Способ получения ферментного препарата и ферментный препарат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается полиферментных препаратов, обладающих целлюлолитической активностью и находящих практическое применение в различных отраслях промышленности, преимущественно в пищевой промышленности, в частности, в процессе хлебопечения. Цель изобретения - расширить функциональные возможности подобных полиферментных препаратов за счет понижения в них целлюлазной активности, повышения ксиланазной активности и придания им высокой бета-ксилозидазной активности. Поставленная цель была достигнута в результате выращивания культуры-продуцента вида Aspergillus niger в присутствии по крайней мере трех индукторов целлюлолитических ферментов и в последующей ультрафильтрационной обработке фильтрата культуральной жидкости на мембране с размером пор 10.000 - 20.000 дальтон. При этом в качестве одного из индукторов целлюлолитических ферментов используют измельченную пшеничную солому или ксилан. Полученный полиферментный препарат характеризуется бета-ксилозидазной активностью, составляющей не менее 1,000 Е/г и соотношением целлюлазной и ксиланазной активности не менее 1 : 17. 2 с. и 3 з. п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается полиферментных пpепаратов, обладающих целлюлолитической активностью, которые находят применение в различных отраслях народного хозяйства.

В данном случае под целлюлолитической активностью понимается ферментативная активность, направленная на гидролиз материалов на основе целлюлозы, гемицеллюлозы и их природных аналогов.

Как правило, природные микроорганизмы, в частности грибы рода Aspergillus, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные материалы на основе целлюлозы. В этот комплекс входят целлюлазы, гидролизующие молекулы целлюлозы различной длины, гемицеллюлазы, разрушающие гемицеллюлозу; ксиланазы, деградирующие ксилан, составляющий до 50 гемицеллюлозы; другие ферменты литического действия.

Получаемые в настоящее время полиферментные препараты имеют различный состав ферментов и различаются по уровню активности отдельных ферментов.

Подобные комплексные ферментные препараты особенно широко используются в пищевой промышленности при получении пива и фруктовых соков, а также в хлебопечении. В последние годы их стали применять в производстве отбеленной бумаги.

Таким образом, с одной стороны, известные полиферментные препараты с целлюлолитической активностью могут быть эффективно использованы для решения не всех задач, а с другой стороны, успешное решение конкретной практической проблемы требует использования полиферментного препарата с определенным спектром ферментативной активности и с определенным соотношением активностей разных ферментов.

Возможности получения полиферментных препаратов с заданными характеристиками селекционными методами трудоемки, методы стимулирования биосинтеза одних ферментов и одновременного ингибирования накопления других ограничены, приемы разделения индивидуальных ферментов комплексного препарата сложны и дороги.

По этой причине особенно в крупномасштабном производстве обычно используются имеющиеся полиферментные препараты, которые при необходимости сочетают с дополнительными ферментными препаратами с недостающей активностью или с недостающей направленностью действия.

Целлюлолитические ферменты, в том числе целлюлазы и ксиланазы, являются индуцируемыми ферментами и для получения полиферментного препарата, содержащего комплекс ферментов целлюлолитического действия, соответствующую культуру-продуцент выращивают в присутствии индуктора ферментов. При его отсутствии биосинтеза целлюлолитических ферментов практически не происходит. Как правило, в исходный состав питательной среды вносят не менее двух индукторов целлюлолитических ферментов.

Известен, например, полиферментный препарат, содержащий (ед/г препарата): ксиланазу 94,250, целлюлазу, расщепляющую короткие молекулы целлюлозы 18,500, лигниназу 1,300, мананазу 870 и ламинариназу 90.

Соотношение целлюлазной и ксиланазной активности в этом препарате составляет 1: 5 и этот препарат используют для гидролиза лигниноцеллюлозного материала.

Для получения этого полиферментного препарата культуру Aspergillus niger ДИКЛС N 2 выращивают на питательной среде, содержащей в качестве индуктора целлюлолитических ферментов и источника углерода измельченные кукурузные стебли или кочерыжки (с размером частиц 2 мм) и пшеничные отруби, отделяют взвешенные частицы, осаждают целевой продукт этанолом и лиофильно высушивают [1] Наиболее близким к предложенному можно признать полиферментный препарат, содержащий: ксиланазу (7,000 МЕ/г), целлюлазу (100 Е/г), бета-глюкозидазу (1,000 Е/г), лимнариназу (35 Е/г) и бета-глюканазу (120 Е/г).

