Высокомеченные тритием 5- и 5-[4,5-3h]прегнан-3,20- дионы и способ их определения в плазме крови
Авторы патента:
Изобретение относится к органической и аналитической химии, к медицине и биологии. Синтезированы высокомеченные тритием 
-[4,5-3Н]прегнан-3,20-дион и 5
-[4,5-3H]прегнан-3,20-дион, которые использованы для определения этих метаболитов прогестерона в плазме крови. В анализируемую пробу плазмы крови вносят меченные тритием аналоги определяемых метаболитов прогестерона. В хлороформенный экстракт, помимо определяемых двух метаболитов, переходят иные метаболиты прогестерона и прогестерон, которые мешают определению. Их разрушают выдерживанием экстракта в присутствии перекиси водорода в щелочной среде. Оставшиеся в экстракте после этой обработки определяемые метаболиты переводят в дансильные производные, которые позволяют определять нанограммовые количества этих стероидов при анализе методом ВЭЖХ. По результатам определения содержания дансильных производных вычисляют содержание определяемых метаболитов в анализируемой плазме крови. Изобретение позволяет определять указанные метаболиты в плазме крови при их очень низкой концентрации. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Изобретение относится к органической и аналитической химии и может найти применение в медицине и биологии.
Стероидные соединения играют важную роль в процессах жизнедеятельности человека и животных. Одним из стероидных гормонов является прогестерон - соединение формулы I:
Важное участие в биохимических процессах принимают его метаболиты. Среди метаболитов прогестерона известны 5- и 5-прегнан-3,20-дионы (соединения общей формулы II и III соответственно): 
(Sigma 2000. Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук, с.348, 829) [1]. Известно, что 5- и 5-прегнан-3,20-дионы выполняют ряд функций, связанных с репродукцией живых организмов (Hodges Y.K. et all Biol.Reprod., 1997, v.56, 3, p.640) [2]. Однако данные метаболиты содержатся в крови в очень низких концентрациях. Для определения соединений, содержащихся в биологических жидкостях в нанограммовых и донанограммовых количествах, необходимо иметь меченые аналоги определяемых соединений. Меченые аналоги 5- и 5-прегнан-3,20-дионов не известны. Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение новых высокомеченных тритием соединений и их использование для определения содержания метаболитов прогестерона в плазме крови. Указанный технический результат достигается тем, что получены высокомеченные тритием 5- [4,5-3Н] прегнан-3,20-дион и 5-[4,5-3H]прегнан-3,20-дион. Указанный технический результат достигается также тем, что способ определения содержания в плазме крови метаболитов прогестерона, 5- прегнан-3,20-диона и 5-прегнан-3,20-диона заключается в том, что в анализируемую пробу плазмы крови вводят меченые аналоги определяемых метаболитов, обрабатывают пробу органическим растворителем, затем подвергают селективной деструкции перешедшие в экстракт прогестерон и другие ненасыщенные стероиды, которые сопутствуют определяемым, после чего оставшиеся в обработанном экстракте определяемые метаболиты и их меченые аналоги переводят в дансильные производные, содержание которых в обработанном экстракте определяют методом ВЭЖХ с использованием детекторов флюоресценции или поглощения и радиоактивности, а по полученным данным производят расчет содержания определяемых метаболитов в плазме крови. В качестве меченых аналогов метаболитов прогестерона в пробу плазмы крови вводят 5- [4,5-3H]прегнан-3,20-дион и 5-[4,5-3H]прегнан-3,20-дион. Для обработки анализируемой пробы плазмы крови в качестве органического растворителя используют хлороформ, а прекращают обработку после перехода в экстракт не менее 50% добавленных в пробу меченых аналогов определяемых метаболитов. Селективную деструкцию проводят путем выдерживания экстракта в присутствии перекиси водорода в щелочной среде. Щелочную среду создают добавлением в экстракт карбоната калия. На фиг.1 приведена хроматограмма реакционной смеси после восстановления С4= С5 связи в прогестероне газообразным тритием, с использованием детектора по УФ-поглощению (UV) и детектора по радиоактивности (Rad). На фиг. 2 представлена хроматограмма продуктов дансилирования прогестерона. Детектор по флуоресценции. На фиг.3 представлена хроматограмма продуктов дансилирования смеси прогестерона, 5- и 5-прегнан-3,20-дионов. Детектор по флюоресценции. На фиг. 4 представлена хроматограмма дансильных производных смеси 5- [4,5-3H] прегнан-3,20-дион и 5-[4,5-3H] прегнан-3,20-диона, предварительно обработанной перекисью водорода в щелочной среде. Детектор по флюоресценции и радиоактивности. На фиг.5 представлена хроматограмма смеси дансильных производных прогестерона, 5- и 5-прегнан-3,20-дионов, предварительно обработанных перекисью водорода в щелочной среде. На фиг. 6 представлена хроматограмма экстракта плазмы крови, в