Гепатопротекторное средство

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5030536/14 (22) 31.03.92 (46) 30.10.93 Бюл йа 39-40 (71) Малое предприятие "Европа" (72) Михалев В.Ю„Чабан RH. Емцов В.И. Лайтаренко Г.В. (73) Малое предприятие "Европа" (54) ГЕПАТО0РОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО (57) Использование: в медицине. а именно в фармакологии, и может быть использовано для печения (В) RU (11) 2001620 С1 (51) 5 А61К35 78 токсического поражения печени. Сущность изобретения: предложено масло из семян тыквы (cucvrbita maxima), обладающее гепатопротекторным действием Технический результат: масло тыквы обладает выраженным гепатопротекторным действием, превосходит универсальный гепатопротекторный препарат эссенциале по степени действия и, являясь пищевым продуктом, не обладает токсичностью. 6 табл.

2001620

Изобретение относится к медицине и фармакологии и может быть использовано для лечения токсического поражения печени.

Известны средства растительного происхождения, обладающие гепатопротекторным действием. Так, например, силибинин — флавоноидное вещество, выделенное из

Silybum marlanum и улучшающее обменные процессы в печени.

Известен также препарат ЛИВ-52, представляющий собой сухой остаток, изготовленный из смеси соков и отваров ряда растений, таких как тысячелистник (Achilea

mlllefollum), растений Сарраг!э splnosa.

Termlnalla Arjuna и др., и используемый при токсических гепатитах.

Однако эти препараты дорогостоящие и труднодоступные. так как требуют использования дефицитного сырья и изготавливаются в основном из растений, не произрастающих на территории нашей страны, и производятся эа рубежом. Кроме того. таблетированная форма затрудняет их использование в опыте на животных.

Наиболее близким по характеру фармакологического действия к заявляемому средству является зссенциале — препарат, содержащий "зссенциальные" фосфолипиды — диглицериновые эфиры холинфосфорной кислоты и ненасыщенные жирные кислоты вместе с витаминами.

Однако и этот препарат производится за границей, что требует для закупки валютных средств.

Известно использование масла из семян Cucurbita (тыквы) в качестве источника пищевого и кормового сырья.

Известна использование семян тыквы и в качестве аиъигельминтного средства.

Сущность изобретения заключается в изыскании нового средства, обладающего повышенным гепатопротекторным действием.

Это достигается использованием масла из семян Cucurbita maxima в качестве средства, обладающего гепатопротекторным действием.

Масло получают известным способом путем выдавливания его из семян тыквы

Волжской серой", Оно представляет собой вязкую жидкость темно-зеленого цвета со специфическим запахом.

Химические поклзатели масла семян тыквы:

Кислотное число, мг КОН нэ 1 г масла 0.88

Цветное число, мг иода 80

О стой по массе, ",l. Следы

Сойер зни 1осфатидов, 0

54,2

0,42

0,36 (28) 0,70

0,05

Содержание неомыляемых веществ, 1,02

Содержание токоферолов, мг

Содержание стеролов, Содержание каротиноидов, мг 7, 0,94

Иэ них: каротины, мгg 0,12 ксантофиллы, мг (, 0,79

Перекисное число, иода (ммоль 02/кг)

Бенэидиновое число, мг коричного альдегида на 1 r масла (вторичные продукты окисления) 0,44

Коэффициент поглощения при 232 нм

Коэффициент поглощения при 270 нм. 0,17

Содержание фенольных соединений, Проба на присутствие микотоксинов (токсичность) Отрицательная

Жирнокислотный состав триглицеридов масла, к сумме кислот: 13,2

Пальмитиновая кислота 13,2

Пальмитолеиновая Следы

30 Стеариновая S,0

Олеиновая 30.0

Ли нолевая 51,6

Арахи новая 0,2

Масло иэ семян Cucurblta maxima no своему химическому составу имеет сложный набор различных биологически активных компонентов, а также ненасыщенных жирных кислот. 8 отличие от других растительных масел соотношение основных

40 биологических компонентов (токоферолов, стеролов, каротиноидов), а также линолевой, олеиновой, пальмитиновой кислот является специфическим по характеру воздействия на клеточные структуры при

45 токсическом гепатите.

