Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа

 

Изобретение относится к способу иммобилизации олигонуклеотидов в полимерных гидрогелях, в том числе в полиакриламидном геле, при котором проводят сополимеризацию олигонуклеотидов, модифицированных непредельными группами, общей формулы I с непредельными мономерами, составляющими основу получаемого гидрогеля. Также изобретение относится к модифицированным олигонуклеотидам формулы I, в которой R¹, R², R³ представляют собой Н, алкил С₁-С₆, Ph, PhCH₂-; Z представляет собой (СН₂)_nСН(СН₂ОН)СН₂ОХ, где n=1-6; или (СН₂)_n-ОХ, где n=2-6; и Х представляет собой фосфодиэфирную группу, связывающую непредельный фрагмент с 5'- и/или 3'-концом олигонуклеотида, R⁴ представляет собой Н, (СН₂)_nОН, где n=2-6; Y представляет собой (р-С₆Н₄)_n, где n=0-2. Олигонуклеотиды модифицируют с помощью фосфоамидита общей формулы II, где R¹, R² и Y такие, как в формуле I, R³ представляет собой алкил С₁-С₆, R⁴ представляет собой Н, (СН₂)_n-ОДМТ, где n=2-6; или путем ацилирования олигонуклеотида, содержащего аминолинк, активированным эфиром непредельной кислоты. Технический результат - высокая степень иммобилизации олигонуклеотидов в полимерном гидрогеле при формировании микрочипа. 2 с. и 16 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биоорганической химии и рассматривает олигонуклеотиды, модифицированные непредельными группами, способными вступать в реакцию сополимеризации с непредельными мономерами при формировании полимерных гидрогелей, а также способы их синтеза и способ проведения сополимеризации. Изобретение также относится к способу иммобилизации олигонуклеотидов в гидрогелях, получаемых полимеризацией непредельных мономеров акриламида и бис-акриламида, или любых других мономеров на их основе, находящему применение при изготовлении биологических микрочипов, использующихся в молекулярной биологии для секвенирования и картирования ДНК, детектирования мутаций и целого ряда медицинских приложений.

Уровень техники Известны два способа иммобилизации модифицированных непредельньми группами олигонуклеотидов в гидрогеле.

Первый способ состоит в сополимеризации олигонуклеотида с присоединенным через фосфоамидную связь N-алкилзамещенным метакриламидным остатком (Acrydite^ТМ) с акриламидом и бисакриламидом. Данный реагент производится фирмой Mosaic Technologies [F. N. Rehman, M. Audeh, E. S. Abrams, P. W. Hammond, M. Kenney and T. C. Boles, Nucleic Acids Research, 1999. V.27, N 15, P. 649-655] и позволяет вводить метакриламидную группу в олигонуклеотид по 5'-концу в автоматическом режиме синтеза.

Данный способ имеет ряд ограничений. Несмотря на то, что метакриламидная группа устойчива как в кислой так и в щелочной областях pH фосфоамидная связь, выбранная авторами для связывания метакриламидного фрагмента с олигонуклеотидом, ограничивает область использования олигонуклеотидов с такого рода модификацией только рамками нейтральной и слабощелочной среды. Известно, что фосфоамидная связь неустойчива в кислой среде [N. N. Preobrazhenskaya, Russ. Chem. Rev., 1972, 41, P.54; Chanley J.D., Feageson E., J.Am. Chem.Soc., 1965, 87, P.3199; Glark V.M., Kirby G.W., Todd A.R., J.Chem.Soc., 1957, P.1497]. Поскольку олигонуклеотиды являются поликислотами, то хранение водных растворов таких олигонуклеотидов приводит, как правило, к отщеплению непредельной группы и как следствие этого к утрате способности вступать в реакцию сополимеризации. В связи с этим фирма изготовитель предлагает хранить олигонуклеотиды в сухом виде при -20^oC, что сильно ограничивает рамки использования этих производных. Так, при изготовлении олигонуклеотидных микрочипов неизбежно будет возникать проблема хранения и многократного использования библиотеки олигонуклеотидов.

