Способ очистки @ -ингибитора протеиназ
Область использования: медицина, биология и может быть использовано в промышленном производстве белковых препаратов и медицинских диагностикумов. Сущность способа заключается в последовательном проведении аффинной хроматографии на голубой агарозе, к.овалентной хроматографии-на органортутной агарозе и металл-хелатной хроматографии на иминодиуксуснокислой агарозе, находящейся в медной форме. Способ позволяет существенно повысить выход этого белка при его очистке, из плазмы крови доноров, а также сократить общую продолжительность биотехнологического цикла.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ .СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (21) 4884366/13 (22) 23.11.90 (46) 15.04.93. Бюл. N. 1.4 (71) Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей (72) С.Г.Жабин и Н,А.Зорин (56) Басис В.Ю., Бумялис В-A,В., Котова Т,С. . Очистка альфа-ингибитора протеиназ человека и получение антисыворотки, пригодной . для его иммунохимического определения.— .,Вопросы медицинской химии. — 1987.—
Т, 33, N 1. —.. С. 54 — 59.
Berninger R,W., Talamo R,C. Preparation
of concanavalin А free purified a-1anfitrypsin, Analyticai biochemistry. — 1979.—
Vol. 93. — P. 180-188..
Glanazza Е., Arnand Р; А general method .for fractionation of plasma proteins, Biochem
I, — 1982. -"Чоl. 201". — P, 129 — 136.
Gunzer G.,Hennklch N. Purification of . а1- proteinase Inhibitor by triazine dye
: abblnity chromatography, ion — exchange . - chromatography and gel filtration on fractogel
ТЗК. Jonrnal of Chromatography. — 1984 — Vol.
296, —. Р, 221-229, Сох А.M;, Turner R., Cooper Е.Н.
- Separation and Characterization of
g1ycoproteins 1гопт normal, pregnancy and
inflammatory serg. Journal of chromatography. — 1987..— Vol. 397. — P, 213 — 222.
Kurecki Т, Kress 3 .F., Laskowskl M.
Purification of human plasma a2macroglobulin and а1- proteinase inhibitor
using zine chelate chromatography. Analytical
 iochemlstry. — 1979. — Vol. 99.— P. 415 — 420.
„„5U„„1809387 А1 (я)л 6 01 N 33/53, С 07 К 15/06
2 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ АЛЬФА1-ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ (57) Область использования; медицина, биология и может быть использовано в промышленном производстве белковых препаратов и медицинских диагностикумов.
Сущность способа заключается в последовательном проведении аффинной хроматог- рафии на голубой агарозе, ковалентной хроматографии.на органортутной агарозе и металл-хелатной хроматографии на иминодиуксуснокислой агарозе, находящейся в медной форме. Способ позволяет существенно повысить выход этого белка при его очистке из плазмы крови доноров, а также сократить общую продолжительность био- 3 технологического цикла:
1809387. Изобретение относится к медицине, биологии, а именно к биохимии, и может быть использовано в промышленном производстве белковых препаратов и медицинских див гности кумов..
Целью изобретения явилась разработка высокоэффективного способа очистки ИП из плазмы крови. человека.
Поставленная цель достигается тем, что на этапе очистки плазма крови человека пропускается. через гель голубой агароэы; . фракции, содержащие ИП, собираются и ди..ализуются против буфера. для внесения, за- тем проводится аффинная хроматография на органортутной агарозе, с которой ИП ко. валентно связывается и отделяется в дальнейшем дитиотрейтолом. Окончательная доочистка ИП происходит на медной форме иминодиуксуснокислой агарозы.
Принципиальные отличия предлагаемо" го способа и его новизна состоят в том, чтона! этапе ИП отделяется от большей части сывороточного альбумина, его препарат., в итоге, не содержит другие ингибиторы протеиназ (антитромбин Ш, альфа2-макрогло-. булин, антихимотрипсин), а также ряд других белков плазмы, тогда как потери самого ИП не превышают 5% (3). Ha li этапе очистки молекулы И П, содержащие свободную SH-группу цистеина, высокоселективно связываются со ртутью, находящуюся в составе органортутного сорбента. У большинФ ства других сывороточных протеинов свободные SH-группы в структуре молекулы отсутствуют, Затем дитиотрейтол в достаточно мягких условиях разрывает возникшую ковалентную связь. Поэтому, на этом этапе потери Иfl не превышают 25% (около
5% ИП совершенно не взаимодействуют с органортутной агарозой, следовательно,. при контакте с матрицей теряется только
20% белка). На последнем этапе очистки ИП более прочно связывается с медной формой иминодиуксуснокислой агарозы, чем меркаптоальбумин и другие меркаптопротеины, поэтому на выходе мы имеем иммунохимически чистый белок, à его потери составля от здесь лишь 12%, Таким образом, общие потери ИП в ходе всей очистки не превышают 37,5%, а выход белка равняется 62 5%, что почти в2раза больше,,чем в способе-прототипе. Кроме того, предлагаемый биотехнологический цикл очистки ИП не превышает 3 сут, что более чем в 2 раза короче; «ем в способе-прототипе, По данным зонального электрофореза в градиенте пор полиакриламидного геля. так и электрофореза по методу Лэммли молекулярная масса ИП была 53 КДа, а посторонние белки в его препарате отсутствовали.
При проведении перекрестного иммуноэлектрофореза с полисывороткой против всех белков плазмы крови человека получен единственный иммупреципитат, обладаю5 щий подвижностью альфа1-глобулинов.