Можно предположить, что положительный лечебный эффект масла иэ семян

Cucurbita maxima при токсическом гепатите после острого отравления четыреххлори50 стым углеродом (ЧХУ) обусловлен по всей видимости содержанием в нем токоферолов, а также большим процентным содержанием ненасыщенных жирных кислот, компенсирующих недостаточность их при жировой дистрофии. В основе развития последней при токсическом гепатите лежит быстрая аккумуляция жира за счет мобилизации его в печень иэ жировых депо, снижение расщепления триглицеридов в печени и недостаточность выхода из нее жира в виде

2001620

)3-липопротеидов и жирных кислот в составе фосфолипидов, происшедших вследствие нарушения синтезирующей функции печени, Воздействие отдельных компонентов оказывает лечебный эффект в гораздо меньшей степени (в 1,5 — 2 раза), чем смесь природного происхождения, каковой является масло из семян Cucurblta maxima, которое содержит целый ряд биологически активных компонентов, в том числе ферментов, вызывающих в своей совокупности неожиданно резкое синергитическое действие в случае использования масла в качестве лечебного средства при токсическом гепатите.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением вышеуказанного результата, заключаются в следующем. t

Моделирование токсического гепатита проводили с использованием спеЦифического гепатотропного яда четыреххлорйстого углерода в дозе 620 мг/кг-1/10 ЛД о.

Экспериментальное исследование осуществлено на 240 белых крысах, распределенных на три опытные и одну контрольную группы. На крысах I-й группы изучалась в динамике симптоматика токсического гепатита до благоприятного исхода; 11 группа— это крысы, затравленные ЧХУ, леченные маслом семян тыквы, Масло вводили внутрижелудочно ежедневно, начиная со следующих суток с момента затравки, 2 раза в день из расчета 0.1 мл на 100 г веса животного. III группа — крысы, затравленные

ЧХУ, леченные эссенциале, который вводили внутрибрюшинно в количестве 5 мг фосфолипидов или 0,05 мл раствора на 100 г массы животного.

Все подопытные и контрольные животные наблюдались в течение двух недель и тестировались в сроки 3, 7 и 14 сут. с момента затравки.

Результаты тестирования представлены в табл. 1-6.

Для оценки функционального состояния печени при токсическом гепатите и его лечения использовали наиболее чувствительные при данной патологии биохимические, гистологические и гистохимические методы исследования.

Определяли содержание общего белка в плазме крови унифицированным методом с применением биуретового реактива; соотношение белковых фракций в протеинограмме плазмы крови, полученной методом электрофореза на ацетатцеллюлозе; количество В-липопротеиодов, определяемое методом Бурштейна; содержание общих липидов с применением соответствующего набора химических

5 реактивов Био-тест" Lachema"; активность аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, определяемых методом

Райтмана-Френкеля: активность каталазы по методу М. А.

10 Королюк и совет„ активность альдолазы, регистрируемую методом В, И. Товарницкого и Е, Н. Волуйского в модификации В. А. Ананьева и 8. P.

Обуховой;

15 содержание мочевины в плазме крови с применением соответствующего набора химических реактивов Био-тест "Lachema"; активность холинэстераэы, определяемой унифицированным микрометодом с по20 мощью соответствующего набора химреактивов фирмы "Mercotest": активность щелочной фосфатазы, регистрируемой унифицированным методом с применением набора реактивов Био-тест

25 "Lachema".