Таким образом, кислотолабильность фосфоамидной связи в модифицированных олигонуклеотидах выпускаемых под маркой Acrydite^ТМ резко ограничивает область их применения.

Другим недостатком данного способа является введение непредельной группы только по 5'- концу синтезированного олигонуклеотида.

Второй описанный способ [Vasiliskov A.V., Timofeev E.N., Surzhikov S.A., Drobyshev A. L. , Shick V. V., Mirzabekov A.D., BioTechniques 1999,27, P. 592-606] устраняет некоторые недостатки первого, а именно предлагает использовать аллильные производные олигонуклеотидов, что повышает устойчивость модифицированных олигонуклеотидов к изменениям pH растворов и, тем самым, снимает ограничения, накладываемые на первый способ.

Недостатком данного способа является низкое сродство аллильного фрагмента к акриламиду и бисакриламиду в реакции сополимеризации при иммобилизации олигонуклеотида в акриламидном гидрогеле. Так, например, при изготовлении олигонуклеотидных микрочипов, в сравнении с первым способом требуется огромный избыток олигонуклеотида. Такой способ безусловно является гораздо более дорогостоящим.

Сущность изобретения Сущность изобретения заключается в том, что олигонуклеотиды модифицируются различными непредельными группами, имеющими высокое сродство с непредельным мономером, составляющим основу формируемого гидрогеля (например, акриламидом, метакриламидом или любым другим мономером на их основе), позволяющими проводить эффективную иммобилизацию полученных модифицированных олигонуклеотидов в гель при непосредственном изготовлении микрочипа.

Синтетические олигонуклеотиды общей формулы [1]: где R¹, R², R³ представляет собой H, алкил С₁-C₆, Ph, PhCH₂-; Z представляет собой (CH₂)_nCH(CH₂OH)CH₂OX, где n=1-6; или (CH₂)_n-OX, где n= 2-6; и X представляет собой фосфодиэфирную группу, связывающую непредельный фрагмент с 5'- и/или 3'-концом олигонуклеотида; R⁴ представляет собой H, (CH_{2 n}ОН, где n=2-6; Y представляет собой (p-C₆H₄)_n, где n= 0-2; DNA/RNA представляет собой одноцепочечный фрагмент олигонуклеотидов дезокси- и риборяда, полученный на автоматическом синтезаторе по стандартной фосфорамидитной химии; двухцепочечный фрагмент DNA, полученный в условиях полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием синтетических праймеров с концевой непредельной группой; одноцепочечный фрагмент DNA, полученный в условиях ассиметрической полимеразной цепной реакции с использованием синтетических праймеров с концевой непредельной группой, получают с помощью соответствующего фосфоамидитного твердофазного синтеза или ацилирования синтезированного олигонуклеотида, содержащего аминолинк, активированным эфиром непредельной кислоты в поставтоматическом режиме. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды иммобилизуют в акриламидном геле с помощью реакции радикальной сополимеризации.

Задача настоящего изобретения состоит в разработке способа иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих различные непредельные группы, имеющие высокое сродство с непредельным мономером, составляющим основу формируемого гидрогеля (например, акриламидом, метакриламидом или любым другим мономером на их основе) и устойчивых в условиях их использования и хранения.

В настоящем изобретении предложено использование ряда алкил(арил) замещенных акриламидных и стирольных фрагментов, имеющих высокое сродство к акриламиду в реакции сополимеризации и способ их введения в олигонуклеотид:
использование в автоматическом режиме синтеза фосфоамидита, отличающегося от коммерческого Acrydite^ТМ типом связи фосфора с непредельной группой (в данном случае Р-О), что обуславливает значительную устойчивость получаемых продуктов в кислой области pH.

введение способом активированных эфиров непредельнх групп в поставтоматическом режиме.

В автоматическом режиме введение непредельных соединений в синтетический олигонуклеотид осуществляется с помощью соответствующего фосфоамидита [Froehler B.C., Matteucci M.D., Nucleic Acids Res. 1983, 11, P. 8031-8036]. Например, замещенный N-гидроксиалкилметакриламид может быть превращен в соответствующий фосфоамидит в реакции 2-O-цианоэтил-N,N,N',N'- тетраизопропилфосфодиамидитом в ацетонитриле в присутствии тетразола. Полученный реагент в виде 0.1 М раствора в ацетонитриле используют без выделения в стандартных условиях.