Выделенный нами ИП в условиях иммунодиффузии реагировал с моноспецифической антисывороткой против.альфа1-ингйбитора протеинвз фирмы "Sigma" (США). Очищенный нами ИП в эквимолярном с трипсином ("Sigma", США) соотношении подавлял его протеолитическую активность (субстрат азоказеин) на 95%, а амидазную активность (субстрат N-бензоил-DL-аргинил -паранит15 роанилид) более чем на 85%. Эти данные свидетельствуют о значительной нативности полученного нами белка.
Отсутствие подобных способов очистки
ИП, которые обеспечивали бы значитель20 ный выход нативного белка высокой степени чистоты наряду с сокращением продол>кительности всего биотехнологического цикла, свидетельствует о соответст. вии технического, решения критериям
".новизна" и "существен н ые отличия";
Пример 1; 150 мл плазмы крови о человека диализуется в течение против 4 С против 4 литров 0,03 M фосфатного буфера, рН 7,0. Затем диализат пропускается со ско 30 ростью 20 мл/ч через гель голубой агарозы. . (малое предприятие "Эстар", ЭССР), имеющий обьем 400 мл и находящийся в колонке
2,5 см х 100 см. Голубая агароза предварительно уравновешивается указанным выше буфером. Сбор фракций осуществляется коллектором DJAFRACD — 002 (НПО "Диагностикум". г.Львов), объем каждой фракции . 10 мл. Поскольку ИП с голубой агарозой практически не взаимодействует, фракции, его содержащие, относятся к наиболее ранним и выявляются по методу Веремеенко(7), основанному на способности ИП подавлять гидролиз трипсином N-бензоил-DL-аргинил-паранитроанилида (БАПНА). Эти фрак45 ции сливаются и диализуются в течение ночи против 4 литров 0,01 M трис-солянокислого буфера, рН 7,0, содержащего 0,01 М трилона Б, 0,1 M хлористого натрия, 0,1% додецилсульфата натрия. Указанным буфером предварительно уравновешивается хроматографическая колонка 2 см х 20 см, заполненная 50 мл органортутной агарозы (малое предприятие "Эстар", ЭССР). Диали-, зат пропускается через данную колонку со
55 скоростью 2 мл/ч. Отмывка органортутной агарозы проводится исходным уравновешивающим буфером до нулевой оптической плотности (Е = 280 нм). Элюция осуществляется вышеназванным буфером, дополненным 0,01 M дитиотрейтола ("Веапа!", 1809387
Составитель О. Скородумова
Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор И. Шмакова
Редактор В, Трубченко
Заказ 1284 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Венгрия). Сбор белаксодержащих фракций проводится под контролем спектрофотометра (E =280 нм), Эти фракции собирают-. ся и диализуются в течение суток против четырех литров 0,02 М фосфатнаго буфера, рН 8,0, содержащего 1 М хлористого натрия, который служит стартовым буфе- . ром для последующей металл-хелатнай хроматографии. 10 мл иминодиуксуснокислой агарозы (малое предприятие "Эстар", ЭССР) помещают в колонку 2,см х 5 см и гель трансформируют в медь-хелатную форму (медь бивалентна) следующим образом.
Первоначально ан промывается 50 мл 0,05
М раствора трилона Б, приготовленного на основе 0.5 М раствора хлористого натрия,. затем промывается 50 мл дистиллирован. ной воды, затем 50 мл 0,05 М раствора аце. тата меди, После чего следует отмывка 50 мл . дистиллированной воды и уравновешивание геля вышеуказанным стартовым фасфатным буфером. Диализат пропускается через активированный гель со скоростью
10.мл/час. Далее колонку отмывают стартовым буфером до нулевой оптической
Il/loTHocTN, Меркаптоальбумин и другие примесные белки удаляют 0,02 M натрий-. фосфатным буфером, рН 6,0, содержащим
1 М хлористого натрия; После завершения. отмывки геля ИП элюируют 0,02 M буфером йагНРО4 — лимонная кислота, рН 5,0, со. держащим l М хлористого натрия. Следует отметить, что использованные s изобретении матрицы малого предприятия "Эстар". (Тарту, ЭССР) изготовлены по временным . техническим условиям предприятия, которые являются коммерческой тайной.
С целью проверки чистоты ИП проводили электрофорез в градиенте пор полиакриламидного геля, зональный электрофорез
flo методу Лэммли, иммунаэлектрафорез с антисывороткой против всех белков сыворотки крови человека (НИИЭМ, Нижний
Новгород). Во всех этих тестах детектиро20 вался единственный одноцепочечный протеин с молекулярной массой 53 КДа, обладающий альфа -электрофоретической подвижностью глобулинов, Выделенный нами ИП реагировал с моноспецифической ан25 тисывороткой против .альфа -ингибиторов пратеиназ,("S1gma".. США). В функциональных тестах ИП практически полностью подавляя амидазную и протеолитическую активность трипсина (более чем íà 85% и
30 95%, соответственно). Таким образом, нативность и высокая степень очистки препарата ИП доказана.
Пример 2. Выделенный нами ИП мы использовали для иммунизации кроликов.
35 Иммунизацию проводили по стандартным схемам в течение 1 года. Даже после 10 реиммунизаций кролики продуцировали моноспецифичные антитела против рассматриваемого белка, Это еще одно доказа40 тельство высокой степени чистоты и нативности ИП, Формула изобретения г
45 Способ очистки а>-ингибитара протеи. наз из плазмы крови человека с помощью металл-хелатной хроматографии, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью увеличения эффективности очистки, на первом этапе
50 плазму крови подвергают аффинной хроматографии на голубой агарозе при рН 7,0, на . втором этапе осуществляют ковалентную хроматографию на органортутной агарозе в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия, 55 0,01 М трилана Б при рН 7,0. а затем медь (Il) — хелатную хроматографию на иминодиуксуснокислай агаразе в присутствии 1 М хлористого натрия при рН 8,0.