Перед гистохимическими исследованиями биоматериал замораживали. Затем в термостате готовили срезы толщиной 10 мкм и определяли ферментную активность

30 лактатдегидрогеназы по методу Гесса, Скарпели, Пирса. сукцинатдегидрогеназы по методу Нахласа, НАДФ вЂ” диафоразы по методу Нахласа, Уокера. Зелигмана, пероксидаэы по методу Робертиса и Гроссо, а35 глицерофосфатдегидрогеназы по методу

Пирса и глюкозо-6-фосфатазы по методу

Вахштейна и Мейзеля, Активность этих энзимов оценивалась на фотоэлектрическом денситометре (ДФЭ-10), а статическая обра40 ботка проводилась с использованием неплраметрического метода — критерия Y

Вилкоксона-Манна-Уинти, Все остальные результаты исследования подвергали статической обработке методом t-критерия Фи45 шера-Стьюдента. Изменения показателей считали достоверными при P < 0,05. При этом статистическая группа животных при биохимическом исследовании составляла не менее 20 крыс, а при патоморфологиче50 ском и гистохимическом — не менее 12 животныхх.

Анализ. проведенный в результате тестирования, позволяет отметить, что через трое суток у всех групп животных наблюда55 лось нарушение функционального состояния печени и было выявлено (табл, 1) резкое повышение активности аспарагиновой (Р<0.001) и аланиновой (Р<0,001) аминотрансфераз. Кроме того, у крыс I-й и I (-й групп

2001620 (56) 1, Машковский М. Д, Лекарственные средства. M.: Медицина, 1984, т, 2, с. 46.

2. Лечебное питание, /Под ред, И, С.

Савощенко, М., 1974, с. 400.

Таблица 1

Показатели функционального состояния печени крыс при токсическом поражении ее четыреххлористым углеродом (3 сут.) Исследуемые пока- Беэ лечения затели и единицы измерения

На оне лечения

Контроль тыквенным масэссенциале лом

Общий белок, г/л

Альбумины, г/л гх1а2-глобулины, г/л

Р-гл обул и н ы, г/л

)глобулины, г/л

Аспарагиновая тра нсаминаэа, ммоль (ч л) 77,94» 3,29

41,12»-3,33

74,9+2,86

34,47 -2.13

75,42 ":3,96

39, 17»-1,85

80,54 «4,09

42,99 "3,24

8,31» 0,94

12.62 -1,25

21.44» 1.95

9,24»0,81

12,49» 1,13

17,40»-1, 14

10,57»-1,43

8,55":2,09

14,61+2.43

9,68»-1,44

12,83 «0,96

19 80»-1 89

4,26+0,26

4,23»-0. 18

3,94":О. 10

2,86»-0,14 зарегистрировано снижение общих липидов в плазме крови, указывающее на нарушение жирового обмена. Активность альдолазы достоверно была снижена (Р<0,01; <0,02; <0,05. соответственно по 5 группам животных).

При гистологическом исследовании через 3 сут, с начала интоксикации у животных всех групп регистрировалась жировая дистрофия печени, однако у части подопытных 10 крыс, леченных тыквенным маслом, она была менее выражена. Сопровождалось это (табл. 2) угнетением в ткани печени гликолитических процессов (лактодегидрогеназы—

ЛДГ и сукцинатдегидрогеназы — СДГ) и по- 15 вышением глюкозо-б-фосфатазы, Биохимические исследования крови на

7 сут. опыта (табл. 3) показали. что токсический гепатит у нелеченных крыс оставался 20

Фрко выраженным в сравнении с леченными группами, причем у крыс II группы регистрировалась нормализация практически всех показателей функционального состояния печени, за исключением лишь общих липи- 25 дов, которые были достоверно снижены (P<0,01), но в меньшей степени, чем у нелеченных крыс и у крыс. леченных эссенциале.

При гистохимическом исследовании печени II группы крыс, леченных тыквенным 30 маслом, была выявлена отличная от III группы тенденция снижения реакции на ЛДГ (на

167 от контроля) (табл. 4).

Таким образом, через 7 сут, после введения ЧХУ в дозе 1/10 ЛД о начинается 35 спонтанное восстановление структуры печени, причем тыквенное масло способствовало практически полной нормализации как . структуры печени, так и функционального ее состояния.

