Способ получения пептидов, обладающих антипротеазным, иммуностимулирующим и гипотензивным действием

 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Способ включает измельчение животного сырья, экстракцию его в кислой водной среде, отделение балластных веществ, осаждение пептидов ацетоном при соотношении экстракта и ацетона (1 : 5) - (1 : 7) по объему при температуре 5 - (-5)°С. В качестве сырья используют кутикулу птичьего желудка. Использование предлагаемого способа позволит существенно расширить спектр препаратов физиологического действия, а также сырьевую базу для их получения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения лекарственных препаратов из животного сырья. Препарат, получаемый по предлагаемому способу, может быть использован для регулирования пищеварения за счет действия на панкреатические протеазы, в качестве гипотензивного средства с мягким и продолжительным действием, а также для повышения иммунного статуса организма у людей и сельскохозяйственных животных.

Известны способы получения пептидных препаратов, обладающих антипротеазным действием, из поджелудочной железы, околоушной железы или печени, путем лизиса, когда животное сырье разлагают на пептиды с помощью протеолитических ферментов (папаина, фицина, бромалина) с последующим отделением конечного продукта.

Известен способ получения ингибиторов протеаз из поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС), включающий гомогенизацию, экстракцию в 0,25 н. серной кислоте, отделение осадка, ступенчатое фракционирование сульфатом аммония, выдерживание в течение 2 сут, доведение рН до 3,0, ступенчатое фракционирование сульфатом аммония, отделение осадка, растворение его в боратном буфере рН 8,0 с добавлением сернокислого магния, обработка 2,5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, осаждение при рН 3,0 в насыщенном растворе сульфата магния, отделение надосадочной жидкости, осаждение примесей в ТХУ, отделение фильтрата, нагревание до 80^оС, кристаллизация в среде насыщенного сульфата магния. Выход составляет 0,008% по массе при активности около 40 ингибиторных единиц (ИЕ)/мл. Недостатком способа является многостадийность и малый выход.

Наиболее близким техническим решением является способ получения пептида, обладающего антипротеазной активностью, который включает следующие операции: гомогенизация; экстракция этиловым спиртом при кислом рН; отделение балластных белков фильтрованием; удаление экстракта перегонкой; добавление 15%-ного хлористого натрия для удаления инсулина; отделение фильтрата; адсорбционное осаждение пептидов на Hylfo-Super-Gel в среде 31%-ного хлористого натрия; отделение осадка фильтрованием; экстракция пептидов из осадка водой;
высаливание белковых компонентов 60%-ным сернокислым аммонием;
отделение осадка центрифугированием;
растворение осадка в 0,01 н.уксусной кислоте;
обессолинование на колонке с сефадексом С-50;
лиофилизация;
растворение сухого вещества в 0,0005М уксусной кислоте;
хроматография на колонке с КМ-целлюлозой;
лиофилизация фракцией, элюированных 0,05 М уксусной кислотой.

Выход полипептидов, обладающих ингибиторной активностью 12 ИЕ из 1 кг исходного материала с удельной активностью 2,5-2,8 ИЕ/мг.

Недостатком способа являются его многостадийность, низкий выход и малая ингибиторная активность, кроме того, препарат не обладает иммуностимулирующим и гипотензивным действиями.

Задача, решаемая изобретением: получение полипептида, обладающего более широким спектром действия: антипротеазным, а также гипотензивным и иммуностимулирующим действиями; повышение ингибиторной активности; расширение сырьевой базы для получения физиологически активных веществ и упрощение способа получения.

В предлагаемом способе в качестве сырья используют кутикулу птичьего желудка, которую гомогенизируют, экстракцию проводят в водной среде при рН 3,5-4,5, выдерживают в течение 20-28 ч для прохождения полноты экстракции, отделяют надосадочную жидкость, которую обрабатывают ацетоном при соотношении надосадочной жидкости и ацетона (1:5) (1:7) (по объему) при температуре 5 (-5)^оС, отделяют осадок, высушивают его на воздухе, растворяют в воде, отделяют осадок во вторичном экстракте и высушивают надосадочную жидкость.

Выход целевого продукта составляет 0,6-2% от массы исходного сырья.

Антипротеазная активность составляет 14,7-16,4 ингибиторных единицы (ИЕ)/мг массы, индекс иммуностимуляции по тесту Ерне 2-2,4, имеет выраженное гипотензивное действие, вызывает снижение артериального давления на 30% от исходного.

