Способ определения пероксидазной активности в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к медицине, а именно клинической лабораторной диагностике. Технический результат - повышение возможности определения суммарной функциональной активности внеклеточных пероксидаз различного происхождения и учет влияния на ход реакции свободных радикалов. Сущность: в лунки двух плоскодонных 96-ти луночных планшетов разливают исследуемую биологическую жидкость, в одну лунку вместо биологической жидкости наливают физиологический раствор, затем во все используемые лунки первого планшета добавляют субстратную смесь для пероксидазы, в лунки второго планшета добавляют раствор хромогена, который не содержит перекись водорода и через 5-10 мин добавляют по 50 мкл 10% серной кислоты и измеряют интенсивность окраски на плашечном фотометре при длине волны 492 нм. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических жидкостях.

Пероксидаза - фермент, который наряду с перекисью водорода и окисляемыми кофакторами - ионами галогенов (ионы хлора, йода, брома) входит в состав пероксидазной системы клеток (Роговин В.В. с соавт., 1977). Обладает мощной каталитической активностью, восстанавливая перекись водорода до супероксидного и гидроксильного радикалов и синглентного кислорода, способствует окислению органических соединений (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995). Пероксидазная система присутствует практически во всех клетках организма и обеспечивает различные функции - переваривающие свойства фагоцитирующих клеток (антимикробная функция), совместно с антиоксидантной системой регулирует активность ферментов клеточных мембран клеток организма путем изменения свойств липидов (регуляторная функция), способствует уничтожению в клетках экзогенных и эндогенных чужеродных и вредных продуктов (детоксикационная функция). При дегрануляции фагоцитов (в процессе фагоцитоза) или повреждении паренхиматозных клеток (воспаление, травма и т.д.) компоненты пероксидазной системы (пероксидаза, свободные радикалы, перекись водорода и т.д.) попадают во внеклеточное пространство, способствуя осуществлению переваривания микроорганизмов, расположенных внеклеточно (окислительный фагоцитоз), повреждая при этом и собственные клетки окружающих тканей (Серов В.В., Паукова B.C., 1995). Каталитическая активность пероксидазы зависит от трехмерной структуры (конформации) белка, которая легко нарушается или даже разрушается под влиянием тепловой энергии или при присоединении к ферменту другой молекулы (Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./ Под ред. Т.Нго и Г.Ленхоффа // М.: Мир, 1988.-446 с. (С.12)).

Известны способы определения активности пероксидазы в фагоцитирующих клетках цитохимическим методом - определение количества клеток, положительно реагирующих на бензидиновую пробу (Славинский А.А., Никитина Г.В. Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов: миелопероксидаза // Клин. лаб. диаг. -2000.-. - С.21-24). Во внеклеточном пространстве (биологические жидкости) количественное определение пероксидазы (миелопероксидазы) проводится иммуноферментным методом (Тырнова Е.В. Антимикробные белки нейтрофильных гранулоцитов при хронических воспалительных заболеваниях слизистых оболочек ЛОР-органов // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 1999.- 23 с.).

Прототипом данного изобретения является способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит разрушение клеток фагоцитарно-макрофагального ряда с последующим взаимодействием внутриклеточной миелопероксидазы с субстратом для пероксидазы (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология // М.: Изд-во ВНИРО, 1995.- С.126-128).

Однако в данном способе не учитывается влияние имеющихся свободных радикалов на ход реакции и невозможно определение суммарной функциональной активности внеклеточной пероксидазы, попадающей в биологическую жидкость из различных клеток.

Технический результат - повышение функциональной значимости исследования, а именно возможность определения суммарной функциональной активности внеклеточных пероксидаз различного происхождения и учет влияния на ход реакции свободных радикалов.