Результаты тестирования, проведенного в конце экспериментального исследования (14 сут. опыта) (табл, 5), являются свидетельством полного восстановления функционального состояния печени подопытных крыс, затравленных ЧХУ и леченных тыквенным маслом. Отмеченное у них повышение уровня Р-липопротеидов в крови, хотя и было достоверным, но не превышало физиолргчиес кого колебания контроля (2 о). Более существенно этот показатель изменялся у нелеченных животных (Р<0,002) и леченных эссенциале (Р<0,001).

Кроме того, у крыс последней подопытной группы зарегистрировано некоторое (в пределах колебаний контроля) снижение общих липидов в плазме крови (Р<0,02). Выявленные изменения протекали на фоне отсутствия каких-либо микроструктурных нарушений изучаемого органа, а также его массы (табл. 6).

Таким образом, масло из семян

CucurbIta maxima обладает выраженным гепатопротекторным действием и может быть использовано при лечении токсического поражения печени.

2001620

Продолжение табл 1

Контроль

На оне лечения

Без лечения

Исследуемые показатели и единицы зссенциале тыквенным маслом измерения

Аланиновая трансаминаэа. ммоль (ч л) Щелочная фосфатаза, ммоль/л

Общие липиды, г/л В-лип оп ротеиды. г/л

Альдолаза, ммоль/л

Каталаза,мкат/л

Холинэстераза, ммоль/л

Мочевина крови, ммоль/л

2.65 +0,18

1,74 "О,07

3,09"=0,18

3,22 ч-0,15

2.48 +0,14

2,16+0,22

2,36+0.12

1,75М,15

2,27 +0,19

1.32 ч-О, 1 1

2 45ч-0 18

1,62+0,11

0.465+.0.058

0,288 =Ю,063

0,268+.0,11

0,230Н),036

0,090 +-0.0076

6.00+0,82

0,120 М,01

6,85 1.05

0,081 0.009

6.13+.0,52

0,080 +0,006

8,35+ 1,3 1

0,92 =Ю,11

О 96 йО 14

0,79 -0,10

0,99+0,11

5,17 0,19

5,93+0,23

5,01 -0.22

4,95+0,26

Та бл и ца 2

Контроль

Без лечения

На оне лечения

Исследуемые ферменты в%к контр. абсол. значен. тыквенным маслом эссен иале в % к конт . в% к конт . абсол. значен абсол. значен

0,048

0,048

0,041

0,045

Пераксидаза

Лактатдегидрогеназа

НАДФ-диафораза

Сукцинэтдегидрогеназа а-Глицерофосфатдегидрогеназа

Глюкозо-6-фосатаза

+17

0,408

0,256

0,342

0,258 — 22

0,316

0,263

0,293

-16

0.235

0,181

0,175 — 17

0,150

0,138 — 23

0,155 0,167

0,161

0.152

+29

0,106 0,137

0,135

+27

0,135

+27

Показатели активности ферментов печени животных контрольной и подопытной групп по данным гистологического исследования (3 сут. с начала интоксикации четыреххлористым углеродом) 2001620

Таблица 3

Показатели функционального состояния печени крыс при токсическом поражении ее четыреххлористым углеродом (7 сут,) На оне лечения

Беэ лечения

Контроль

Исследуемые показатели и единицы измерения тыквенным масэссенциале лом

71,61 «1.67

39,57 «4,06

79,59 «1,07

39.73 «2,12

Общий белок, г/л

Альбумины, г/л а1а2-гл обул и н ы, г/л В-глобулины, г/л у-глобулины, г/л

Аспарагиновая трансаминаза, ммоль (ч л) Аланиновая трансаминаза. ммоль (ч л) Щелочная фосфатаэа, ммоль/Il