В общем случае для модификации олигонуклеотидов может быть использован фосфоамидит (формулы [II]:

где R¹, R² представляет собой H, алкил С₁-С₆, Ph-,PhCH₂-;
R³ представляет собой алкил С₁-С₆;
R⁴ представляет собой H, (CH₂)_n-ОДМТ, где n=2-6;
Y представляет собой (р-C₆H_{4 n} где n=0-2; n=2-6;
с типом связи фосфора с непредельной группой Р-О.

В поставтоматическом режиме введение непредельного остатка в олигонуклеотид осуществляется в результате реакции 4- нитрофенилового эфира соответствующей кислоты с синтезированным олигонуклеотидом, содержащим аминолинк, по 5'- и (или) 3'-концу. 4-Нитрофениловые эфиры непредельных кислот получают в реакции с 4- нитрофенолом в присутствии дициклогексилкарбодиимида.

Способ иммобилизации олигонуклеотидов с непредельными фрагментами реализован в варианте фотополимеризации под действием УФ-излучения. Нанесение полимеризационной смеси проводится капельным способом: капли наносят на предварительно модифицированное стекло и проводят полимеризацию. Нанесение проводят либо с помощью микрошприца, либо с помощью автоматического робота для нанесения микрокапель [Froehler B. C., Matteucci M.D., Nucleic Acids Res. 1983, 11, P. 8031-8036, G.Yershov, V.Barsky, A.Belgovskiy, E.Kirilov, E.Kreindlin, l. lvanov, S.Parinov, D.Guschin, A.Drobishev, S.Dubiley, A.Mirzabekov. Proc.Natl.AcadSci.USA. 1996, V.93, P.4913-4918], позволяющего наносить капли объемом порядка 1 нл.

Заявляемый способ позволяет получать гелевые матрицы, содержащие иммобилизованные олигонуклеотиды с высокой степенью иммобилизации в зависимости от использованной непредельной группы.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Приведенные далее примеры являются предпочтительными, предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не должны стать основанием для ограничения объема притязаний Заявителя. Специалист в данной области техники без труда найдет возможности иных воплощений изобретения, которые безусловно подпадают под притязания Заявителя, отраженные в формуле изобретения, приводимой ниже.

Пример 1. Синтез фосфоамидита, содержащего метакриламидный остаток.

В качестве примера синтеза фосфоамидита, содержащего метакриламидный остаток, приведен синтез N-метакрил-O-(2-O- цианоэтил-N,N'- диизопропиламинофосфит)этаноламина согласно схеме 1. (Приведена в конце описания).

Синтез N-гидроксиэтилметакриламида.

4-Нитрофениловый эфир метакриловой кислоты (0.300 г, 1.45 ммоль) растворяли в ацетонитриле (20 мл). К раствору приливали этаноламин (0.182 г, 2.98 ммоль) и оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали. Продукт очищали хроматографией на колонке с силикагелем (элюент: ацетон-петролейный эфир 3:2). Выход 83%. Масло. R_f=0.41 (в системе ацетон-петролейный эфир 3:2).

Синтез N-метакрил-O-(2-O-цианоэтил-N,N-диизопропиламино-фосфит)этаноламина
N-Гидроксиэтилметакриламид (0.013 г, 0.101 ммоль) растворяли в ацетонитриле (0.266 мл). К раствору добавляли 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфоамидит (0.030 г, 0.101 ммоль) и 0.4 М раствор тетразола в ацетонитриле (0.255 мл). Раствор перемешивали 30 минут и отфильтровывали. К фильтрату прибавляли ацетонитрил (0.479 мл). Полученный 0.1 М раствор фосфоамидита непосредственно использовали в автоматическом синтезе олигонуклеотидов.

Пример 2. Синтез олигонуклеотида-CAACTGAT с 3'-концевой акриламидной группой.

