Иммуномодулирующее средство и способ его получения

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармации. Предложено иммуномодулирующее средство на основе лектинов чины посевной при экстракции семян водным аммоний-ацетатным буфером и способ его получения. Указанное средство успешно используют в терапии рака. 2 с.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к фитопрепарату, который может найти применение в качестве иммуномодулятора при терапии рака.

Известны сложные фитосборы, содержащие чину луговую, для лечения гриппа, простудных заболеваний, ожирения, неврозов и общего укрепления организма [1] .

Известен модулятор клеточного иммунитета, представляющий собой водный экстракт смеси листьев герани, сухих листьев подорожника, календулы [2].

Недостатком этого средства является, в частности, экстемпоральный способ приготовления и ограниченность способа, связанная с необходимостью использования свежих листьев.

Задача изобретения - новое фитосредство, обладающее иммуномодулирующей активностью, и способ его получения.

Указанная задача решается иммуномодулирующим средством, характеризующимся тем, что оно содержит лектины, полученные путем экстракции семян чины посевной (Lathyrus sativus L.) водным аммоний-ацетатным буфером.

Способ получения иммуномоделирующего средства заключается в том, что семена чины посевной измельчают, обезжиривают, высушивают, экстрагируют водным аммоний-ацетатным буфером, полученный экстракт фильтруют, супернатант обрабатывают сульфатом аммония, образовавшийся осадок отделяют, далее растворяют в воде, очищают и лиофильно высушивают.

Нижеследующие примеры иллюстрируют биологическую активность средства по изобретению и способ его получения.

150 г семян чины посевной размалывают в миксере и к муке прибавляют 300 мл гексана. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов в стеклянном стакане. Гексан отфильтровывают на воронке Бюхнера, а обезжиренную таким образом муку сушат на воздухе в вытяжном шкафу. Затем к обезжиренной и высушенной муке прибавляют 400 мл 0,05 М аммоний-ацетатного буфера рН 3,8. Смесь перемешивают при комнатной температуре 18 ч. Муку отфильтровывают на воронке Бюхнера на водоструйном насосе. Фильтрат центрифугируют при 8000 об./мин в течение 20 мин. Из прозрачного супернатанта осаждают белки при добавлении сульфата аммония (60% насыщения). Смесь выдерживают при 8^oС в течение 18 ч с целью формирования осадка - сульфата белка. После чего осадок центрифугируют при 8000 об. /мин в течение 20 мин. К осадку (сульфат белка) добавляют дистиллированнной воды до его растворения. Сумму лектинов обессоливают при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-25 (суперфайн) и лиофильно высушивают. Выход белкового продукта, содержащего лектины, составляет 1,2% (1,8 г).

Для первичной оценки биологической активности выделенных белков нами была исследована их гемагглютинирующая способность. Исследование проводилось на кроличьих эритроцитах как наиболее чувствительных к действию растительных лектинов. Концентрация белков в растворах определялась по методу Лоури с использованием БСА (бычий сывороточный альбумин) в качестве стандарта. Определение гемагглютинирующей активности проводили методом двойных разведений на плашках, в лунки которых вносили по 10 мкл тестируемого раствора белка с последующим прибавлением 10 мкл 4 об.% суспензии эритроцитов в физиологическом растворе [3]. Минимальное количество белка, вызывающее агглютинацию 4 об. % суспензии эритроцитов в лунке, принималось нами за агглютинирующую способность исследуемого лектина. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Исходя из представленных в таблице данных смесь белков (сырец), выделенных, из семян чины, обладает выраженной гемагглютинирующей активностью - 6,3 мкг вещества полностью агглютинирует 10 мкл 4% суспензии кроличьих эритроцитов. В тех же условиях Л-1 не проявляет никакой активности, а Л-2 агглитинирует эритроциты в разведении 0,0026 мг/мл или 0,26 мкг. При исследовании Л-3 показано, что этот белок также имеет некоторую агглютинирующую активность, однако этот эффект может быть обусловлен наличием примеси Л-2 из-за недостаточно полного деления на сефадексе G-75 sf.

Также производилась оценка иммуномодулирующего действия лектинов, выделенных из семян чины посевной. Для этого исследовали влияние лектинов на цитотоксический потенциал лимфоцитов доноров и способность последних высвобождать биорегуляторные пептиды - цитокины. Исследование модулирующего влияния на киллерную активность лимфоцитов проводили на клетках К-562 и АКЛ при соотношении 1:5. Результаты исследования представлены в табл. 2, 3.

Как следует из представленных данных в табл. 2, лектины, выделенные из семян чины посевной, повышают цитотоксичность лимфоцитов здоровых доноров, при этом отмечено повышение киллерных свойств при действии лектинов чины.

Из представленных в табл. 3 результатов следует, что лектины, выделенные из семян чины посевной, оказывают достоверное стимулирующее действие на спонтанную продукцию ИЛ-2 (интерлейкин), ИЛ-6, и ИНФ (интерферон-альфа).

Источники информации 1. Средство для фитокоррекции, патент 2089213, 1997 г.

2. Композиция ингредиентов для бальзама Алексеевой (фитомикс-40), патент 2099410, 1997 г.

3. Л.Розен. Методы вирусологии и молекулярной биологии. - М.: Мир, 1972 г., с. 224.

Формула изобретения

1. Иммуномодулирующее средство, характеризующееся тем, что оно содержит лектины, полученные путем экстракции семян чины посевной водным аммоний-сульфатным буфером.

2. Способ получения иммуномодулирующего средства, характеризующийся тем, что семена чины посевной измельчают, обезжиривают, высушивают, экстрагируют водным аммоний-ацетатным буфером, полученный экстракт фильтруют, супернатант обрабатывают сульфатом аммония, образовавшийся осадок отделяют, далее растворяют в воде, очищают и лиофильно высушивают.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3