Соотношение целлюлазной и ксиланазной активности в этом препарате составляет 1:70 и этот ферментный комплекс с высокой ксиланазной активностью предназначен для гидролиза ксилансодержащих продуктов в производстве пива и соков, а также в хлебопечении.

Способ получения этого полиферментного препарата предусматривает выращивании культуры Aspergillus niger K-4 в питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и индуктора целлюлолитических ферментов пшеничные отруби и измельченные кукурузные кочерыжки в соотношении 1:2, при поддержании рН в интервале 3,8-4,5, добавление в культуральную жидкость 0,1 хлористого кальция и 0,1 перлита, отделение осадка, концентрирование и лиофильное высушивание фильтрата [2] Перечисленные полиферментные препараты пригодны для гидролиза растительного материала и могут быть, в частности, использованы в хлебопечении, поскольку содержат значительные количества целлюлазы и ксиланазы.

Однако в тех случаях, когда требуется разрушить гемицеллюлозу, но нежелательно глубокое расщепление целлюлозы (например, в процессе получения отбеленной бумаги) упомянутые полиферментные препараты не вполне пригодны, поскольку имеют относительно высокую целлюлазную активность.

Цель изобретения создать полиферментный препарат, обладающий целлюлолитической активностью, который имеет пониженную целлюлазную активность, повышенную ксиланазную активность и высокую бета-ксилозидазную активность и приемлемый, в частности, для использования в процессе хлебопечения, а также разработать способ получения полиферментного препарата с такими характеристиками.

Поставленная цель была достигнута в результате того, что культуру Aspergillus niger выращивают в присутствии по крайней мере трех индукторов целлюлолитических ферментов, а фильтрат культуральной жидкости подвергают ультрафильтрации на мембране с размером пор 10000-20000 Д.

Сущность предложения заявителя заключается в следующем.

Культуру-продуцент целлюлолитических ферментов Aspergillus niger выращивают на питательной среде в присутствии не менее, чем трех индукторов целлюлолитических ферментов.

При этом исходная питательная среда может содержать не менее трех индукторов, введенных в ее состав одномоментно, или может первоначально содержать не менее двух индукторов с введением дополнительных индукторов в процессе культивирования, предпочтительно после 40 ч культивирования.

В качестве индукторов целлюлолитических ферментов и одновременно источников углеpода могут быть использованы такие природные субстраты, как измельченные кукурузные кочерыжки, стебли кукурузы, пшеничные отруби, пшеничная солома, или такие индивидуальные химические соединения, как ксилан.

В числе используемых индукторов обязательно должны присутствовать измельченная пшеничная солома или ксилан. Предпочтительно использовать пшеничную солому, поскольку ксилан является дорогостоящим продуктом.

Индуктором ферментов, дополнительно вносимым в процессе культивирования, должны быть измельченная пшеничная солома или ксилан.

Суммарное содержание индукторов целлюлолитических ферментов в среде (включая и дополнительно внесенный индуктор) составляет обычно 3-4 мас. Среднее количество дополнительно вносимого индуктора приблизительно равняется 1 мас.

Источниками азота могут служить традиционные субстраты, используемые при выращивании грибов рода Aspergillus.

Каких-либо иных принципиальных требований к составу используемой питательной среды и каких-либо специфических требований к условиям выращивания культуры-продуцента не имеется.

После завершения процесса культивирования биомассу и взвешенные частицы отделяют любым известным методом, например фильтрацией, а фильтрат культуральной жидкости подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 10000-20000 Д и собирают ретентат.

Из ретентата целевой продукт получают известным образом, в частности осаждением органическим растворителем, или высушивают методом лиофилизации или распыления.

В результате осуществления описанного способа получают оригинальный полиферментный препарат, обладающий выраженной целлюлолитической активностью, который характеризуется наличием следующих ферментов, Е/г: Ксиланаза, МЕ/г 12000 Целлюлаза-1 400 Целлюлаза-2 50 Бета-глюкозидаза 1900 Бета-глюканаза 75 Бета-ксиланидаза 2800 Ламинариназа 110 Принципиальным отличием препарата, полученного предложенным способом, является его значительная бета-ксилозидазная активность и соотношение в нем целлюлазной и ксиланазной активностей, составляющее 1:30.