В качестве примера синтеза олигонуклеотида с 3'-концевой акриламидной группой приведен синтез 5'-СААСТGАТ-3'- (CH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₃CH₂NHC(O)- CH= CH₂) согласно схеме 2. (Приведена в конце описания).

Синтез 4-нитрофенилового эфира акриловой кислоты
Акриловую кислоту (0.850 г, 11.79 ммоль) растворяли в этилацетате (7 мл) и при перемешивании приливали раствор 4-нитрофенола (1.804 г, 12.97 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (2.680 г, 12.97 ммоль) в этилацетате (14 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат охлаждали до -70^oC и выпавшие кристаллы нитрофенилового эфира отфильтровывали. Фильтрат упаривали вдвое и вновь охлаждали до -70^oC. Кристаллы, полученные в двух порциях, высушивали при комнатной температуре и давлении 3 мм рт.ст.

Выход 87%. Т_пл=142-143^oC.

Синтез 5'-CAACTGAT-3'-(CH₂CH(CH₂OH(CH₂)₃CH₂NHC(O)-CH=CH₂)
К раствору олигонуклеотида 5'-СААСТGАТ-3'-(CH₂CH- (CH₂OH)(CH₂)₃CH₂NH₂ (21.7 нмоль) в боратном буфере (0.050 мл) с pH 9.53 приливали раствор 4-нитрофенилового эфира акриловой кислоты (0.40 мг, 2170 нмоль) в диметилформамиде (0.100 мл). Полученный гомогенный раствор выдерживали при 35^oC 12 часов. Затем гель-фильтрацией на сорбенте Sephadex-G25, с использованием в качестве элюента деионизированной воды, отделяли олигонуклеотидную фракцию от низкомолекулярных компонентов.

Олигонуклеотид очищали с помощью ВЭЖX на приборе Gilson (США), колонка Supelco 4,6х250 мм, в системе элюентов: буфер А - 0,05М триэтиламмоний ацетат, буфер Б - 50% ацетонитрила в буфере А, градиент от 0 до 50% буфера Б за 30 мин, детекция при длине волны λ = 260 нм. Время удерживания R_t 19 мин. Выход модифицированного олигонуклеотида составил 72%.

Пример 3. Фотоинициированная сополимеризация модифицированных олигонуклеотидов.

Оценку процента иммобилизации проводили по введенной в олигонуклеотид радиоактивной метке Р³².

Состав полимеризационной смеси соответствовал 5% полиакриламидному гелю: 5% акриламид-бисакриламид (19:1), 40% глицерин, 2% ацетон, 1,2% ТЕМЕД, 0,1 М натрий фосфатный буфер, pH 7,0. Концентрация меченого Р³² олигонуклеотида, 5'-P³²-GAAAGGTGGTGTTCTCTACGC- (CH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₃CH₂NHC(O)- С(CH₃)=CH₂)-3' составляла 1•10^-7M. Капли наносили с помощью микрошприца на стекло, предварительно обработанное Bind-Silan (3-(trimethoxysilyl)-propylmethacrylate). Объем капли 0,2 мкл. Полимеризацию проводили в УФ-печи (Stratolinker 1800-UV). Время экспозиции 20 мин при длине волны 254 нм. После проведения сополимеризации измеряли суммарный радиоактивный фон стекла с нанесенными каплями, который принимали за 100%. Далее проводили серию отмывок в различных условиях до постоянного значения радиоактивного фона и оценивали средний % иммобилизации олигонуклеотида, который составил 65-70%.

Пример 4. Оценка процента иммобилизации по интенсивности флуоресценции флуоресцентной метки, введенной в сополимеризуемый олигонуклеотид.