которую добавили по 1 мкКu 5- [4,5-3H]прегнан-3,20-диона и 5-[4,5-3Н] -прегнан-3,20-диона, с последующей обработкой перекисью водорода в щелочной среде и получением дансильных производных. Детекторы по флюоресценции и по радиоактивности. Собственные исследования показали, что при обработке плазмы крови хлороформом в него переходят прогестерон и его метаболиты, в том числе определяемые способом согласно определению - 5- и 5-прегнан-3,20-диона (соединения общей формулы II и III). Для того чтобы стало возможным определять в этой смеси только эти два метаболита прогестерона, способом согласно изобретению предусмотрена процедура деструкции содержащихся в хлороформенном экстракте самого прогестерона и иных его ненасыщенных метаболитов. Для этого на них воздействуют перекисью водорода в щелочной среде. Оказалось, что такая обработка приводит к селективной деструкции мешающих определению прогестерона и ряда его ненасыщенных метаболитов, но сохраняет метаболиты, определяемые способом согласно изобретению - соединения формулы II и III. Однако определение этих двух соединений методом ВЭЖХ затруднено отсутствием в их молекулах фрагментов с высоким оптическим поглощением, поэтому рекомендовано получить из них их дансильные производные, которые анализируют методом ВЭЖХ, а полученные данные используют для расчета содержания соединений формулы II и III в анализируемой плазме крови. Удобство работы с дансильными производными заключается в том, что при использовании флюоресцентного детектора можно надежно анализировать пробы, содержащие 1 нг определяемых метаболитов в виде их дансильных производных на мл биологической жидкости, в то время как при использовании соответствующего меченого аналога с молярной радиоактивностью порядка 1.2-1.8 ПБк/моль для достоверного получения пика по радиоактивности при использовании ВЭЖХ необходимо 5 нг вещества на мл раствора. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение. Пример 1. Синтез меченных тритием 5- и 5-прегнан-3,20-дионов. В реакционную ампулу поместили раствор 4 мг прогестерона в 0,4 мл метанола, 20 мг 5% Pd/СаСО3, заморозили жидким азотом и вакуумировали до давления 0,1 Па. В ампулу напустили газообразный тритий до давления 400 гПа и вели реакцию при комнатной температуре при перемешивании 1 ч. Затем ампулу вновь заморозили жидким азотом и избыточный тритий удалили вакуумированием. Содержимое ампулы отфильтровали, катализатор промыли этанолом (3х1 мл), фильтраты объединили. Лабильный тритий удалили трехкратным упариванием реакционной смеси с метанолом (3х3 мл). Остаток очистили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Характеристики полученных препаратов: 5- [4,5-3H] прегнан-3,20-дион - молярная радиоактивность - 51 Ku/ммоль, выход - 21,5%; 5-[4,5-3H] пpeгнaн-3,20-диoн - молярная радиоактивность - 38 Ku/ммоль, выход - 60%; Радиохимическая чистота 5- [4,5-3Н] прегнан-3,20-диона и 5-[4,5-3H] прегнан-3,20-диона составила 97-98%. Пример 2. Синтез дансильных производных прогестерона, 5- прегнан-3,20-диона, 5-прегнан-3,20-диона. 1 мкг прогестерона или 5- прегнан-3,20-диона или 5-прегнан-3,20-диона или их смесей растворили в 80 мкл метанола, добавили 10 мкл уксусной кислоты, 10 мкл раствора дансилгидразина (10 мг/мл) в ацетонитриле и выдерживали 1,5 ч при комнатной температуре в темноте, после чего реакционную смесь анализировали методом ВЭЖХ. Анализ хроматограмм, приведенных на фиг.2-4, свидетельствует о том, что дансильные производные прогестерона могут мешать точному определению концентрации - прегнан-3,20-диона и 5-прегнан-3,20-диона в реакционной смеси. Кроме того, в биологических жидкостях могут содержаться другие ненасыщенные соединения, которые могут исказить реальное количество определяемых метаболитов в исходной смеси. Пример 3. Синтез дансильных производных, 5- прегнан-3,20-диона, 5-прегнан-3,20-диона после предварительной обработки их смеси с прогестероном перекисью водорода в щелочной среде. Смесь прогестерона, 5- прегнан-3,20-диона и 5-прегнан-3,20-диона (по 1 мкг) растворили в 200 мкл метанола, добавили 20 мкл водного раствора К2СО3 (57 мг/мл) и 10 мкл 50%-ного раствора Н2О2 и выдерживали при комнатной температуре 2 ч. Затем смесь упаривали и дансилировали. Результаты приведены на фиг.5 и в таблице. Пример 4. Определение 5- и 5-дигидропрогестеронов в нанограммовых количествах в плазме крови. В 1,5 мл плазмы крови ввели по 0,1 МБк 5- [3Н] и 5-[3H]-дигидропрогестеронов и экстрагировали хлороформом 3 раза по 1 мл. Экстракцию завершили после перехода в органический слой 50% введенной в плазму метки. Предварительными опытами установили оптимальность использования хлороформа для экстракции из плазмы крови определяемых метаболитов и их меченых аналогов. С одной стороны, хлороформ обеспечивает переход в органический слой более 50% метки. С другой стороны, он экстрагирует минимальное количество подобных