведены с такой же последовательностью стадии, что

10 описаны в примере 1.

Результаты примеров приведены в табл. 2.

Ингибиторы протеза, полученные этим способом, имеют функциональные свойст15 ва, не описанные ранее в специализированной литературе, т.е. каждый ингибитор в отдельности может ин гибировать широкий спектр протеалитических ферментов, Из трех очищенных ингибиторов, фракция с

20 мол. массой 9000 и изоэлектрической тачкой

8,4, является основной из-за своей высокой ингибирующей активности против трех ранее упомянутых протеалитических ферментов. Тщательное исследование этого

25 ингибитора показывает следующие его свойства: очень высокая ингибирующая активность по отношению к трипсину и плазмину (+++), высокая ингибирующая активность по отношению к химатрипсину, 30 папаину и бромелаину (++), ингибирующая активность средней силы по отношению к пепсину, химазлну и кислой пратеазе из

Mucor mit.hei (+), слабое лнгибирование эластазы гранулоцитаа (+-), 35 Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипам позволяет получить ингибиторы протеаз с широкой специфичностью с повышением выхода до 150% и содержанием активного вещества окало

40 90%. вида Stoichactis hellanthus, полученный экстракт обрабатывают раствором трихлоруксусной кислоты до ее конечной концентрации 5 — 10%, осуществляют аффинную хроматографию на трипсинсефарозе в 0,01 — 0,05 М бикарбонатном или трис-НС! буфере s присутствии адновалентной соли в концентрации 0,2 — 0,5 M и ионов

+г

Са в концентрации 10 — 30 мМ и элюируют ингибитар раствором хлористого калия B концентрации 00,5-1 M с рН 1,7-2., Таблица1

Аминокислотный состав ингибитора протеаз {м.м 9 кД) Таблица2

Влияние условия обработки и проведения аффинной хроматографии экстракта на результаты очистки

Буфер, М

Выход ингибитора, о

Одновалентная омла

Са

ММ

ТХУ, %

Соль

KCI, M рН

7

5

5

5

5

5

5

5

0,1

0,1

0,1

0,1

0,3

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

KCl

NaCI

N H4CI

КМОз

МНаИОз

МаМОз

KBr

NaF

NH4F

KCI

МаИОз

МН4Вг

МН4С!

NaBr

МН4ИОз

KCI

KCI

KCI

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,35

0.5

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,8

1,0

0,5

0,5

0.5

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,9

2,0

150