Пептид, обладающий защитным действием против ящура штамма a 22

 

Назначение: в сельском хозяйстве для создания противоящурной (штамм A₂₂ ) вакцины. Сущность изобретения: пептид ( α e -ди-Palm) -Lys-Tyr-Ser-Ala -Gly-Met-Gly-Arg-Arg -Gly-Asr -Leu-Gly-Pro -Leu-Ala-Arg -Val-Ala-Ala -Gly-Leu-Pro получен твердофазным методом с использованием 4 -оксиметил-фенацета мидометил сополимера стирола с 1 дивинилбензола, конденсацию осуществляют при помощи дециклогексилкарб одиимида с добавкой 1-оксибен зотриазола либо методом n-нитрофериловых эфиров. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют жидкий фтористый водород с добавкой диметилсульфида и n-крезола. Пептид практически нетоксичен и полностью защищает лабораторных животных от заражения ящуром штамма A₂₂ в дозе 10 мкг на морскую свинку. 1 табл.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно, к пептиду формулы 135 (α, ε-ди-Palm)LysTyrSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAspLeuGluProLeuAla 159 AlaArgValAlaAlaGlnLeuPro. Заявляемый пептид обладает защитным действием против вируса ящура штамма А₂₂ и может быть использован для создания синтетической противоящурной вакцины.

Известны синтетические пептиды формул: 144 LeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLys ValAlaArgThrLeu 159 (I) 141 ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeu AlaGlnLysValAlaArgThrLeuPro 160 (II) 200 ArgHisLysGlnLusIleValAlaProValLysGlnThr Leu 213 (III) проявляющие защитное действие против вируса ящура штамма О₁К в виде конъюгата с белком-носителем (1, 2). Синтетические пептиды, включающие фрагменты последовательности 141-158 и 200-213 белка VP₁ вируса ящура следующих формул: (200-213) ProProSer- (141-158) -ProCysGly (lV) CysCys(200-213)- ProProSer-(141-158)- ProCysGly (V), вызывают защиту от ящура штамма О₁К без конъюгации с белком-носителем (3, 4).

Показано, что иммунизация синтетическими пептидами последовательности белка VP₁ вируса ящура О₁К не приводит к образованию антител, нейтрализующих вирус серотипа А. Следовательно, синтетические пептиды I-V последовательности VP₁ вируса ящура О₁К не должны обладать защитным эффектом при заражении вирусом штамма А₂₂, эндемичного на территории СНГ.

Однако для проявления пептидом VI защитных свойств необходима двукратная иммунизация, причем доза каждой иммунизации составляет 200 мкг в расчете на морскую свинку.

Целью настоящего изобретения является поиск в ряду пептидов новых соединений, малотоксичных и обладающих более высокой активностью против вируса ящура штамма А₂₂.

Поставленная цель достигается заявляемым пептидом формулы (α, ε-ди- 135 Palm)LysTyrSerAlaGlyGlyMetGlyArgArg- GlyAspLeuGluProLeuAlaAlaArgValAlaAla- 159 GlnLeuPro. Предлагаемый пептид длиннее описанного выше 24-членного пептида (VI) на один остаток лизина с присоединенными к нему по α и ε -положениям двумя остатками пальмитиновой кислоты и вызывает 100% защиту лабораторных животных, в отличие от пептида VI, при однократной иммунизации в дозе 10 мкг в расчете на морскую свинку. Пептид 136-159 (VI) в этих условиях неактивен.

Известен также пептид, включающий фрагмент последовательности 135-154 белка VP₁ вируса ящура, в котором к N-концевому аминокислотному остатку присоединена конструкция, содержащая три остатка пальмитиновой кислоты: Palm₃CysSerSer-(135-154) (VII) и который вызывает защиту от ящура штамма О₁К без конъюгации с белком носителем (5). Однако доза этого пептида, необходимая для защиты, составляет 500 мкг на морскую свинку, что в 50 раз больше, чем доза заявляемого пептида. Кроме того, заявляемый пептид отличается от пептида VII более простым строением липофильной части.