веществ, мешающих определению 5- и 5-прегнан-3,20-дионов. После завершения экстракции хлороформ упарили, а оставшийся осадок растворили в 200 мкл метанола. В полученный метанольный раствор добавили 20 мкл водного раствора К2СО3 (60 мг/мл) и 10 мкл 50%-ного раствора Н2О2. Смесь выдержали 2 ч при комнатной температуре, затем ее упарили, осадок растворили в 80 мкл метанола, добавили 10 мкл уксусной кислоты, 10 мкл раствора дансилгидразина (10 мг/мл) в ацетонитриле и выдержали 2 ч при комнатной температуре. Затем реакционную массу растворили в 50 мкл воды и анализировали методом ВЭЖХ (см. фиг.6). Расчет концентрации определяемых метаболитов прогестерона (нг/мл) по методу радиоактивного разбавления проводится по следующему уравнению: C=M/V, где С - концентрация стероида; V - объем взятой пробы [мл],М - содержание стероида в пробе [нг]
где А - активность стероида, добавленного в пробу [мкКu],
MW - молекулярный вес стероида,
Ks - отношение площади пика по радиоактивности к площади пика по оптическому поглощению при использовании метода ВЭЖХ для меченого аналога данного стероида. К - отношение площади пика по радиоактивности к площади пика по оптическому поглощению при использовании метода ВЭЖХ для смеси немеченого стероида, находящегося в пробе, и меченого аналога данного стероида, который был добавлен в пробу;
MR - молярная радиоактивность меченого аналога данного стероида, который был добавлен в пробу [Ки/ммоль]. Таким образом, синтезированы новые высокомеченные тритием аналоги двух известных метаболитов прогестерона. Способ согласно изобретению позволяет определять эти метаболиты в плазме крови с использованием новых меченых соединений.
Формула изобретения
-[4,5-3Н]прегнан-3,20-дион и 5-[4,5-3Н]прегнан-3,20-дион. 2. Способ определения содержания в плазме крови метаболитов прогестерона - -5-прегнан-3,20-диона и 5-прегнан-3,20-диона, заключающийся в том, что в анализируемую пробу плазмы крови вводят меченые аналоги определяемых метаболитов, обрабатывают пробу органическим растворителем, затем подвергают селективной деструкции перешедшие в экстракт прогестерон и те его ненасыщенные метаболиты, которые сопутствуют определяемым, после чего оставшиеся в обработанном экстракте определяемые метаболиты и их меченые аналоги переводят в их дансильные производные, содержание которых в обработанном экстракте определяют методом ВЭЖХ с использованием детекторов флюоресценции и радиоактивности, а по полученным данным производят расчет содержания определяемых метаболитов в плазме крови. 3. Способ по п.2, отличающийся в том, что используют аналоги определяемых метаболитов в виде 5-[4,5-3Н]прегнан-3,20-диона и 5-[4,5-3H]прегнан-3,20-диона. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся в том, что для обработки анализируемой пробы плазмы крови в качестве органического растворителя используют хлороформ, а прекращают обработку после перехода в экстракт не менее 50% добавленных в пробу меченых аналогов определяемых метаболитов. 5. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что селективную деструкцию проводят путем выдерживания экстракта в присутствии перекиси водорода в щелочной среде. 6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что щелочную среду создают добавлением в экстракт карбоната калия.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7
Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к исследованию биологических материалов иммунологическими методами, и может быть использовано для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показаний к иммуномодулирующей терапии
Изобретение относится к медицине, биологии, физиологии, генетике, лабораторной диагностике
Изобретение относится к биологии, конкретно к области биохимии клеточных мембран, и может быть использовано в медицине, биохимии и фармакологии для определения степени участия стероидных гормонов во внутриклеточном метаболизме в состоянии нормы и патологии
Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к способам определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в биологическом материале: в крови и в моче
Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству
Способ диагностики метаболического синдрома и заболеваний, включающих в себя данный синдром // 2171471
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики метаболического синдрома или связанных с ним состояний, например ожирение живота, резистентности к инсулину, сенильного диабета типа II, повышенного содержания жиров в крови и повышенного артериального давления
Стероиды, способ регулирования мейоза // 2182909
