Антиатеросклеротическое и антиатерогенное средство

 

Предложено применение смеси изомеров 9, 12, 13-тригидрокси-10Е, 15Z-октадекадиеновой, 12, 15, 16-тригидрокси-9Z, 15E-октадекадиеновой, 9, 10, 13-тригидрокси-11E, 15Z-октадекадиеновой, 12, 13, 16-тригидрокси-9Z, 14E-октадекадиеновой кислот (ТГОДК) в качестве антиатеросклеротического и антиатерогенного средства. Снижение холестерина за сутки в культивированных гладкомышечных клетках, % : 60 ± 2. Ингибирование пролиферативной активности культивируемых гладкомышечных клеток за сутки, % : 52 + 1. Предотвращение утолщения интимы аорты кроликов вызвано механическим повреждением, соотношение интима/медиа: 1,15 ± 0,17 (контроль), 0,43 ± 0,06 (действие ТГОДК). 2 табл.

Изобретение относится к медицине конкретно к использованию смеси тригидроксиоктадекадиеновых кислот в качестве антиатеросклеротического и антиатерогенного средства.

В качестве аналога избран антагонист кальция-нифедипин, который обладает прямым антиатеросклеротическим действием на культуру атеросклеротических клеток аорты человека, тормозит развитие экспериментального атеросклероза у животных и влияет на течение коронарного атеросклероза у больных.

Применение антагонистов кальция приводит, однако, к угнетению секреции инсулина, что нежелательно для пациентов, больных диабетом. Следует отметить, что все диабетики страдают атеросклерозом, и что диабет часто сопутствует развитому атеросклерозу.

Целью изобретения является выявление более эффективного, чем нифедипин средства, обладающего антиатеросклеротическим (вызывающим регрессию) и антиатерогенным (профилактическим) действием.

Поставленная цель достигается использованием смеси изомеров 9, 12, 13-тригидрокси-10Е, 15Z-октадекадиеновой, 12,15,16-тригидрокси-9Z,15E-октадекади- еновой, 9,10,13-тригидрокси-11Е,15Z-октадекадиеновой, 12,13,16-тригидрокси-9Z, 14E-октадекадиеновой кислот (ТГОДК) в соотношении 8:24:5:38, выделенной из корней Bryonia alba L, в качестве антиатеросклеротического и антиатерогенного средства.

Антиатеросклеротическое действие in vitro.

Смесь ТГОДК за 24 ч инкубации с атеросклеротическими клетками аорты человека снижает содержание общего клеточного холестерина в 2,5 раза (табл.1). Смесь ТГОДК снижает также включение Н³-тимидина в культуральные клетки.

Влияние ТГОДК и нифедипина на пролиферативную активность и содержание внутриклеточного холестерина субэндотелиальных клеток интимы аорты человека изучали на свежем аутопсийном материале, взятым в течение 1-3 ч после смерти. Клетки выделяли диспергированием атеросклеротической бляшки или непораженных участков 0,15% коллагеназой в течение 3-4 ч и сажали в 24-ячеечные культуральные пластинки (плотность клеток на 7 день культивирования составляла 2-4 ˙10⁴ клеток на ячейку). Интимальные клетки культивировали 7 дней в среде 199, содержащей 10% фетальной телячей сыворотки, глютамин и антибиотики (1,5 мл культуральной среды на ячейку). Популяция культуральных клеток представляла собой в основном смесь типичных и модифицированных гладкомышечных клеток. Выделение и культивирование клеток проводили по известному методу. Для выявления антиатеросклеротической активности использовали первичную культуру клеток атеросклеротической бляшки. На седьмой день в такую культуру добавляли 10 мкл раствора препаратов, разведенных в культуральной среде. Одновременно с добавлением препарата в культуру вносили Н³-тимидин. Спустя 24 ч клетки отмывали раствором Версена, обрабатывали в течение 10 мин при 3^оС 0,25% трипсином-ЭДТА и подсчитывали число клеток с помощью гемоцитометра. К 1 мл суспензии клеток прибавляли 2 мл холодной 10% трихлоруксусной кислоты (ТХУК), осадок дважды промывали 2 мл 10% ТХУК и растворяли в 200 мкл 0,5 М гидроокиси натрия. Раствор нейтрализовали 0,5 М соляной кислотой и измеряли радиоактивность образца с помощью β-сцинтилляционного счетчика 1215 Ракбетта 11 и сцинтилляционной смеси Брея.