Таким образом, заявляемый пептид эффективнее известных ранее пептидов VI и VII в 40-50 раз.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием 4-оксиметилфенацетамидометил сополимера стирола с 1% дивинилбензола. Конденсации осуществляют при помощи дициклогексилкарбодиимида с добавкой 1-оксибензотриазола либо методом п-нитрофениловых эфиров. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования использовали жидкий фтористый водород с добавкой диметилсульфида и п-крезола.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждали данными аминокислотного анализа, масс-спектра, а также косвенно отсутствием N-концевых аминогрупп.

П р и м е р 1. Получение 4-(Вос-пролилоксиметил)-фенацетамидометил сополимера стирола с1% дивинилбензола (BocPro-P).

а) Получение п-бромметилфенилуксусной кислоты.

30 г (0,2 моль) п-толилуксусной кислоты растворяют в 400 мл CCl₄ и кипятят с обратным холодильником в двугорлой колбе. В течение 2 ч добавляют 14,5 мл (0,56 моль) Br₂ в 150 мл CCl₄ при освещении (150 Вт) лампой. После прекращения выделения паров HBr реакционную смесь охлаждают, осадок отфильтровывают и промываютCCl₄ (2 х 200 мл). Продукт перекристаллизовывают из смеси 2 л горячего бензола и 300 мл гексана. Выход 23,4 г (51%). Т.пл. 177-178^оС.

б) Получение фенацилового эфира 4-бромметилфенилуксусной кислоты.

3,0 г (0,013 моль) п-бромметилфенилуксусной кислоты добавляют порциями к раствору 2,6 г (0,013 моль) бромацетофенона, содержащему суспензию 3,7 г (0,39 моля) KF^.2H₂O в ацетонитриле при интенсивном перемешивании. Через 0,5 ч раствор декантируют и добавляют к нему 50 мл эфира и 50 мл воды. Органический слой промывают водой (2 х 50 мл), сушат над безводным Na₂SO₄, упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из смеси хлористый метилен гексан. Выход 2,6 г (57%). Т.пл. 87-88^оС.

в) Получение фенацилового эфира 4-(Вос-пролилоксиметил) фенилуксусной кислоты.

К раствору 3,5 г (10 ммоль) фенацилового эфира 4-бромметилфенилуксусной кислоты и 2,37 г (11 ммоль BocPro в ацетонитриле добавляют при перемешивании 2,1 г (22 ммоль) KF^.2H₂O. Через 24 ч неорганические соли отфильтровывают, к раствору добавляют 120 мл этилацетата и 120 мл воды. Органический слой промывают водой, 5%-ным раствором NaHCO₃, водой, высушивают над безводным Na₂SO₄ и упаривают. Выход 4,7 г (98%).

г) Получение 4-(Вос-пролилоксиметил)фенилуксусной кислоты.

2, г (6,0 ммоль) фенацилового эфира 4-(Вос-пролилоксиметил)- феноксиуксусной кислоты растворяют в 50 мл 85%-ной уксусной кислоты. При перемешивании добавлдяют 13,1 г (200 ммоль) порошка Zn. Через 6 ч реакционную смесь отфильтровывают, добавляют 200 мл этилацетата и 200 мл воды, водный слой титруют до рН 1-1,5 2н. H₂SO₄. перемешивают, органический слой промывают водой (8 х 300 мл), сушат над безводным Na₂SO₄ и упаривают. Остаток кристаллизуют из смеси этилацетат-гексан. Выход 1,8 г (80%).

д) Получение 4-(Вос-пролилоксиметил)фенацетамидометил сополимера стирола с 1% дивенилбензола (BocPro-P) (1).

1 г (2,7 ммоль) 4-(Вос-пролилоксиметил)феноксиуксусной кислоты растворяют в 15 мл CH₂Cl₂ и добавляют к 2 г аминометилсополимера стирола с 1% дивинилбензола. Через 10 мин добавляют раствор 0,56 г (2,7 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл СH₂Cl₂ и добавляют к 2 г аминометилсополимера стирола с 1% дивинилбензола. Через 10 мин добавляют раствор 0,56 г (2,7 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл CH₂Cl₂ и перемешивают 24 ч. Полученный BocPro-P промывают CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), диметилформамидом (3 х 30 мл), этанолом (3 х 30 мл), эфиром (2 х 20 мл) и высушивают в вакууме. Остаточные аминогруппы ацилируют смесью 15 мл пиридина и 15 мл Ас₂О в течение 1,5 ч. Промывки повторяют. Содержание BocPro составляет 0,3 ммоль на 1 г полимера.