Изобретение относится к стероидам стеринового ряда общей формулы I, где R1 и R2 независимо выбирают из группы, включающей водород и неразветвленный или разветвленный С1-С6-алкил; R3 выбирают из группы, включающей водород, метилен, гидрокси, оксо, =NOR26, где R26 представляет водород и гидрокси и С1-С4-алкил, связанные с одним и тем же атомом углерода скелета стерина, или R3 вместе с R9 или R14 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R3 и R9 или R14; R4 выбирают из группы, включающей водород и оксо, или R4 вместе с R13 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R4 и R13; R5 выбирают из группы, включающей водород и гидрокси, или R5 вместе с R6 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R5 и R6; R6 представляет водород или R6 вместе с R5 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R6 и R5 или R14; R9 представляет водород или R9 вместе с R3 или R10 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R9 и R3 или R10; R10 представляет водород или R10 вместе с R9 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R10 и R9; R11 выбирают из группы, включающей гидрокси, ацилокси, оксо, = NOR28, где R28 представляет водород, галоген, или R11 вместе с R12 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R11 и R12; R12 представляет водород или R12 вместе с R11 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R12 и R11; R13 представляет водород или R13 вместе с R4 или R14 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R13 и R4 или R14; R14 представляет водород или R14 вместе с R3, R6 или R13 обозначает дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R14 и R3, или R6, или R13; R15 представляет водород; R16 выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, оксо или 16 вместе с R17 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R16 и R17; R17 представляет водород или гидрокси или R17 вместе с R16 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R17 и R16; R18 и R19 представляют водород; R25 выбирают из группы, включающей водород, и С1-С4-алкил; А представляет атом углерода или атом азота; когда А представляет атом углерода, R7 выбирают из группы, включающей водород, гидрокси и фтор, и 8 выбирают из группы, включающей водород, С1-С4-алкил, метилен и галоген, или R7 вместе с R8 обозначают дополнительную связь между атомами углерода, с которыми связаны R7 и R8; R20 представляет С1-С4-алкил; R21 выбирают из группы, включающей С1-С4-алкил, С1-С4-гидроксиалкил, С1-С4-галогеналкил, содержащий вплоть до трех атомов галогена; когда А представляет атом азота, R7 обозначает неподеленную пару электронов, и R8 выбирают из группы, включающей водород и оксо; R20 и R21 представляют С1-С4-алкил с условием, что соединение общей формулы (I) не имеет любых кумулированных двойных связей и с дополнительным условием, что соединение не является одним из известных холестеновых соединений
Способ лечения злокачественной лимфомы кожи // 2182481
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и касается способа лечения злокачественной лимфомы кожи в условиях стационара
Изобретение относится к медицине, к хирургии, к способам лечения нарушения энтерогепатической циркуляции желчи у больных с наружным дренированием желчных путей
Способ лечения болевого синдрома при дисфункциях височно- нижнечелюстного сустава у женщин // 2180570
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии
Изобретение относится к медицине, к терапии, к способу хронотерапии глюкокортикоидами больных бронхиальной астмой тяжелого течения
Изобретение относится к медицине и касается создания препарата для лечения кожных гнойных инфекций
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии
Изобретение относится к солям соединений формулы (I) в том случае, когда эти соединения содержат аминофункцию, в частности с соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, с азотной, серной, фосфорной, уксусной, муравьиной, пропионовой, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, винной, лимонной, щавелевой, глиоксиловой, аспарагиновой кислотами, алкансульфокислотами, такими как метан- и этан-сульфокислоты, арилсульфокислотами, такими как бензол- и паратолуол-сульфокислоты, и арилкарбоновыми кислотами, и, когда соединения формулы (I) содержат кислотную функцию, к солям щелочных, щелочно-земельных металлов и аммония, при необходимости замещенного
Изобретение относится к солям соединений формулы (I) в том случае, когда эти соединения содержат аминофункцию, в частности с соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, с азотной, серной, фосфорной, уксусной, муравьиной, пропионовой, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, винной, лимонной, щавелевой, глиоксиловой, аспарагиновой кислотами, алкансульфокислотами, такими как метан- и этан-сульфокислоты, арилсульфокислотами, такими как бензол- и паратолуол-сульфокислоты, и арилкарбоновыми кислотами, и, когда соединения формулы (I) содержат кислотную функцию, к солям щелочных, щелочно-земельных металлов и аммония, при необходимости замещенного
Способ защиты мозга во время кардиохирургических операций в условиях бесперфузионной гипотермии // 2186568
Изобретение относится к медицине