Оригинальность свойств полученного полиферментного препарата подтверждается его особой пригодностью для использования в процессе хлебопечения.

Ниже приводятся некоторые экспериментальные данные, подтверждающие важность отличительных приемов предложенного способа для достижения поставленной цели.

Заявителем было установлено, что при выращивании культуры-продуцента в присутствии таких известных индукторов целлюлолитических ферментов, как измельченные кукурузные кочерыжки и пшеничные отруби, реализуются не все возможности продуцента, что вытекает из данных табл.1.

Результаты наглядно показывают, что только увеличение концентрации индукторов (кукурузных кочерыжек и пшеничных отрубей) не влечет за собою стимулирование биосинтеза ферментов, в то время как введение дополнительного (третьего) индуктора (пшеничной соломы или ксилана) заметно повышает биосинтез ксиланазы и бета-ксилозидазы.

Тот факт, что введение третьего индуктора приводит к повышению накопления целлюлолитических ферментов и при включении дополнительного индуктора в исходный состав питательной среды и при его добавлении на 40 ч культивирования (экспоненциальная фаза роста), следует из табл.2.

Поскольку сведения о молекулярных массах целлюлаз и ксиланаз довольно разноречивы, возможность использования метода ультрафильтрации для отделения целлюлаз от ксиланаз и других ферментов проверялась экспериментально. Влияние размера пор ультрафильтрационной мембраны на возможность разделения ферментов показано в табл.3.

Результаты показывают, что использование ультрафильтрационной мембраны с размером пор 15,000 Д позволяет изменить соотношение целлюлаза:ксиланаза от 1:30 до 1:17 и при этом сохранить всю активность бета-ксилозидазы.

После осуществления предложенного способа был получен полиферментный препарат, явно отличающийся по составу от аналогичных. Сравнительная характеристика предложенного и известных полиферментных препаратов целлюлолитической направленности приведена в табл.4.

Хорошо видно, что предложенный препарат отличается от препаратов аналогичного назначения по соотношению активностей отдельных ферментов, что расширяет возможности его функционального использования.

Существенность отличий предложенного препарата от известных подтверждается, в частности, тем, что предложенный препарат оказался гораздо эффективнее известных при использовании в процессе хлебопечения, что подтверждается данными табл.5.

Более подробно сущность предложения поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Штамм-продуцент Aspergillus niger K-4, выращенный на плотной питательной среде картофельно-декстрозном скошенном агаре в пробирках диаметром 10-12 мм при температуре 28-32^оС в течение 10 дней, используют для инокуляции такой же среды в 3-х матрацах.

Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 121-124^оС в течение 20 мин. Один матрац засевают смывом культуры с одной пробирки физиологическим раствором или стерильной водопроводной водой.

Маточную культуру инкубируют при температуре 28-32^оС в течение 10 дней в термостате. Полученный материал в количестве 2-х матрацов используют для засева посевного аппарата вместимостью 1,5 м³.

Для получения посевного материала в посевных аппаратах используют среду, содержащую, кг/м³: Глюкоза 20,0 Кукурузный экстракт 10,0 Сульфат аммония 1,4 Калий фосфат однозаме- щенный 2,0 Мочевина 0,3 Хлористый аммоний 1,0 Сульфат магния 0,3 Хлористый кальций 0,4 Пшеничные отруби 10,0 Кукурузные кочерыжки 5,0 Как пеногаситель используют подсолнечное масло (500 мл), рН среды до стерилизации (без корректировки) 4,4 4,7.

Среду стерилизуют при температуре 124^оС в течение 20 мин. После стерилизации рН может быть 5,3-5,7.

Среду засевают после охлаждения споровой культурой (смыв спор с газонов 2-х матрацев).

Режим культивирования: температура 29 ± 1^оС, рН без корректировки, аэрация непрерывно 0,6 0,7 л/л в мин. Продолжительность ферментации 20 ч.

