Способ определения активности протеолитических ферментов
Изобретение относится к биохимии, может быть использовано для определения активности протеолитических ферментов. Пробу ферментного раствора вносят в лунку. Лунку вырезают в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку. Определяют активность протеолитическаих ферментов после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия. Измеряют интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия. Способ позволяет определить активность протеолитичеких ферментов и расширить область применения. 5 ил., 3 табл.
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для количественного определения активности протеолитических ферментов.
Известен способ количественного определения активности протеолитических ферментов (Практикум по биохимии. Под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьевой. М. МГУ, 1989. С. 83), основанный на способности ароматических аминокислот поглощать ультрафиолетовый свет. Активность фермента определяют по повышению концентрации продуктов гидролиза белкового субстрата. Недостатками известного способа являются высокая трудоемкость и его дороговизна, а также ограниченные возможности его применения. Известен также способ определения активности протеолитических ферментов (Ambrose L. Ch., Patrick Y., Vincent A.F. A method to detect proteinase activity using unprocessed X-ray films // Anal. Biochem. - 1991. - V. 193, N 1. - P. 20- 23), заключающийся в том, что на необработанную фотопластинку с желатиновым покрытием (субстрат) наносят пробу ферментного раствора и через определенный промежуток времени визуально определяют активность фермента по наличию гидролизованного участка субстрата. Этот способ заключается в качественном определении активности ферментов. Недостатком этого способа является ограниченная область его применения, заключающаяся в невозможности количественного определения активности ферментов. Техническим результатом изобретения является возможность количественного определения активности протеолитических ферментов и расширение области применения. Технический результат достигается тем, что пробу ферментного раствора вносят в лунку, вырезанную в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку, и определение активности протеолитических ферментов осуществляют после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия путем измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия. На фиг. 1 показано схематическое изображение подготовленной для эксперимента фотопластинки (вид сбоку). На фиг. 2 представлена принципиальная электрическая схема устройства для измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки. На фиг. 3 (a, b) представлена зависимость активности фермента проназы от его концентрации. На фиг. 4 (a, b) представлена зависимость активности фермента трипсина от его концентрации. На фиг. 5 представлены данные по определению активности протеиназ из различных источников. Свежий или фиксированный в жидком азоте материал гомогенизировали на холоде (+4oC) и экстрагировали 0,05 М трис-HCl-буфером, pH 8,0 в течение 24 час. Объем экстрагента и время экстракции для каждого случая подбирали экспериментально. Экстракты очищали центрифугированием при 1000-3000 g в течение 10-20 мин. Подготовка фотопластин. Фотопластинка 1 (ТУ 6-17 778-76) размером 6х9 см помещается на строго горизонтальную поверхность, и на ее желатиновую поверхность 2 наносится 15 мл расплавленной на водяной бане 1,5% агарозы, приготовленной в 0,05 М Трис-HCl-буфере с 0,002 М CaCl2, pH 8,0. После застывания геля 3 пробочным сверлом (
5 мм) вырезаются лунки 4 для внесения ферментного раствора. На фиг. 1 показано схематическое изображение подготовленной для эксперимента фотопластинки (вид сбоку). Ферментный раствор объемом 5 мкл вносится в лунки микропипеткой. Для исключения испарения раствора фермента из лунок 4 агарозный гель 3 покрывается целлулоидной пленкой. Фотопластинка 1 помещается во влажную камеру и ставится в термостат при 37oC на определенное время. Затем с фотопластинки 1 удаляется гелевый слой 3, а сама фотопластинка 1 промывается под струей проточной воды для удаления гидролизованной желатины, промывается дистиллированной водой и сушится на воздухе. Фотопластинка 1 помещается между источником света 5 и фотоприемником 8 устройства для определения интенсивности светового потока. На фиг. 2 представлена принципиальная электрическая схема устройства для измерения интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки (5 - источник света; 6 - стабилизированный источник питания; 7 - переменный резистор; 8 - фотоприемник; 9 - измерительный прибор). Измеряется интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованные участки желатинового слоя фотопластинки 1. Активность фермента определяется по формуле A = (1
V)/t, где A - активность фермента, I - интенсивность светового потока (е), V - объем ферментного раствора (мкл), t - время протеолиза (мин). Единица измерения активности фермента - eмкл/мин. На фиг. 3 представлена зависимость активности фермента проназы от его концентрации (10 - фотография фотопластины с гидролизованными участками желатины; 11 - график зависимости интенсивности светового потока от концентрации фермента проназы). По оси абцисс - C - концентрация фермента (мкг/мл), по оси ординат - I - интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового слоя (e). В таб. 1 приведены показатели активности проназы в зависимости от концентрации. На фиг. 4 представлена зависимость активности фермента трипсина от его концентрации (12 - фотография фотопластины с гидролизованными участками желатины; 13 - график зависимости интенсивности светового потока от концентрации фермента трипсина). По оси абцисс - C - концентрация фермента (мкг/мл), по оси ординат - I - интенсивность светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового слоя (е). В таб. 2 приведены показатели активности трипсина в зависимости от концентрации. На фиг. 5 представлены данные по определению активности протеиназ из различных источников (14 - пшеница (сорт Жница), зараженная пыльной головней; 15 - гречиха Казанская; 16 - протеиназы Fusarium sp.). В таб. 3 приведены показатели активности желатингидролизующих ферментов из различных источников. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных условиях гидролизует площадь слоя желатины, размер которой соответствует повышению интенсивности светового потока на 1%.Формула изобретения
Способ определения активности протеолитических ферментов, заключающийся в нанесении на необработанную фотопластинку с желатиновым покрытием пробы ферментного раствора и определении активности фермента после прекращения реакции фермент-субстратного взаимодействия, отличающийся тем, что пробу ферментного раствора вносят в лунку, вырезанную в слое агарозного геля, которым покрывают фотопластинку, а активность фермента определяют по интенсивности светового потока, проходящего через гидролизованный участок желатинового покрытия.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7
Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к способам определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в биологическом материале: в крови и в моче
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и проведению биохимических исследований
Изобретение относится к медицине, в частности неонатологии, неврологии
Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано для прогноза развития специфического процесса у впервые выявленных больных с ограниченным по протяженности легочным туберкулезом без бацилловыделения
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии
Способ определения активности лизоцима слюны // 2170932
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для исследования функциональной деятельности слюнных желез и протективных свойств слюны при различных патологических процессах в ротовой полости, а также для изучения влияния гигиенических средств ротовой полости и пищевых продуктов на антимикробные свойства слюны с целью оценки качества употребляемой продукции
Изобретение относится к способам оценки антиокислительной активности (АОА) биологически активных веществ (БАВ) и может найти применение в фармации и пищевой промышленности
Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике
Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для повышения эффективности и качества диагностики с целью проведения своевременного и адекватного лечения
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к ветеринарии
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и проведению биохимических исследований
Изобретение относится к медицине
Изобретение относится к медицине, в частности неонатологии, неврологии
Способ определения концентрации кальция в сыворотке крови и других биологических жидкостях // 2172491
Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике
Способ диагностики множественной миеломы // 2172489
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии
Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии
Изобретение относится к способу иммобилизации олигонуклеотидов в полимерных гидрогелях, в том числе в полиакриламидном геле, при котором проводят сополимеризацию олигонуклеотидов, модифицированных непредельными группами, общей формулы I с непредельными мономерами, составляющими основу получаемого гидрогеля