П р и м е р 2. Получение BocLeuPro-P (II).

а) 2 г BocPro-P (I) обрабатывают 1 мин 30 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в CH₂Cl₂, затем обработку повторяют в течение 30 мин. Полимер промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл), эфиром (2 х 30 мл), 5% диизопропилэтиламином в CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл), эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,43 г (1,8 ммоль) BocLeu добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденного до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин. CH₂Cl₂ (3 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл).

П р и м е р 3. Получение BocGlnLeuPro- P(III).

BocLeuPrP-A (II) обрабатывают, как описано в примере 2 пункт а. Затем к пептидилполимеру добавляют 0,66 г (1,8 ммоль) BocGlnONp и 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 15 мл диметилформамида и перемешивают 3 ч. Промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂(3 х 30 мл)и этанолом (3 х 30 мл).

П р и м е р 4. Получение BocAlaGlnLeuPto-P (IV).

а) Boc-пептидилполимер (III) обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂C_l2 в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в СH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,34 г (1,8 ммоль) BocAla добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CН₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер IV.

П р и м е р 5. Получение BocValAlaGlnLeuPrо-P (V)
а) Вос-пептидилполимер (IV) обрабатывают 30 мл 50% раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,39 г (1,8 ммоль) BocVal добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оC. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промываю по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер (V).

П о и м е р 6. Получение BocArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-p (VI).

а( Вос-пептидилполимер (V) обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,77 г (1,8 ммоль) BocArg(Tos) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер (VI).

П р и м е р 7. Получение BocAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (VII).

а) Вос-пептидилполимер (VI) обрабатывают 30 мл 50% раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,34 г (1,8 ммоль) BocAla добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CJ₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 моль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер VII.

П р и м е р 8. Получение BocAlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (VIII).

а) Вос-пептидилполимер VII обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,34 г (1,8 ммоль) BocAla добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (3 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер VIII.

П р и м е р 9. Получение BocLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (IX).

а) Вос-пептидилполимер VIII обрабатываю 30 мл 50%-ного раствор TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,42 г (1,8 ммоль) BocLeu добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин СH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XI.

П р и м е р 10. Получение BocProLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (X).

а) Вос-пептидилполимер IX обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина c CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,39 г (1,8 ммоль) BocPro добавляют к раствору 0,24 г )1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пепидилполимер Х.

П р и м е р 11. Получение BocGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg(Tos)- ValAlaGlnLeuPro-P (XI).

а) Boc-пептидилполимер Х обрабатывают 30 мл 50%ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,58 г (1,8 ммоль) BocGlu(OBzl) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XI.

П р и м е р 12. Получение BocLeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg(Tos)- ValAlaGlnLeuPto-P (XII).

а) Вос пептидилполимер XI обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,42 г (1,8 ммоль) BocLeu добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяю еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XII.

П р и м е р 13. Получение BocAsp(OBzl)leuGlu(OBzl)ProLeuAla- AlaArg(Tos)ValAkaGlnLeuPro-p (XIII).

а) Вос-пептидилполимер XII обрабатывают 30 мл 50% раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,58 г (1,8 ммоль) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептилиполимер XIII.

П р и м е р 14. Получение BocGlyAsp(OBzl)LeuGlu(OBzl)ProLeu- AlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XIV).

а) Вос-пептидилполимер XIII обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 3, мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,32 г (1,8 ммоль) BocGly добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XIV.

П р и м е р 15. Получение BocArg(Tos)GlyAsp(OBzl)LeuGlu(OBzl) ProLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XV).