Выращивание продуцента в промышленном аппарате объемом 15 м³осуществляют на питательной среде следующего состава, кг/10 м³: Кукурузные кочерыжки 200,0 Пшеничные отруби 100,0 Ксилан 100,0 Нитрат натрия 20 Калий фосфат одноза- мещенный 10 Сульфат магния 5 Хлористый калий 5 Пеногаситель 2 Вода водопроводная, м³ 10 рН среды до стерилизации 6,0 Среду стерилизуют при температуре 124^оС в течение 40 мин. Контроль за стерильностью проводят до и после посева по общепринятым методикам.

Режим ферментационного процесса: температура 28-29^оС, избыточное давление в аппарате до 0,5 атм, аэрации непрерывно до 10 ч роста 0,5 л/л мин; до 30 ч 0,8-0,9 л/л мин; до окончания процесса 0,5 л/л мин.

Продолжительность процесса 70 ч.

Активность ксиланазы контролируется после 48 ч роста каждые 4 ч и при максимальном накоплении ферментацию прекращают. Культуральную жидкость фильтруют на пресс-фильтре через бельтинговую ткань.

Ферментативная активность культуральной жидкости составила Е/мл: Целлюлазная 5,0 Ксиланазная 125,0 Бета-ксиланидазная 36,0 Бета-глюкозидазная 20,0 Бета-глюканазная 0,95 Ламинариназная 1,25 Фильтрат собирают в емкость, а затем направляют на концентрирование на установке УНТ-24 с рабочими органами из полых волокон с общей фильтрующей поверхностью 24 м³. Размер пор мембраны составляет 15000 Да.

Производительность установки по фильтрату 30 л/с˙м²˙ч. Давление на установке 0,5-1,5 атм. Температуру ретентата поддерживают не выше 20^оС с помощью теплообменного устройства, входящего в комплект установки.

Во время концентрирования контролировали содержание сухих веществ в ретентате и динамику накопления ксиланазной активности.

Ретентат высушивают на лиофильной сушилке.

Ферментный комплекс имел следующий состав, Е/г: Ксиланаза, МЕ/г 12000 Целлюлаза 440 Бета-глюкозидаза 1850 Бета-глюканаза 75 Бета-ксиланидаза 2800 Ламинариназа 110 П р и м е р 2. Процесс осуществляли как в примере 1, но в состав питательной среды для промышленного аппарата (10 м³) вместо ксилана внесли 100,0 кг измельченной пшеничной соломы.

Ферментативная активность культуральной жидкость составила, Е/мл: Целлюлолазная 4,4 Ксиланазная 80 Бета-ксиланидазная 28 Бета-глюкозидазная 16 Бета-глюканазная 0,5 Ламинариназная 1,0 Перед сушкой концентрата (после определения ксиланазной активности) вносят пшеничную муку сортового помола для получения стандартизованного препарата с ксиланазной активностью не менее 7000 МЕ/г.

Полученную суспензию высушивают на сушилке с псевдокипящем слоем.

Полученные гранулы сухого продукта измельчали на молотковой дробилке и получали продукт следующего гранулометрического состава, Частицы до 200 нм 90 Частицы до 500 нм 10
Ферментный комплекс имел следующий состав, Е/г: Ксиланаза, МЕ/г 7000 Целлюлаза 250 Бета-глюкозидаза 1000 Бета-глюканаза 35 Бета-ксиланидаза 1100 Ламинариназа 70
П р и м е р 3. Процесс осуществляли как в примере 2, но измельченную пшеничную солому вносили в ферментационный аппарат на 41 ч культивирования.

Ферментативная активность культуральной жидкости составила, Е/мл: Целлюлолазная 5,3 Ксиланазная 90 Бета-ксилозидазная 30 Бета-глюкоидазная 16,5 Бета-глюканазная 0,5 Ламинориназная 1,0
Концентрат высушивают на распылительной сушилке при температуре на входе в сушилку 155^оС и на выходе 51^оС. Скорость передачи концентрата на сушку 1,5 5,0 л/мин. Для получения стандартного продукта вносят декстраны для получения препарата с ксиланазной активностью 8000 МЕ/г.