Содержание общего холестерина определяли известным методом, 0,5 мл суспензии клеток (2-5 ˙ 10⁵ клеток/мл) экстрагировали в течение 2 ч 2 мл смеси хлороформ-метанол, 1:2 (для определения полноты экстракции использовали ¹⁴С-холестерин) смесь центрифугировали (300xg, 10 мин), осадок промывали 1 мл смеси хлороформ-метанол, 1:1, к объединенным экстрактам добавляли по 1 мл хлороформа и воды. Смесь центрифугировали (300xg, 5 мин) нижнюю фазу отделяли, промывали 3 мл воды, упаривали и наносили на пластинку с силикагелем. ТСХ проводили в системе растворителей гексан-эфир-уксусная кислота, 75: 23: 2, и после высушивания хроматограмм количество холестерина определяли с помощью сканирующего денситометра при 196 нм (PQM-3, Карл Цейс, Оберкохен, ФРГ).

В опытах in vitro смесь ТГОДК существенно снижает содержание холестерина и подавляет пролиферативную активность культивированных атеросклеротических клеток. Способность смеси ТГОДК уменьшать основные атеросклеротические проявления позволяет говорить о его прямом антиатеросклеротическом действии на уровне клеток в культуре. Эти эффекты превосходят эффекты кальциевого антагониста нифедипина.

Антиатерогенное действие in vivo.

Для определения антиатерогенной активности миоинтимальное утолщение в аорте кролика вызывали с помощью механического повреждения. Кроликам (15 животных) породы Шиншилла весом 2-3 кг, содержащихся на стандартном рационе с нормальным содержанием липидов и получавших воду ad libitum, под местной анестезией (1% раствор лидокаина) через правую подвздошную артерию в брюшную аорту вводили эмболэктомический баллонный катетер 5F. После заполнения баллона физиологическим раствором трижды производилась тракция с амплитудой 2 см, затем катетер извлекался и подвздошная артерия лигировалась. Начиная с момента операции 5 кроликам внутримышечно ежедневно вводили раствор ТГОДК в дозе 0,05 мг/кг веса (5 мг/мл), 5 кроликам, составившим контрольную группу плацебо (PBS). Для исключения спонтанных неспецифических изменений использованы также 5 интактных кроликов. Животных забивали через 21 день после операции. За 1 ч до забоя для маркировки зоны повреждения кроликам в/в вводили синий Эванса в дозе 1 мл/кг веса (20 мг/мл). Затем под гексаналовым наркозом (40 мг/кг, в/в) канюлировалась левая подвздошная артерия и вскрывалась полая вена, после чего, брюшная аорта промывалась средой 199 с гепарином в течение 1 мин под давлением 100 мм рт.ст. и фиксировалась 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 5 мин под тем же давлением.

Сегмент брюшной аорты, содержащий синюю (деэндотелизированную) зону, иссекался и подвергался иммерсионной фиксации в глутаровом альдегиде не менее сут. Затем сосуд вскрывали вдоль и разрезали на две равные части перпендикулярно его оси в центре "синей зоны". Из одной половины сосуды вырезали две тонких полоски для анализа в световом микроскопе (СМ), другая половина подготавливалась для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). В обоих случаях образцы постфиксировались в 1% растворе четырехокиси осмия на PPS в течение 1 ч, отмывались дистиллированной водой, в течение 30 мин обрабатывались 1% раствором танниновой кислоты, вновь отмывались и обезвоживались в спиртах восходящей концентрации и абсолютном ацетоне. Для СМ образцы заливали в смесь эпона и аралдита по общепринятой методике. Полутонкие срезы (3-4 мкм) получали на ультратоме LKB-III (Швеция), окрашивали метиленовым синим и исследовали в миероскопе МБИ-15. При помощи окуляр-микрометра определяли минимальную и максимальную толщину интимы и медии на каждом срезе, после чего подсчитывался средний для данного случая индекс интима:медия (И:М).