а) Вос-пептидилполимер XIV обрабатывают 30 мл 50% раствора ТЕА в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,77 г (1,8 ммоль) BocArg(Tos) добавляют к раствору 0,24 н (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CН₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилдполимер XV.

П р и м е р 16. Получение BocArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)LeuGlu- (OBzl)ProLeuAlaAlaArg (Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XVI).

а) Вос-пептидилполимер XV обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора RFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром ( 2 х 30 мл).

б) 0,77 г (1,8 ммоль) BocArg(Tos) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XVI.

П р и м е р 17. Получение BocGlyArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)- LeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGln- LeuPro-P (XVII).

а) Вос-пептидилполимер XVI обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в СH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл, этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,32 г (1,8 ммоль) BocGly добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1;1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XVII.

П р и м е р 18. Получение BocMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)- LeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGln- LeuPto-P (XVIII).

а) Вос-пептидилполимер XVII обрабатывают 30 мл 50% раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают СH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,45 г (1,8 ммоль) BocMet добавляют к раствору 0,24 н (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 3 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XVIII.

П р и м е р 19. Получение BocGlyMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp- (OBzl)LeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg(Tos)Val- AlaGlnLeuPro-P (XIX).

а) Вос-пептидилполимер XVIII обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора ТFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают СH₂Сl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в СH₂Cl₂ (2 х 20 мл), СH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,32 г (1,8 ммоль) BocGly добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (3 х 30 мл) и эфиром ( 2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XIX.

П р и м е р 20. Получение BocGlyGlyMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)- GlyAsp(OBzl)LeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg-(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XX).

а) Вос-пептидилполимер XIX обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промываю CH₂Cl2 (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂(2 х 20 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,32 г (1,8 ммоль) BocGly добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Сl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин СH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получаю пепидилпоплимер ХХ.

П р и м е р 21. Получение BocAlaGlyGlyMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)- GlyAsp(OBzl)LeuGlu(OBzl)ProLeuAlaAlaArg-(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XXI).

а) Вос-пептидилполимер XX обрабатывают 30 мл 50% раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 320 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂( 2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,34 г (1,8 ммоль) BocAla добавляют к раствору 0,24 г (1,8 моль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровываю и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин СH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XXI.

П р и м е р 22. BocSer(OBzl)AlaGlyGlyMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)- GlyAspOBzl)LeuGlu(OBzl(ProLeuAlaAlaArg- (Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XXII).

а) Вос-пептидилполимер XXI обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают СH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,53 г (1,8 ммоль) BocSer(OBzl) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилиполимер XXII.

П р и м е р 23. Получение BocTyr(OBzl)Ser(OBzl)AlaGlyGlyMetGly- Arg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)LeuGku(OBzl)- ProLeuAlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XXIII).

а)Вос-пептидилполимер XXII обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CН₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептилидполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в СH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,67 г (1,8 ммоль) BocTyr(OBzl) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл СH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидиполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 ч смесью пиридин-уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XXIII.

П р и м е р 24. Получение BocLysTyr(OBzl)Ser(OBzl)AlaGlyGly- MetGlyArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)LeuGlu-(OBzl)ProLeuAlaAlaArg- (Tos)ValAlaGlnLeuPro-P (XXIV).

а) Вос-пептидилполимер XXIII обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CH₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в СH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл).

б) 0,59 г (1,8 ммоль) BocLys(Boc) добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотриазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин СH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки поворяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридинуксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XXIV.

