Набор реагентов для определения холестерина в сыворотке крови

 

Использование: в клинической медицине, аналитической биохимии, для определения холестерина в сыворотке крови. Сущность изобретения: разработан набор реагентов, содержащий следующие компоненты: калибратор холестерина в 7,5 - 20%-ном водном растворе детергента 4,65 мкмоль/мл; холестеринэстераза частично очищенная, с соотношением активностей холестеролэстераза/протеаза не менее 1,1 0,15 - 0,30 ед/мл; холестеролокседаза 0,08 - 0,30 ед/мл; пероксидаза 0,05 - 0,20 ед/мл; 4-аминоантипирин 0,5 - 2,5 мкмоль/ мл; фенол 5,0 - 40,0 мкмоль/мл; натрий холат 3,0 - 10,0 мкмоль/мл; полиэтиленгликоль 1,5 - 3,0 мг/мл; фосфатный буфер рН 6,3 - 7,3 остальное. Технический результат: снижение себестоимости реагента и увеличение срока его хранения при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа. 1 з. п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять холестерин (ХС) в сыворотке крови ферментативным методом.

В основу набора реагентов положен ферментативный метод, заключающийся в том, что эфиры холестерина гидролизуются холестеролэстеразой (ХЭ) с образованием свободного ХС, который под действием холестеролоксидазы (ХОД) превращается в Δ₄-холестенон и перекись водорода, последняя в реакции, катализируемой пероксидазой (ПОД) окисляет 4-аминоантипирин (4-ААП) и фенол с образованием окрашенного продукта. Количество образовавшегося продукта пропорционально содержанию ХС.

Известен набор реагентов для определения ХС ферментативным методом, включающий следующие компоненты: Трис-буфер 100 мкмоль/мл рН 7,7 Магний аспартат 50 мкмоль/мл 4-Аминофеназон 1 мкмоль/мл Натрий холат (Nа-холат) 10 мкмоль/мл Фенол 6 мкмоль/мл 3,4-Дихлорфенол 4 мкмоль/мл Эфир полигликоля и жирного спирта 0,3% ХЭ (бактериальная) 0,4 ед/мл ХОД 0,25 ед/мл ПОД 0,2 ед/мл Недостатками данного набора являются: большое количество компонентов в наборе (10) и использование бактериальной ХЭ, скорость гидролиза эфиров которой ниже, чем при использовании панкреатической ХЭ, вследствие чего и результаты определения ХС несколько ниже; небольшой срок хранения реагента: 4 недели при температуре 2-8^оС или 7 дней при 15-25^оС.

Наиболее близким к заявляемому набору (прототипом), является реагент для определения ХС ферментативным методом следующего состава: Фосфатный буфер 100 мкмоль/мл Nа-холат 3 мкмоль/мл Фенол 14 мкмоль/мл ПЭГ 8000 0,2 мкмоль/мл 4-ААП 0,8 мкмоль/мл ХЭ панкреатическая 0,117 ед/мл ХОД 0,167 ед/мл ПОД 27,667 ед/мл Известный набор реагентов содержит также наполнители, стабилизаторы ферментов. Правильность определения ХС данным набором составляет 100 ± 5% коэффициент вариации менее 5% Недостатками прототипа являются: небольшой срок хранения реагента: 7 дней при температуре 4^оС или 8 ч при температуре 25^оС; большой расход пероксидазы 25,667 ед/мл.

Технической задачей изобретения является удешевление набора реагентов и увеличение срока его хранения при сохранении правильности определения и высокой воспроизводимости результатов.

Поставленная задача достигается созданием набора реагентов, содержащего следующие компоненты: Калибратор ХС в 7,5-20% водном растворе детергента 4,65 мкмоль/мл
ХЭ панкреатическая частично очищенная 0,15-0,40 ед/мл ХОД 0,08-0,30 ед/мл ПОД 0,05-0,20 ед/мл 4-ААП 0,5-2,5 мкмоль/мл Фенол 5,0-40,0 мкмоль/мл Натрий холат 3,0-10,0 мкмоль/мл ПЭГ мол.м. 1500-8000 кДа 1,5-3,0 мг/мл
Фосфатный буфер рН 6,3-7,3 Остальное
Данный набор реагентов характеризуется правильностью определения ХС 100 ± 5% с воспроизводимостью результатов (коэффициентом вариации) менее 5% Срок хранения набора реагентов при температуре 2-8^оС составляет 5-8 недель, при температуре 25^оС 3 сут.

В наборе реагентов предпочтительно используют ХОД из Streрtomyces lavendulae, стабилизированную желатинолью и частично очищенную панкреатическую ХЭ, содержащую определенное количество протеаз: отношение активностей ХЭ и протеазы должно быть не менее 1,1, так как присутствующие в реакционной смеси протеазы деструктируют ХЭ и ХОД, что приводит к нестабильности реагента и неправильному определению ХС.

Для определения ХС к 1 мл реагента добавляют 10 мкл контрольной сыворотки, содержащей известное количество ХС (в данном случае Рreci Flo с содержанием ХС 4,65 мкмоль/мл), перемешивают, выдерживают 20 мин при температуре 37^оС и измеряют оптическую плотность исследуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 500 нм.

Концентрацию ХС в сыворотке рассчитывают относительно калибратора. Правильными считают результаты, если определяют 100 ± 5% ХС.