Для СЭМ образцы прикреплялись с помощью игл на подложку из пробки высушивались путем перехода через критическую точку в жидкой СО₂ в установке Hitachi НСР-2 (Япония), монтировались на столики, напылялись платиной и палладием в спуттере JPC-1100 (Япония), просматривались и фотографировались в микроскопе 840 (Япония). При СЭМ исследовались свойства поверхности клеток интимы и интенсивность адгезии к ним клеток крови.

У интактных кроликов интима аорты в большинстве случаев представлена монослоем эндотелия с базальной мембраной, лежащей непосредственно на внутренней элластической мембране. Лишь в отдельных случаях в субэндотелии встречаются единичные гладкомышечные клетки (ГМК). Через 21 день после операции в интиме аорты, подвергшейся денудации, образуется утолщение, по величине приблизительно равное толщине медии (И:М 1,15 ± 0,17) и состоящие главным образом из ГМК. При СЭМ выявляется, что макроскопически видимая граница "синей" зоны соответствует месту остановки реэндотелизации. Таким образом, большая часть денудированного, участка лишена эндотелия. Следует отметить, что если в центре его ГМК имеют веретеновидную форму, гладкую поверхность и располагаются упорядоченными рядами под углом к оси сосуда, то на границе с эндотелием ГМК ориентированы хаотично и зачастую имеют неправильную форму. Их поверхность покрыта многочисленными микроворсинками. Именно в этих участках наблюдается выраженная адгезия лейкоцитов и тромбоитов к поверхности ГМК, тогда как в центре бывшего дефекта клеток крови не обнаруживается.

При введении смеси ТГОДК (так и нифедипина) толщина интимы существенно снижается (табл.2).

В обоих случаях поверхность ГМК в зоне контакта с эндотелием становится ровной и практически полностью "очищается" от клеток крови. Таким образом, оба препарата обладает примерно одинаково выраженным антиатерогенным действием, состоящем в ингибировании адгезии лейкоцитов и тромбоцитов и уменьшении утолщения аорты.

Локальное утолщение интимы наиболее характерное морфологическое изменение атеросклеротических артерий, играющее решающую роль в клинических проявлениях атеросклероза. В опытах in vivo на кроликах у которых механически вызывали утолщение интимы, инъекции смеси ТГОДК существенно влияют на толщину интимы в дезэндотелизированной зоне и превосходят эффект нифедипина.

Острая токсичность, мыши (per os), ЛД₅₀: нифедипин 494 мг/кг, ТГОДК > 1000 мг/кг.

Эффекты смеси ТГОДК in vivo и in vitro дают основание для ее применения в качестве нового антиатеросклеротического средства.

Таким образом, смесь ТГОДК может быть предложена в качестве антиатеросклеротического и антиатерогенного средства. Дополнительные преимущества предлагаемому препарату придают ранее выявленные гипогликемическое, антикоагулянтное и тонизирующее действия. Сочетание этих свойств придает большую эффективность лечебному действию препарата и расширяет сферу его практического применения, например, при лечении атеросклероза диабетиков

Формула изобретения

Применение смеси изомеров 9,12,13-тригидрокси-10Е, 15Z-октадекадиеновой, 12,15,16-тригидрокси-9Z, 15Е-октадекадиеновой, 9,10,13-тригидрокси-11Е, 15Z-октадекадиеновой, 12,13,16-тригидрокси-9Z, 14Е-октадекадиеновой кислоты в соотношении 8:24:5:38, выделенной из корней Bryonia alba, в качестве антиатероксклеротического и антиатерогенного средства.

РИСУНКИ

Рисунок 1