П р и м е р 25. Получение (α, ε-ди-Palm)LysTyr(OBzl)Ser(OBzl)- AlaGlyGlyMetGlyArg(Tos)Arg(Tos)GlyAsp- (OBzl)LeuGlu(OBzl)ProLeu- AlaAlaArg(Tos)ValAlaGlnLeuPro-Р (XXV)
а) Вос-пептидилполимер XXIV обрабатывают 30 мл 50%-ного раствора TFA в CН₂Cl₂ в течение 30 мин, затем пептидилполимер промывают CH₂Cl₂ (5 х 30 мл), 5% -ным раствором диизопропилэтиламина в CH₂Cl₂ (2 х 20 мл), CH₂Cl₂ (2 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл),
б) 0,46 г (1,8 ммоль) CH₃(CH₂)₁₄COOH добавляют к раствору 0,24 г (1,8 ммоль) 1-оксибензотиазола в 8 мл CH₂Cl₂ и 2 мл диметилформамида, охлажденному до 0^оС. Через 5 мин добавляют раствор 0,37 г (1,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Через 10 мин осадок отфильтровывают и раствор приливают к пептидилполимеру. Перемешивают 2 ч и промывают по 2 мин CH₂Cl₂ (3 х 30 мл), этанолом (2 х 30 мл) и эфиром (2 х 30 мл). Конденсацию и промывки повторяют еще раз. Пептидилполимер обрабатывают в течение 2 час смесью пиридин уксусная кислота хлористый метилен (1:1:3), а затем промывают по 2 мин СH₂Cl₂ (2 х 30 мл) и этанолом (3 х 30 мл). Получают пептидилполимер XXV.

П р и м е р 26. Получение целевого продукта.

(α, ε-ди-Palm)LysTyrSerAlaGlyGlyMetGly- ArgArgGlyAspLeuGluProLeuAlaAlaArgValAla- AlaGlnLeuPro (XXIV).

500 г пептидилполимера XXV обрабатывают 10 мл смеси 65% диметилсульфида, 10% п-крезола и 25% жидкого HF при 0^оС в течение 2 ч, затем диметилсульфид и HF упаривают в вакууме и остаток обрабатывают 10 мл смеси 10% п-крезола и 90% HF при 0^оС в течение 1 ч. HF упаривают, остаток растворяют в 0,1г AcOH и промывают эфиром. Раствор лиофилизуют и хроматографируют на колонке с сeфадексом G-10 в 0,1н. АсОН. Выход составляет 180 мг (82% в расчете на первую аминокислоту).

Данные аминокислотного анализа:
Lys 0,94 (1), Tyr 0,78 (1), Ser 0,75 (1), Ala 5,03 (5), Gly 4,11 (4), Met 0,81 (1), Val 1,01 (1), Arg 3,12 (3), Asp 0,95 (1), Leu 2,85 (3), Glu 2.05 (2). Pro 1,89 (2).

Масс-спектр целевого продукта (прибор Fab) выявляет один молекулярный пик (М.в. 2788). Результаты дансилирования подтверждают отсутствие N-концевой аминогруппы.

Проведение биологических испытаний.

а) Липопептид, полученный по изобретению, после лиофилизации растворяют в физиологическом растворе в концентрации 0,04 мг/мл. Для получения вакцинирующего комплекса раствор пептида смешивают с полным адъювантом Фрейнда в равном объемном соотношении. Группе морских свинок (5 животных массой по 0,4-0,5 кг) вводят вакцинирующий комплекс однократно внутримышечно из расчетa 10 мкг пептида (0,5 мл) на одно животное. На 31 день после иммунизации животных заражают введением 500 ИД₅₀ вируса ящура штамма А₂₂ и определяют протективный эффект. При этом защищенными считаются животные, у которых на 7 день после заражения вирусом не обнаружены клинические формы заболевания. Данные по изучению протективной активности заявленного пептида на морских свинках приводятся в таблице.

б) Токсичность полученного липопептида проверяют на мышах. При введении 2 мг пептида на мышь в группе из 20 мышей гибели животных не наблюдается, что свидетельствует о нетоксичности заявленного пептида.

Таким образом, получен новый липофильный пептид формулы (α, ε-ди-Palm)LysTyrSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGly- AspLeuGluProLeuAla- AlaArgValAlaAlaGlnLeuPro, который обладает защитным действием против вируса ящура штамма А₂₂ (100% защита) при введении в свободном виде. Для проявления пептидом защитного эффекта требуется доза, в 40 раз более низкая, чем у известного пептида.

Формула изобретения

Пептид формулы
α, ε ди Palm) Lys Tyr Ser -Ala Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Arg Val Ala Ala -Gly Leu - Pro,
обладающий защитным действием против вируса ящура штамма А₂₂.

РИСУНКИ

Рисунок 1