Патент ссср 217687
Взамен ранее изданного
2I7687
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
СвВз Соеетскит
Социзлистичзскиз
Республиз
Зависимое от авт. свидетельства №
Заявлено 05.1.1967 (№ 1124465/28-13) с присоединением заявки №
Приоритет
Опубликовано 07.Ч.1968. Бюллетень № 16
Дата опубликования описания 15.XII.1969
Кл. 42L, 5/02
Комитет со целан
МПК 6 Oln
УДК 637.127.6 (088.8) изобретений и открытий ори Совете Министров
СССР
Автор изобретения
Заявитель
Э. Е. Грудзинская
Всесоюзный научно-исследовательский институт молочной промышленности
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ
В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
Известны способы определения свободных аминокислот в молоке и молочных продуктах путем осаждения из пробы исследуемого продукта белков молока абсолютным спиртом, удаления осажденных белков одним .из известных способов, например центрифугированием, извлечения из пробы балластных веществ и хроматографирования, предусматривающего многократную разгонку свободных аминокислот на хроматографической бумаге системой растворителя, состоящей из и-бутанола, ледяной уксу.спой кислоты и дистиллированной воды, а также сушку хроматограммы после каждого раза разгонки и проявление пятен аминокислот раствором нингидрина в ацетоне. Очистку пробы от балластных веществ ведут с помощью ионообменной смолы, а разгонку пятен берут каждый раз до конца листа хроматографической бумаги.
Для более точного определения свободных аминокислот, а также упрощения его предложено пробу исследуемого продукта брать в количестве 200 мл, извлечение балластных веществ из пробы осуществлять подкисленным концентрированной соляной кислотой абсолютным спиртом, соотношение компонентов в системе растворителей (и-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная лода) подбирать соответственно 4: 1: 1, разгонку аминокислот вести вначале до /з листа
2 хроматографической бумаги, затем до /2, /4 и два раза до конца листа, сушить хроматограмму при комнатной температуре (18 — 20 С) .
5 Для предотвращения потерь аминокислот в процессе подготовки пробы исследуемого продукта к хроматографированию следует фильтрат, полученный после удаления белков из пробы исследуемого продукта, и элюат, полу10 ченный после удаления балластных веществ, упаривать в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45 — 55 С и давлении О,б ати, а концентрат аминокислот, полученный после упаривания элюата, растворять в 3 мл
15 10% -ного изопропилового спирта.
Чтобы более четко выявлять проявленные пятна аминокислот, целесообразно хроматограмму после сушки выдерживать 20 мин при б5 С.
Способ заключается в следующем, Берут пробу молока в количестве 200 мм, к пробе добавляют 400 мл этанола, выдерживают не менее 2 час при температуре — 3, — 4 С, за25 тем удаляют белки путем отфильтрования нли центрифугирования. Прозрачный фильтрат упаривают при О,б атм и температуре 45—
55" С в вакуумсушильном шкафу. В случае наличия большого количества липидов и пигЗр ментов фильтрат обрабатывают хлороформом.
217687
Предмет изобретения
Составитель М. И. Адреева
Редактор В. Ф. Чулкова Техред Л. Я. Левина Корректор Г. С, Мухина
Заказ 3250/5 Тираж 480 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва 5К-35, Раушская наб., д. 4l5
Типография, пр. Сапунова, 2
Сгущенный остаток, полученный после сушки, содержит кроме аминокислот балластные вещества, которые осаждают подкисленным с помощью концентрированной соляной кислоты этиловым спиртом (на 100 мл абсолютного этанола 0,5 мл концентрированной НС1).
Отфильтровывают балластные вещества и упаривают (при том же режиме сушки) элюат аминокислот.
Аминокислоты (сухой остаток) растворяют в 3 мл 10а/р-ного изопропилового спирта. Образцы наносят на хроматографическую бумагу, подсушивают, после чего помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей и-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная вода в:соотношении 4:1: l.
Для разгонки пятен систему растворителей пропускают через лист хроматографической бумаги, причем делают это ступенчато по следующей схеме: на /з, /2, /4 листа и два раза до конца хроматограммы. После каждой .разгонки хроматограмму сушат при температуре помещения, Окончив пятикратный прогон растворителей, хроматограмму проявляют 0,5>/о-ным нингидрином в ацетоне с добавкой ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 95: 1: 4. После сушки проявленной хроматограммы ее выдерживают 20 мин при
65 С.
Этим способом четко разделяются до 15 следующих аминокислот: цистеин + цистин, лизин, гистидин, аргинин, серии, глицин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, треонин, алании, тирозин, валин, метионин, фенилаланин, лейцин+ изолейцин. Интенсивность окраски пятен зависит от количественного содержания той или иной аминокислоты.
1. Способ определения свободных аминокислот в молоке и молочных продуктах, заключающийся в осаждении из пробы исследуемого продукта белков молока абсолютным спир5
4 том, удалении осажденных белков одним из известных способов, например центрифугированием, упариванием фильтрата, извлечении из пробы балластных веществ .и хроматографировании, предусматривающем многократ:ную разгонку свободных аминокислот на хроматографической бумаге системой растворителя, состоящей из н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды, а также сушку хроматограммы после каждого раза разгонки и проявление пятен аминокислот на хроматограмме раствором нингидрина в ацетоне с добавлением ледяной уксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью более точного определения свободных аминокислот, а также упрощения способа, пробу исследуемого продукта берут;в количестве
200 мл, извлечение балластных веществ из пробы осуществляют подкисленным концентрированной соляной кислотой абсолютным спиртом, соотношение компонентов в системе растворителей (к-бутанол — ледяная уксусная кислота — дистиллированная вода) под. .бирают соответственно 4: 1: 1, причем разгон. ку аминокислот ведут вначале до /з листа хроматографической бумаги, затем до /2, после чего до /4 листа .и два раза до конца листа, при этом сушку ведут при температуре от
18 до 20 С.
2. Способ,по п. 1, отличающийся тем, что, с целью предотвращения потерь аминокислот в процессе, подготовки пробы исследуемого продукта к хроматографированию, фильтрат, полученный после удаления белков из пробы исследуемого продукта,,и элюат, полученный после удаления балластных веществ из пробы продукта, упаривают при температуре, равной 45 — 55 С, и давлении, равном 0,6 ати, а концентрат аминокислот, полученный после упаривания элюата,,растворяют в 3 мл 10>/оного изопропилового спирта.
3, Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью более четкого выявления проявленных пятен свободных аминокислот, хроматограмму после сушки выдерживают 20 мин при
65 С.