П р и м е р 1. 0,6 кг высушенной кутикулы куриного желудка измельчают, добавляют 3,1 л воды, подкисляют уксусной кислотой до рН 3,5, оставляют при периодическом перемешивании на 28 ч. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирают и заливают 6 ч. ацетона при температуре 5^оС, выдерживают 18 ч и отделяют осадок декантацией и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, собирают осадок, растворяют его в дистиллированной воде, отделяют осадок во вторичном экстракте и высушивают надосадочную жидкость. Выход препарата 0,013 кг (2%).

Конечный продукт представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде при кислом рН. Ингибиторная активность 14,7 ИЕ/мг. Индекс иммуностимуляции 2,4. Снижение артериального давления на 50 мм рт.ст.

П р и м е р 2. 0,25 кг замороженной кутикулы утиного желудка измельчают, выдерживают в 1,25 л воды, подкисленной уксусной кислотой (рН 3,5), при периодическом перемешивании 22 ч. Затем гомогенат центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость собирают и заливают 6 ч. охлажденного до 3^оС ацетона. Выдерживают смесь 16 ч и отделяют осадок частичной декандацией и центрифугированием в течение 5 мин при 2000 об/мин. Осадок собирают и высушивают на фильтре. Растворяют осадок в дистиллированной воде (0,25 л), непрерывно перемешивают в течение 3 ч. Отделяют осадок центрифугированием. Лиофилизируют во флаконах или кюветах.

Выход препарата 0,0015 кг (0,6%). Ингибиторная активность 16,4 ИЕ/мг массы. Снижение артериального давления на 46 мм рт.ст. Индекс иммуностимуляции 1,8.

П р и м е р 3. Выделение пептидов проводили как и в примере 1, но в качестве сырья используют кутикулу гусиного желудка.

Выход конечного продукта 1,2% Ингибиторная активность 14,7 ИЕ/мг. Индекс иммуностимуляции 2,0. Снижение артериального давления на 46 мм рт.ст.

Изучение физико-химического состава проводили с помощью гель-фильтрации и аминокислотного анализа. В состав препарата входят пептиды мол. м. от 13.000 Да до 1.000 Да.

При гель-фильтрации на сорбенте "Toya-PerL-55" (Япония) установлено значительное преобладание пептидного компонента мол.м. 5900 Да. Остальные компоненты представлены следовыми количествами. Молекулярная масса полученного ингибитора близка известным для низкомолекулярных белковых ингибиторов из животных тюленей, а также прототипу (6500 Да).

Ингибиторную способность препарата оценивали по способности тормозить активность трипсина из поджелудочной железы КРС производства "Sigma" США, определяемой на сорбенте ВАЕЕ (Nα -бензоил-L-аргинин этиловый эфир).

1 единица (Е) активности трипсина равна увеличению оптической плотности при λ=253 нм 0,001 в мин при гидролизе ВАЕЕ при рН 8,0 и 25^оС. За 1 единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое его количество, которое способно подавлять активность 1 Е трипсина.

Гипотензивное действие препарата, т.е. способность снижать артериальное давление (АД), определяли на домашних кошках. При внутривенном введении препарата в дозе 10 мг/кг (0,04 от АД₅₀). Максимальная степень снижения АD составляет 46-50 мм рт.ст. или около 30% достигается на 15-й мин после введения, затем возвращается в норму через 6 ч и более.

Иммуностимулирующее действие препарата оценивали на мышах линии СВА, вводя им подкожно препарат в дозе 1 мкг на 1 мышь за сутки до иммунизации их эритроцитами барана. Животным контрольной группы вводили 0,1 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Тестируемые препараты увеличивали число антителообразующих клеток в селезенке мышей (тест Ерне) в 1,8-2,4 раза.

Кутикула птичьего желудка составляет около 0,4% от массы птицы и около 3% от массы внутренностей. При заготовке и обработке субпродуктов, в частности желудков, кутикула может быть заготовлена в промышленных масштабах. Одна работница за смену заготавливает 5-10 кг кутикулы.

Использование предлагаемого способа получения пептидов позволяет существенно расширить спектр физиологического действия препаратов и сырьевой базы для их получения.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИПРОТЕАЗНЫМ, ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ И ГИПОТЕНЗИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, включающий гомогенизацию сырья, обработку экстрагентом в кислой среде, отделение балластных веществ, осаждение пептидов, отделение осадка, экстракцию водой и высушивание конечного продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют кутикулу птичьего желудка, в качестве экстрагента воду, а осаждение пептидов проводят ацетоном при объемном соотношении экстракт ацетон 1 5 7 при 5 -5^oС.