Ферментный комплекс имел следующий состав, Е/г: Ксиланаза 8000 Целлюлаза 270 Бета-глюкозидаза 1100 Бета-глюканаза 35 Бета-ксилозидаза 1200 Ламинариназа 75
Таким образом, изложенное свидетельствует об определенных преимуществах предложенного полиферментного препарата перед аналогичными известными, которые, в частности, заключаются в более благоприятном соотношении целлюлазной и ксиланазной активности и в высокой бета-ксилозидазной активности.

Аналогичные результаты достигались и при использовании других штаммов культуры Aspergillus niger, в частности Aspergillus niger K-1, А-1, А-3, А-6.

По сведениям заявителя совокупность отличительных приемов предложенного способа (выращивание культуры-продуцента в присутствии по крайней мере трех индукторов целлюлолитических ферментов с последующим отделением целлюлаз методом ультрафильтрации на мембране с размером пор 10,000-20,000 Да) и сам полиферментный препарат, имеющий бета-ксилодидазную активность не ниже 1100 Е/г, в доступной научно-технической и патентной литературе не описана.

Известна, правда, возможность твердофазного культивирования штамма Asper- gillus awamory N 1250 на смеси, содержащей три индуктора целлюлолитических ферментов измельченных стеблей кукурузы, пшеничных отрубей и пшеничной соломы в соотношении 1:1:1 [3]
Однако специфика твердофазного культивирования не позволяет однозначно и априорно утверждать о приемлемости этого приема (использования трех индукторов целлюлолитических ферментов) в процессе суспензионного культивирования. В этом же источнике при описании варианта суспензионного культивирования продуцента предусмотрено его выращивание на питательной среде, содержащей лишь два индуктора целлюлолитических ферментов (кукурузных кочерыжек и пшеничной соломы).

Описанное выше известное техническое решение направлено, кроме того, на повышение уровня накопления ксиланазы, сведений о накоплении других целлюлолитических ферментов не приводится, в то время, как предложенный способ имеет целью обеспечение наиболее благоприятного соотношения целлюлолитических ферментов.

Сведениями об использовании метода ультрафильтрации для корректировки состава ферментов целлюлолитического комплекса заявитель не располагает.

Изложенное позволяет заявителю полагать, что предложенный способ и предложенный полиферментный препарат соответствуют требованиям, предъявляемым к изобретению.

Формула изобретения

1. Способ получения ферментного препарата, содержащего ксиланазу, целлюлазу, β-глюкозидазу, ламинариназу и b-глюканазу, предусматривающий глубинное выращивание культуры продуцента Aspergillus niger в питательной среде, содержащей источники углерода и индуктора биосинтеза целлюлолитических ферментов - измельченные пшеничные отруби и измельченные кукурузные кочерыжки, источник азота и необходимые минеральные соли, отделение осадка фильтрацией, концентрирование целевого продукта и лиофилизацию, отличающийся тем, что выращивание продуцента ведут в присутствии дополнительного источника углерода и индуктора биосинтеза целлюлолитических ферментов - измельченной пшеничной соломы или ксилана, а концентрируют целевой продукт ультрафильтрацией на мембране с размером пор 10000 - 20000 Да с получением препарата, дополнительно содержащего b-ксилозидазу и арабиназу.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченную пшеничную солому или ксилан вводят в исходную питательную среду или после 40 ч выращивания.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченную пшеничную солому или ксилан вносят в количестве не менее 1 мас.%.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарная концентрация источников углерода и индуктора биосинтеза целлюлолитических ферментов составляет не менее 3 мас.%.

5. Ферментный препарат, содержащий ксиланазу, целлюлозу, b-глюкозидазу, ламинариназу и b-глюканазу, продуцируемый культурой Aspergillus niger на питательной среде, содержащей источники углерода и индуктора биосинтеза ферментов - измельченные пшеничные отруби и измельченные кукурузные кочерыжки, источник азота и необходимые минеральные соли, отличающийся тем, что он дополнительно содержит b-ксилозидазу и арабиназу, соотношение в нем активности целлюлазы и ксиланазы составляет 1 : 17, а продуцент выращивают в присутствии дополнительного источника углерода и индуктора биосинтеза целлюлолитических ферментов - измельченной пшеничной соломы или ксилана.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3