Определяющими отличительными признаками заявляемого набора реагентов являются;
набор реагентов содержит калибратор ХС, содержащий 4,65 мкмоль/мл ХС в 7,5-20-ном водном растворе детергента, преимущественно неонола, что позволяет правильно определять концентрацию ХС с высокой воспроизводимостью результатов;
в качестве ХЭ в реагенте используют частично очищенную панкреатическую ХЭ с уровнем протеаз, при котором отношение активностей ХЭ и протеазы не менее 1,1, что позволяет снизить себестоимость реагента за счет более простой технологии получения ХЭ;
все компоненты в наборе использованы в оптимальной, экспериментально подобранной концентрации, что позволяет снизить себестоимость реагента (например концентрация ПОД уменьшена в 125-500 раз по сравнению с известными аналогами) и повысить срок его хранения с 7 дней до 5-8 недель.

Дальнейшее увеличение концентрации ХОД и ПОД позволяет также правильно определять концентрацию ХС, но приводит к непроизводительному расходу ферментов, а увеличение концентрации ХЭ приводит к уменьшению оптической плотности исследуемой пробы.

В табл.3 и 4 показана зависимость правильности определения ХС от концентраций компонентов в реагенте.

Используемые в составе калибратора в качестве растворителя детергенты, предпочтительно неонол, в концентрации 7,5-20% пригодны для растворения 4,65 мкмоль/мл ХС. При использовании калибратора ХС в водных растворах детергентов коэффициентов вариации определения ХС в сыворотке крови уменьшается до 2-3% против 5-7% при использовании калибратора ХС в изопропаноле, традиционно и широко используемом растворителе, что способствует правильному определению ХС.

При концентрации неонола ниже 7,5% ХС в концентрации 4,65 мкмоль/мл не растворяется, при концентрации неонола выше 20% значительно увеличивается вязкость калибратора, что ухудшает воспроизводимость результатов.

В табл.1 приведены данные, обосновывающие достижение дополнительного положительного эффекта при оптимальных концентрациях неонола.

Как видно из табл.1, коэффициент вариации при определении ХС составляет 1,2-2,8% при концентрации неонола в калибраторе 7,5-20% при концентрации неонола более 20% коэффициент вариации существенно увеличивается, до 6,1% при использовании изопропанола коэффициент вариации составляет 6,3%
В табл.2 представлена зависимость качества реагента правильность определения с ним ХС и сроки его хранения от уровня протеаз, содержащихся в частично очищенной ХЭ.

Как видно из табл. 2, при соотношении активностей ХЭ/протеаза ≥1,1 ХС определяется правильно, а при соотношении ≅ 1,1 (от 1,0 до 0,8) ХС определяется неправильно, а реагент стабилен только 2 недели.

П р и м е р 1. К 1 мл реагента (концентрация компонентов которого указана в табл.3) добавили 10 мкл контрольной сыворотки Рreci Flo (с содержанием ХС 4,65 мкмоль/мл), перемешали, выдержали 20 мин при температуре 37^оС и измерили оптическую плотность исследуемого раствора и калибратора на спектрофотометре при длине волны 500 нм. Результаты анализа приведены в табл.3 (варьировали концентрации Nа-холата).

Как видно из табл.3, при фиксированных концентрациях всех компонентов набора ХС определяется правильно (N 1-3) при концентрации Nа-холата в диапазоне 3-10 мкмоль/мл, при концентрации Nа-холата < 3 мкмоль/мл и >10 мкмоль/мл ХС определяется неправильно (N 4, 5).

П р и м е р 2. Анализ проводили аналогично примеру 1.

Как видно из табл. 4, ХС определяется правильно при концентрации: ПОД 0,05-0,20 ед/мл (N 1-3), ХЭ 0,15-0,40 ед/мл (N 5-8), ХОД 0,08-0,30 ед/мл (N 10-13); при концентрациях ПОД ниже 0,05 ед/мл, ХЭ ниже 0,15 ед/мл, ХОД ниже 0,08 ед/мл ХС определяется неправильно (N 4, 9, 14).

Использование предлагаемого набора реагентов позволит по сравнению с прототипом:
удешевить стоимость набора реагентов за счет использования частично очищенной ХЭ и значительного уменьшения (в 125-500 раз) концентрации ПОД при сохранении правильности определения ХС и высокой воспроизводимости результатов;
увеличить срок годности реагента с 7 дней до 6-8 недель при температуре 2-8^оС.

Формула изобретения

1. НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, содержащий холестеролэстеразу, холестеролоксидазу, пероксидазу, 4-аминоантипирин, фенол, натрий холат, полиэтиленгликоль и фосфатный буфер, отличающийся тем, что он дополнительно содержит калибратор холестерина в 7,5 - 20%-ном водном растворе детергента, а в качестве холестеролэстеразы - частично очищенную панкреатическую холестеролэстеразу, имеющую соотношение активностей холестеролэстераза/протеаза не менее 1,1 при следующем составе компонентов:
Калибратор холестерина, мкмоль/мл - 4,65
Холестеролэстераза, ед/мл - 0,15 - 0,40
Холестеролоксидаза, ед/мл - 0,08 - 0,30
Пероксидаза, ед/мл - 0,05- 0,20
4-Аминоантипирин, мкмоль/мл - 0,5 - 2,5
Фенол, мкмоль/мл - 5,0 - 40,0
Натрий холат, мкмоль/мл - 3,0 - 10,0
Полиэтиленгликоль, мг/мл - 1,5 - 3,0
Фосфатный буфер рН 6,3 - 7,3 - Остальное
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве детергента используют неонол.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2