Для определения % иммобилизации олигонуклеотида был получен 5'-Flu-GAAAGGTGGTGTTCTCTACGC-(CH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₃CH₂NHC(O)-CH= CH₂)-3'. Флуоресцеин вводили на 5'-конец последовательной обработкой Т4- полинуклеотидкиназой, ATPγS, 5-IAF (5- йодоацетамидофлуоресцеин), с последующими экстракциями фенол/хлороформом, бутанолом и очисткой HPLC. Полученный гомогенный продукт вводили в сополимеризационную смесь, стандартную для 5% полиакриламидного геля, и проводили полимеризацию в условиях, указанных в примере 3. Оценку % иммобилизации проводили аналогично определению % иммобилизации для меченного по 5'-концу радиоактивным изотопом фосфора (Р³²): за 100% принимали среднюю флуоресценцию 1 капли после окончания полимеризации. После отмывки в воде при 60^oC, 45 мин повторно измеряли интенсивность флуоресценции и определяли средний % иммобилизации, который составил 60^oC. Результаты приведены на фиг. 1.

Пример 5. Влияние введенной в олигонуклеотид непредельной группы на степень сополимеризации.

Оценка степени иммобилизации проводится по связыванию комплиментарных флуоресцентно меченных олигонуклеотидов в результате гибридизации.

Показано, что все модифицированные олигонуклеотиды имеют высокую степень связывания с комплиментарным олигонуклеотидом, меченым Texas Red, при этом однако интенсивность флуоресценции распределена в исследуемом ряду таким образом: акриламидная = метакриламидная > 3-фенилакриламидная > 4-винилбензамидная. Поскольку эксперимент проводили для всех перечисленных соединений в одинаковых условиях, а именно: равные исходные концентрации всех модифицированных олигонуклеотидов в сополимеризационной смеси, одинаковые условия проведения полимеризации и последующих отмывок геля, равная концентрация комплиментарного олигонуклеотида, полученные данные позволяют сделать вывод о реакционной способности перечисленных соединений в условиях проведения сополимеризации.

Пример 6. Гибридизация на микрочипе, полученном сополимеризацией модифицированного олигонуклеотида с 5% акриламидным гелем.

Нанесение проводили с помощью автоматического робота для нанесения микрокапель [Froehler B. C. , Matteucci M.D., Nucleic Acids Res. 1983, 11, P. 8031-8036, G. Yershov, V. Barsky, A.Belgovskiy, E.Kirilov, E.Kreindlin, l. lvanov, S.Parinov, D.Guschin, A.Drobishev, S.Dubiley, A.Mirzabekov. Proc.Natl. AcadSci. USA. 1996, V.93, P.4913-4918]. Наносимый объем капли соответствовал 1 нл. Концентрация 5'-CAACTGАТ- (CH₂CH(CH₂OH)-(CH₂)₃CH₂NHC(O)- CH= CH₂)-3' составляла 1•10^-6М. Концентрация комплиментарного олигонуклеотида, меченного по 5'-концу Texas Red, составляет 3•10^-6М. Результаты приведены на фиг. 2.

Пример 7. Синтез олигонуклеотидов с 3'- и 5'-концевой ненасыщенной группой.

Синтез олигонуклеотидов с 3'-концевой ненасыщенной группой, проводили согласно схеме 3. (Приведена в конце описания).

Образование целевого продукта в реакции ацилирования контролировали по данным HPLC (Rt), а брутто состав полученных олигонуклеотидов подтверждали методом MALDI-MS. (Таблица 1).

Олигонуклеотиды с 5'-концевой ненасыщенной группой синтезировали при использовании 0.1 М раствора фосфоамидита, полученного по методике,

приведенной в примере 1, на синтезаторе Biosystems 394DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City) в условиях стандартной фосфорамидитной химии. Образование целевого продукта контролировали по данным HPLC (Rt), а брутто состав полученных олигонуклеотидов подтверждали методом MALDI-MS. (Таблица 2).

Масс-спектры регистрировали на MALDI-MS спектрометре.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) проводили на колонке Supeico LC-18(5μm 4.6x250 mm) с использованием элюентной системы: А) 0.05М раствор триэтиламмоний ацетата; В) 0.05М раствор триэтиламмоний ацетата в 50% CH₃CH; градиент от 0 до 50% В) за 30 минут.

Эффективность стадии конденсации с использованием фосфоамидита (1) по данным высокоэффективной хроматографии (HPLC) составила более 92%.