Предлагаемый способ определения пероксидазной активности в биологических жидкостях основан на способности пероксидазы окислять ортофенилендиамин в присутствии перекиси водорода при pН 5,0 и изменять окраску субстратной смеси от бесцветного до различной интенсивности желто-коричневого цвета в зависимости от количества функционально активного фермента (Иммуноферментный анализ: Под ред. Т.Нго и Г.Ленхоффа, 1988).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: исследование биологической жидкости проводят с учетом возможного влияния на ход реакции уже имеющихся свободных радикалов кислорода, попавших в биологическую жидкость из разрушенных клеток вместе с другими компонентами пероксидазной системы, оценивают реакцию параллельно с использованием двух плоскодонных 96-ти луночных планшетов, при этом первый планшет используется для определения активности пероксидазной системы, второй планшет - для определения свободнорадикальной активности. В лунки первого и второго плоскодонных 96-ти луночных планшетов разливают по 100 мкл исследуемой биологической жидкости (желательно в дублях), в одну лунку вместо биологической жидкости наливают 100 мкл физиологического раствора (контрольная лунка для определения фона реакции), затем во все используемые лунки первого планшета добавляют по 100 мкл субстратной смеси для пероксидазы, которая состоит из раствора хромогена (2 мг ортофенилендиамина, растворенного в 10 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0), и перекиси водорода (конечная концентрация 0,02%), в лунки второго планшета добавляют по 100 мкл раствора хромогена, который не содержит перекись водорода (2 мг ортофенилендиамина, растворенного в 10 мл цитратно-фосфатного буфера, pН 5,0), и через 5-10 мин в зависимости от интенсивности окрашивания субстратной смеси в лунках первого планшета и раствора хромогена в лунках второго планшета при сравнении с соответствующими контрольными лунками останавливают реакцию во всех лунках, добавляя по 50 мкл 10%-ной серной кислоты, и измеряют интенсивность окраски на плашечном фотометре при длине волны 492 нм.

Полученные результаты выражают в условных единицах, рассчитанных по формуле ПОА=[(ОПо₁-ОПк₁)-(ОПо₂-ОПк₂)] х 1000 (у.е.), где ПОА - пероксидазная активность в исследуемой биологической жидкости; ОПо₁ - оптическая плотность в лунке с исследуемой биологической жидкостью в первом планшете; ОПо₂ - оптическая плотность в лунке с исследуемой биологической жидкостью во втором планшете; ОПк₁ - оптическая плотность в контрольной лунке первого планшета; ОПк₂ - оптическая плотность в контрольной лунке второго планшета; 1000 - произвольный коэффициент перерасчета для получения целых чисел.

Предлагаемым способом определения пероксидазной активности в биологических жидкостях было проведено исследование промывной жидкости, полученной через трансназальный катетер путем промывания 10 мл физиологического раствора воспаленной околоносовой пазухи у 5 больных хроническим гнойным риносинуситом (ХГРС). Для исследования использовали надосадок промывной жидкости, образованный после десятиминутного центрифугирования при 1500 об./ мин.

Кроме того, учитывая, что аскорбиновая кислота и двухвалентное железо в организме человека также способны взаимодействовать с перекисью водорода, но значительно с меньшей степенью активности, чем пероксидаза, параллельно изучали влияние растворов аскорбиновой кислоты (50 мг/мл) и двухвалентного железа (10 мг/мл) на перекись водорода субстратной смеси. Для оценки активности пероксидазы паренхиматозного происхождения использовали модель, характеризующую состояние внеклеточного пространства после повреждения паренхиматозных клеток, представленных раствором, содержащим гемолизированные эритроциты человека, для чего готовили 20%-ный раствор отмытых эритроцитов человека на дистиллированной воде.

Полученные результаты исследования приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, аскорбиновая кислота и двухвалентное железо в данной субстратной смеси не окисляют хромоген. Незначительные значения оптической плотности в лунках с раствором двухвалентного железа объясняются мутностью исследуемого раствора (нерастворимый осадок). В промывных жидкостях больных ХГРС, полученных из воспаленных пазух, свободнорадикальная активность практически не выявлялась, что возможно объясняется быстрым реагированием свободных радикалов в очаге воспаления. При этом показатели пероксидазной активности свидетельствуют о большом разбросе их значений от 0 до 2975 у.е. Оценка модели повреждения паренхиматозных клеток свидетельствует о значительной внеклеточной пероксидазной активности.

Предлагаемым способом определения активности пероксидазы было проведено исследование промывной жидкости, полученной через трансназальный катетер путем промывания 10 мл физиологического раствора воспаленной околоносовой пазухи у 50 больных хроническим гнойным риносинуситом (ХГРС). Для исследования использовали надосадок промывной жидкости, образованный после десятиминутного центрифугирования при 1500 об./ мин. Оценка результатов исследования показала большой разброс в значениях активности ПОА - от 0 до 3441 у.е.

Пример 1.

Больная Габдулхакова Ф. Ш. , 1948 года рождения (история болезни N 111747), 2 декабря 1999 года поступила в ЛОР- отделение РКБ им. Г.Г. Куватова с жалобами на головную боль в области лба, кашель, чихание, выделения из носа в течение 10 дней. Проведенное ранее лечение - прием бромгексина. Объективно: дыхание затруднено, выделения слизисто-гнойные, слизистые покровы носа гиперемичны, отечны (II-III степени), результаты рентгенографии - тотальное затемнение обеих верхнечелюстных пазух. Из анамнеза установлено, что болеет около 13 лет с периодическими обострениями. Поставлен диагноз: двусторонний хронический гнойный пансинусит.