Общие липиды, г/л

Р-липопротеиды, г/л

Альдолаза, ммоль/л

Каталаза,мкат/л

Холинзстераза, ммоль/л

Мочевина крови, ммоль/л

76,72+1,67

34 02»-1 95

76,00«1,94

38,52 +«2,42

9,38 1,82

10,75+U,02

17,57»-2,10

9,97Ю,72

10,37«1 24

21,89 »:2,39

5 12й1 10

12,52 «1,55

18,69+:2,10

6,63» 1,01

16,79 1,54

19.42»-1,87

3,88»-0,11

3,96Ю,027

4,55» 0,016

3,76+0,16

2. 19+О,013

2,58Ю,066

1,82+О,023

2,30Ю,05

1,58 »-0,33

1.77»-0,05

1,12Ю,21

1,76+О,12

1,34 «0,26

1,49»-0.40

1,27» 0,43

2,11 «О,08

0.37Ю,008

0.45+0,016

0,35 Ю,007

0.45 Ю,008

0,18» 0,015

7,88»-0 99

0,16" 0,012

8,64 1,67

0,16 «Ю,008

3,61»-0,56

0,21 «О,017

6,77 «2.22

0,58» 0,078

0,88»0,11

3,62 Ю,25

0,60 Ю,10

0,86Ю,14

3,20 »-0,22

3,37Ю,16

3,46"=0,29

Таблица 4

Показатели активности ферментов печени у животных контрольной и подопытных групп по данным гистохимического исследования (7 сут).

Исследуемые ферменты

Контроль Без лечения тыкве а6со знач

Пероксидаза

Лактатдегидрогеназа

НАДФ-диафораза !

Сукцинатдегидро- геназа 1 а-Глицерофосфа тдегидрогеназа

Глюкозо-б фос< атаз»

0.02

0.028

0,27

019

0 14

2 14

0,337

0.220

0,330

0,192

-20

О. 142

0.158

0.252, 0,057

0.122 О 118

9 00

»5

2, 0111

-14

0,105

13

2001620

Таблица 5

Показатели функционального состояния печени крыс при токсическом поражении ее четыреххлористым углеродом и лечении (14 сут.) Контроль

Беэ лечения

На оне лечения

Исследуемые показатели и единицы эссен циале тыквенным маслом измерения

91. 13 «-3,96

46.37 +3,49

96,29 «-2,24

43 43и 97

Общий белок, г/л

Альбумины, г/л

à1à2-глобулин ы, г/л

Р-глобулины, г/л у гл обул и н ы, г/л

Аспарагиновая трансами на за, ммоль (ч л) Аланиновая транс93.31+U 07

42 11+M 46

94,82 «-2,23

43.82++.1,94

7,30 «-1,30

16,28+ 1,87

23,16» 1,59

10,24 «-0,79

17.07 «0,97

25 95«1 59

9,48+О,93

16.66+1,54

22 89«-0 79

10.66+1,23

14.96 +1,32

24,43 «-1,34

2,40+:0,095

2,61 «.О.155

2,48 «-0.10

2.43+.0,053 аминаэа, ммоль (ч л) Щелочная фосфатаза, ммоль/л

Общие липиды, г/л

Р-липопротеиды, г/л

Альдолаза, ммоль/ч л

Каталаэа,мкат/л

Холинэстераза, плазмы ммоль/л

Мочевина крови, ммол ь I ll

1,07+О,058

1,17+0,12

1,04 Ю.061

0.96 «-0,038

1,70 «-0,19

1.88 «-0,22

1,28«-0,73

1,25 «0.077

1,65+0,78

1.51 «0,17

1,63»-0,12

1,56+0,12

0,40«0,046

0,81 +О.088

0 67«-0 12

0,93 «-0,13

0,27":0,015

5,91 «-0.91

0,24 +О.007

6,66 +0.93

0,26":0,008

4,67 «-0.60

0,26"=0,007

6.78+1,34

1,25+0,12

1,05 +0,064

0,99+0,11

0,92 «0,064

4,28 0,31

3,90 «0,24

4,28 +0.26

3,69+0,25

Таблица 6 а

Показатели активности ферментов печени животных контрольной и подопытных групп по данным гистохимического исследования через 14 сут. с начала интоксикации.

2001620

Продолжение табл.6

Формула изобретения

Составитель Л. Чабан

Техред М.Моргентал Корректор М. Куль

Редактор Л. Павлова

Заказ 3140

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Применение масла из семян тыквы

Cucurblta maxima в качестве средства, обладающего гепатопротекторным действием. г