Пример 8. Иммобилизация модифицированных непредельной группой олигонуклеотидов в различных гидрогелях на основе акриламида
Олигонуклеотид MAA-5'-GAACTGAG-3'-TexRed получали на автоматическом синтезаторе Biosystems 394DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City). Метакриламидную группу

вводили в олигонуклеотид с использованием 0.1М раствора фосфорамидита, полученного по методике, приведенной в примере 1, в условиях стандартной фосфорамидитной химии.

Олигонуклеотид в составе гелей для фотоиндуцируемой полимеризации: (A,B, C, D, E, F,G) наносили с помощью автоматического робота, охарактеризованного выше, на стекло, обработанное BindSilane, облучали УФ с λ= 312 нм и отмывали.

На фиг.3 представлена флуоресцентная картина микрочипа, полученного при иммобилизации в гидрогелях разного состава (A,B,C,D,E,F,G) олигонуклеотида структуры MAA-5'- GAACTGAG-3'-TexRed, с 5'-концевой метакриламидной группой (МАА) и флуоресцентной меткой на 3'-конце (TexRed). Эффективность иммобилизации олигонуклеотида в разных гелях определяли по величине флуоресцентного сигнала. Степень иммобилизации на разных гелях составила 30-60%.

Пример 9. Гибридизация меченых олигонуклеотидов с иммобилизованными в различных гидрогелях модифицированными непредельной группой олигонуклеотидами.

Для изготовления микрочипа синтезировали олигонуклеотиды МАА-GAACTGAG и MAA-CAACTGAC с 5'-концевой метакриламидной группой

(МАА) при использовании 0.1М раствора фосфоамидита, полученного по методике, приведенной в примере 1, на синтезаторе Biosystems 394DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City) в условиях стандартной фосфорамидитной химии. Полученные олигонуклеотиды добавляли в составе гелей для фотоиндуцируемой полимеризации наносили с помощью автоматического робота, охарактеризованного на стр.6, на стекло, обработанное BindSilane, облучали УФ с λ = 312 нм, отмывали и использовали для проведения гибридизационного анализа. Использовали гидрогели следующего состава: А{акриламид:N,N'-метиленбис-акриламид-Т10%, С5%, глицерин-64.5%} ; В {акриламид:N,N'-метиленбисакриламид-Т5%, С5%, глицерин-64.5%}, С {(акриламид+N- [трис(гидроксиметил)метил]акриламид(1:3)}
(N, N'-метиленбисакриламид+N, N'-(1,2-дигидроксиэтил-акриламид))(3: 7), Т5%, С25%; глицерин-64.5%}.

На фиг. 4 представлены результаты гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе с использованием иммобилизованных олигонуклеотидов структуры GAACTGAG и CAACTGAC и гибридизуемого олигонуклеотида структуры CTCAGTTC. Полученная гибридизационная картина соответствует теоретическим представлениям. Больший флуоресцентный сигнал наблюдается на иммобилизованном олигонуклеотиде-GAACTGAG, полностью комплиментарном гибридизуемой пробе, независимо от вида используемого геля и линкера, соединяющего метакриламидную группу с олигонуклеотидом. Меньший сигнал наблюдается на ячейках с иммобилизованным олигонуклеотидом CAACTGAC, содержащим концевые замены.

Пример 10. Иммобилизация модифицированных непредельной группой олигонуклеотидов в различных гидрогелях.

Олигонуклеотид в составе гелей для фотоиндуцируемой полимеризации (А,В) наносили с помощью автоматического робота, охарактеризованного выше, на стекло, обработанное BindSilane, облучали УФ с λ = 312 нм и отмывали. Эффективность иммобилизации олигонуклеотида определяли по величине флуоресцентного сигнала на чине до и после отмывки чипа. На фиг. 5 представлена флуоресцентная картина микрочипа, полученного при иммобилизации в гидрогелях разного состава (А, В) олигонуклеотида: МАА-5'- GAACTGAG-3'-TexRed, с 5'-концевой метакриламидной группой (МАА) и флуоресцентной меткой на 3'-конце (TexRed). Процент иммобилизованного олигонуклеотида составил в геле А-75-80%, в В-68-76%.