3 ноября 1999 г. при пункции верхнечелюстной пазухи получен гной, соустье проходимо. С 3 по 8 ноября проведено лечение, включающее в себя промывание пазухи физиологическим раствором с последующим орошением воспаленной полости раствором беталейкина. 9 ноября состояние больной хорошее, при пункции верхнечелюстной пазухи соустье проходимо, промывная жидкость прозрачная. Слизистые покровы носа - розовые. Результат лечения оценивается как отличный (улучшение клинических проявлений со 2-го дня лечения, к 5-му дню - выздоровление).

Исследование пероксидазной активности в промывной жидкости в динамике: 3 ноября - ПОА=2826 у.е., 4 ноября - 548 у.е., 9 ноября - 680 у.е.

Оценка результатов исследования пероксидазной активности в промывной жидкости показала, что у больной Габдулхаковой Ф.Ш. до лечения имело место значительное повышение пероксидазной активности, что коррелировало с состоянием слизистых покровов (отек, гиперемия), в процессе лечения значения пероксидазной активности снизились и сопоставлялись с клиническими данными (постепенное снижение отечности слизистых).

Пример 2.

Больной Семенов В.Н., 1982 года рождения (история болезни N 111379), 22 октября 1999 года поступил в ЛОР-отделение РКБ им. Г.Г. Куватова с жалобами на выделения из носа и затрудненность дыхания. Проведенное лечение - местное применение сосудосуживающих препаратов. Объективно: выделений нет, слизистые покровы носа синюшного цвета, отечны (I степень), результаты рентгенографии - вуаль левой верхнечелюстной пазухи. Из анамнеза установлено, что болеет около 3 лет с периодическими обострениями. Поставлен диагноз: левосторонний хронический гнойный верхнечелюстной синусит.

25 октября 1999 г. при пункции верхнечелюстной пазухи соустье труднопроходимо (отек I степени), промывная жидкость мутноватая, пазуха катетеризирована. С 25 по 28 октября проведено лечение, включающее в себя промывание пазухи физиологическим раствором с последующим орошением воспаленной полости раствором беталейкина. 27 октября промывная жидкость еще содержала в себе кусочки гноя и примесь крови. 29 октября - состояние больного хорошее, при пункции верхнечелюстной пазухи соустье проходимо, промывная жидкость с примесями крови вследствие травматизации слизистых катетером. Слизистые покровы носа - отечные, застойные. Катетер удален. 30 октября - уменьшение отечности слизистых носа. Результат лечения оценивается как отличный (улучшение клинических проявлений со 2-го дня лечения, на 3 день - обострение в виде усиления отека слизистых, к 5-му дню - выздоровление).

Исследование пероксидазной активности в промывной жидкости в динамике: 25 октября - ПОА=235 у.е., 26 октября - 158 у.е., 27 октября - 479 у.е., 28 октября - 2785 у.е.

Оценка результатов исследования пероксидазной активности в промывной жидкости показала, что у больного Семенова В.Н. до лечения отмечалась незначительная активность внеклеточной пероксидазы, в процессе лечения ее уровень возрастал до высоких значений, что отражало состояние слизистых покровов - повреждение ее целостности катетером.

Формула изобретения

Способ определения пероксидазной активности в биологических жидкостях путем окисления субстратной смеси для пероксидазы, состоящей из раствора ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере в присутствии перикиси водорода, в 96-ти луночном плоскодонном планшете и измерения интенсивности окраски, отличающийся тем, что исследуемую жидкость разливают в лунки двух планшетов, при этом для определения фона реакции в контрольные лунки в равном объеме наливают физиологический раствор, затем в используемые лунки первого планшета добавляют в равном объеме субстратную смесь для пероксидазы, а в лунки другого - раствор ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере и рассчитывают пероксидазную активность по формуле ПОА= [(ОП₀₁ - ОП_К1)-(ОП₀₂-ОП_К2)] • 1000 (у. е. ),
где ПОА - пероксидазная активность в исследуемой биологической жидкости;
ОП₀₁ - оптическая плотность в лунке с исследуемой биологической жидкостью в первом планшете;
ОП₀₂ - оптическая плотность в лунке с исследуемой биологической жидкостью во втором планшете;
ОП_К1 - оптическая плотность в контрольной лунке первого планшета;
ОП_К2 - оптическая плотность в контрольной лунке второго планшета;
1000 - произвольный коэффициент перерасчета для получения целых чисел.

РИСУНКИ

Рисунок 1