Полипептид, фрагмент днк нс270, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида нс86, слитого с галактозидазой escherichia coli

 

Изобретение относится к биотехнологиии и иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что получен полипептид HC86, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена NS4 вируса гепатита C и предназначенный для определения антител к вирусу гепатита C, синтезируемый в штамме бактерий Escherichia coli HC86, трансформированном рекомбинантной плазмидой рН C270 или рН C270F, содержащей нуклеотидную последовательность гена белка NS4, слитую с последовательностью нуклеотидов гена бета-галактозидазой Е. coli. 3 с. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С.

Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит Д, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение ВГС, как правило, осуществляется при переливании крови. ВГС при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В. Однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени.

Поэтому для проведения противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного выявления ВГС-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выяв- лять инфицированных ВГС.

Многочисленные исследования ВГС позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. ВГС имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Данная последовательность нуклеотидов содержит единственную большую открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010-3011 аминокислотных остатков, который является предшественником индивидуальных вирусных структурных и неструктурных вирусных белков. Данный белок процессируется под действием клеточных и вирусспецифической протеаз. К структурным белкам ВГС относят кор(ядерный)-антиген размером 19 кДа. Кор-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид ВГС. Два других структурных белка ппредставлены гликопротеинами размером около 32 кДа и 72 кДа, которые процессируются, как и кор-антиген с N-концевой области вирусспецифического полипротеина. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона ВГС, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком ВГС (NS1). Белок NS2 ВГС размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает, во-первых, нуклеотидтрифторфосфат-связывающей, геликазной активностью и, по-видимому, участвует в репликации генома ВГС; во-вторых, ферментативной активностью сериновой протеазы, которая, по-видимому, обеспечивает процессирование неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, NS4 очень гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, которая используется при репликации вирусного генома.

Большинство методов диагностики ВГС-инфекции основано для определения антител к белкам ВГС в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков ВГС, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВГС вместо вирусных антигенов, не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВГС и, в частности, гена белка NS4 ВГС (патенты ЕР 0 388 232, C 12 N 15/51, 1990; ЕР 0 406 511, C 12 N 15/51, 1990; ЕР 0 416 725, C 12 N 15/51, 1990 и др.).

В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток-продуцентов (ЕР 0 388 232), так и в направлении выбора наиболее антигенно-активных детерминант (ЕР 0 445 423, C 12 N 15/51, 1990), а также создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВГС (ЕР 0 377 303, C 12 N 15/51, 1989).

Сущность данного изобретения состоит в том, что предложены оригинальный гибридный полипептид НС86, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома ВГС (86 аминокислотных остатков белка NS4 ВГС, аминокислотные остатки 1674-1760), свободный или слитный с бета-галактозидазой E.coli, связывающий антитела к продукту гена белка NS4 ВГС, отличающийся от известных, во-первых, размером, например полипептиды 5-1-1 (патент ЕР 0 388232) соответствует 1694-1735 аминокислотным остаткам белка NS4 ВГС, р1684 (патент ЕР 0 445 423) соответствует 1684-1750 аминокислотным остаткам белка NS4 ВГС; во-вторых, наличием аминокислотных замен (например, I-V в 1685-1686-м положении, R-K в 1690-м положении, V-I в 1694-м положении и др.) по сравнению с пептидом р1684 (патент ЕР 0 445 423), фрагмент ДНК, кодирующий полипептид НС86; сущность изобретения состоит также в штамме E.coli ВКПМ N В-6256, который трансформирован рекомбинантной плазмидой рНМ270, содержащей фрагмент ДНК НС270 и экспрессирующей белок НС86.

Штамм-продуцент НС86 характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32^оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37^оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^оС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1 х 10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^оС в течение 3-4 месяцев.

Рекомбинантный полипептид С86, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена кор-антигена ВГС в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N В-6256.

П р и м е р 1.

Получение фрагмента ДНК НС270.

Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды cr1 5'-CCTCGGATCCTТGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTATCTTGTCCGGAAGG 3' cr2 5' CCGGCCATTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3' cr3 5' CCAGGAATTCGATGAGATGGAAG AGTGCGCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGG 3' cr4 5' AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3' cr5 5' CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCACCAAGCAAGCGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3' cr6 5' GAGTCCAAGTGGCGCACTTGAGACATTCTAACTGCAGGTCCGC 3' rc1 5' CTACCTACAATGACCACACTGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3' rc2 5' CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAATGGCCGGCCTTCCGGACAAGATAATC 3' rc3 5' AAGGTGCGAGGCGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc5 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5' GCGGACCTGCAGTTAGAATGTCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTAGCAGCAG 3'
Олигонуклеотиды cr1, 2, 3, 4, 5, 6 и rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмоль каждого из олигонуклидов, 50 мкл десятикратного буфера для иназы (0,5М трис-HCl, рН 7,6, 0,1М MgCl, 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмоль (150 мкКи) [гамма-p] АТФ (удельная активность 3000 и/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т и бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 мин при 37^оС. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98^оС, охлаждают до 16^оС. 100 мкл смеси, обработанных киназой олигонуклеотидов, смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl₂, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при ^оС в течение 5 ч. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65^оС в течение 5 мин для инактивации фермента.

10 мкл раствора, обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 270 п.н.).

100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 м NaCl, 10 ммМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол) в течение 5 ч при температуре 37^оС. Ферменты инактивируют нагреванием при 70^оС.

10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 270 п.н.).

ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами BamHI и PstI.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина; Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма НСВК на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 270 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС270.

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НС270.

C C T C G G A T C C T T G A C A A C A G G C A G T G T G G T C A T T G T A G G
T A G G A T T A T C T T G T C C G G A A G G C C G G C C A T T G T T C C A G A
C A G A G A G C T T C T C T A C C A G G A A T T C G A T G A G A T G G A A G A
G T G C G C C T C G C A C C T T C C T T A C A T C G A G C A A G G A A T G C A
G C T C G C C G A G C A A T T C A A G C A G A A G G C G C T C G G C T T A C T
G C A A A C A G C C A C C A A G C A A G C G G A G G C T G C T G C T C C A G T
G G T G G A G T C C A A G T G G C G A G C A C T T G A G A C A T T C T A A C T
G C A G G T C C G C
Данный фрагмент ДНК НС270 также был получен путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc6.

П р и м е р 2.

Получение плазмиды рНС270.

Синтезированный фрагмент ДНК НС270 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды 10 мкл фрагмента ДНК лигируют с ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A.

Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащим 50 мкл/мл ампициллина. Колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, ДНК обрабатывают ее рестриктазами PstI и BamHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2%-ной агарозе.

Отбирают штамм НС86, имеющий на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 270 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС270. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что фрагмент ДНК в плазмиде рНС270 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС270 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности NS4 белка ВГС, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.

Аналогичным образом получена плазмида рНС270F, в которой фрагмент ДНК НС270 находится непосредственно под контролем промотора бактериофага лямбда croLacZ. Данная плазмидная ДНК обеспечивает синтез рекомбинантного кор-антигена ВГС, свободного от аминокислотных последовательностей бета-галактозидазы E.coli.

П р и м е р 3.

Штамм E.coli НС86, содержащий плазмиду рНС270, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кДа. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLТ90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий плазмиду рНС270. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli ПС270, содержащий плазмиду рЕС270, экспрессирует гибридный полипептид с мол.м. 120-130 кДа. Этот полипептид назван С86. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность β-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS4, представлена ниже
L T T G S V V I V G R I I L S G R P A I V P D R E L
L Y Q E F D E M E E C A S H L P Y I E Q G M Q L A E
Q F K Q K A L G L L Q T A T K Q A E A A A P V V E S
K W R A L E T F
П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15М NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5% -ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1М Nа-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^оС обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к ВГС, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^оС в течение 1 ч. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид С86 связывается с антителами к вирусу гепатита С.

Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, обладающий свойствами белка NS4 ВГС, взаимодействующий с антителами белка NS4 ВГС, позволяющий определять антитела к ВГС.

Формула изобретения

1. Полипептид, полученный в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном плазмидной ДНК, содержащей фрагмент ДНК со следующей нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, и аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, где R и R₁ 0 или R - нуклеотидная последовательность, кодирующая β- галактозидазу, а R₁ аминокислотная последовательность β- галактозидазы, и обладающий способностью связывать антитела к белку NS 4 вируса гепатита С.

2. Фрагмент ДНК НС 270, полученный с помощью химического синтеза или цепной полимеразной реакции с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, содержащий на 3ʹ конце стоп-кодон.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-6256-продуцент полипептида НС86, слитого с β галактозидазой Echerichia coli.