Данный пример показывает, что олигонуклеотиды с концевой ненасыщенной группой можно эффективно иммобилизовывать не только в гидрогелях на основе акриламида и N,N'-метилен бисакриламида, но и на основе любых других водорастворимых мономеров, способных эффективно сополимеризоваться с концевой ненасыщенной группой олигонуклеотида.

Формула изобретения

1. Способ иммобилизации олигонуклеотидов в полимерных гидрогелях, включающий сополимеризацию модифицированных олигонуклеотидов с непредельными мономерами при формировании полимерных гелей, в котором высокая степень иммобилизации достигается путем использования модифицированных непредельными группами олигонуклеотидов общей формулы I

где R¹, R², R³ представляют собой Н, алкил С₁-С₆, Ph, PhCH₂-;
Z представляет собой (СН₂)_nСН(СН₂ОН)СН₂ОХ, где n=1-6; или (СН₂)_n-ОХ, где n= 2-6, и Х представляет собой фосфодиэфирную группу, связывающую непредельный фрагмент с 5'- и/или 3'-концом олигонуклеотида;
R⁴ представляет собой Н, (СН₂)_nОН, где n=2-6;
Y представляет собой (р-С₆Н₄)_n, где n=0-2.

2. Способ по п.1, в котором полимерный гидрогель представляет собой полиакриламидный гель, получаемый сополимеризацией непредельных мономеров акриламида и бис-акриламида, или любых других мономеров на их основе.

3. Способ по п.1, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами в автоматическом режиме.

4. Способ по п.3, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами с помощью фосфоамидита общей формулы II

где R¹, R² представляют собой Н, алкил С₁-С₆, Ph, PhCH₂-;
R³ представляет собой алкил С₁-С₆;
R⁴ представляет собой Н, (СН₂)_n-ОДМТ, где n=2-6;
Y представляет собой (р-С₆Н₄)_n, где n=0-2,
n=2-6;
с типом связи фосфора с непредельной группой Р-О.

5. Способ по п.1, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами в поставтоматическом режиме.

6. Способ по п.5, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами путем ацилирования олигонуклеотида, содержащего аминолинк, активированным эфиром непредельной кислоты.

7. Способ по п. 6, в котором активированный эфир непредельной кислоты представляет собой нитрофениловый эфир.

8. Способ по п.3 или 5, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами по 5'-концу олигонуклеотида.

9. Способ по п.3 или 5, в котором олигонуклеотиды модифицируют непредельными группами по 3'-концу олигонуклеотида.

10. Способ по п.1, в котором олигонуклеотиды иммобилизуют путем фотосополимеризации под действием УФ-излучения.

11. Способ по п. 10, в котором фотосополимеризацию проводят капельным способом путем нанесения капель на предварительно модифицированное стекло.

12. Способ по п.11, в котором капли наносят с помощью микрошприца.

13. Способ по п.12, в котором объем капель составляет около 0,2 мкл.

14. Способ по п.11, в котором капли наносят с помощью автоматического робота для нанесения микрокапель.

15. Способ по п.14, в котором объем капель составляет около 1 нл.

16. Олигонуклеотид, модифицированный непредельными группами общей формулы I

где R¹, R², R³ представляют собой Н, алкил С₁-С₆, Ph, PhCH₂-;
Z представляет собой (СН₂)_nСН(СН₂ОН)СН₂ОХ, где n=1-6; или (СН₂)_n-ОХ, где n= 2-6, и Х представляет собой фосфодиэфирную группу, связывающую непредельный фрагмент с 5'- и/или 3'-концом олигонуклеотида,
R⁴ представляет собой Н, (СН₂)_nОН, где n=2-6;
Y представляет собой (р-С₆Н₄)_n, где n=0-2.

17. Олигонуклеотид по п. 16, модифицированный непредельной группой по 5'-концу.

18. Олигонуклеотид по п. 16, модифицированный непредельной группой по 3'-концу.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.03.2006        БИ: 09/2006

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ"

Договор № РД0060400 зарегистрирован 12.02.2010

Извещение опубликовано: 27.03.2010        БИ: 09/2010

* ИЛ - исключительная лицензия        НИЛ - неисключительная лицензия

---