Средство, обладающее противометастатической активностью

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для лечения больных с метастазирующими опухолями. Предложено противометастатическое средство, содержащее вытяжку из надземной части (травы) аконита байкальского (Acоnitum baikalense Steinb.), в частности жидкую вытяжку из высушенной измельченной надземной части (травы) аконита байкальского, 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:50, и жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 30%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:20, и жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:1, и сухую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40%-ным этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:1. Предложено также средство, содержащее сухую вытяжку суммы алкалоидов, выделенную из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского. Предложенные средства оказывают достаточно высокое противометастатическое действие. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, касается способов получения лекарственного средства из растительного сырья и может быть использовано для лечения больных с метастазирующими опухолями.

Наиболее близким (прототипом) является бефунгин, применяемый в медицине в терапии онкологических больных - бефунгин (экстракт чаги) [1]. Известны его противометастатические свойства [2, 3].

Однако в настоящее время вопрос расширения арсенала средств, обладающих противометастатическим действием, из природного сырья является чрезвычайно актуальным.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих противометастатической активностью, из природного сырья.

Поставленная задача достигается тем, что противометастатическое средство содержит спиртовую вытяжку из надземной части (травы) аконита байкальского (Aconihim baikalense Turcz. ex Rapaics), в частности жидкую вытяжку из высушенной измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40% этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:50, и жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 30% этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1: 20, и жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40% этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:1, и сухую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40% этиловым спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:1, а также сухую вытяжку суммы алкалоидов, выделенную из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского.

Средства, обладающие противометастатической активностью, представляют собой спиртовые вытяжки из аконита байкальского, содержащие комплекс действующих и сопутствующих веществ, извлекаемых из измельченной травы аконита байкальского 30% и 40% раствором этилового спирта с последующим отстаиванием и фильтрацией, а также алкалоидную вытяжку, извлекаемую хлороформом и содержащую сумму алкалоидов.

2% жидкое растительное противометастатическое средство - это прозрачная жидкость светло-коричневого цвета, своеобразного запаха.

10% жидкое растительное противометастатическое средство - это прозрачная буровато-коричневая жидкость, своеобразного запаха, жгучего вкуса.

50% жидкое растительное противометастатическое средство - это темно-коричневая жидкость, своеобразного запаха и жгучего вкуса.

50% сухое растительное противометастатическое средство - это порошок коричневого цвета, своеобразного запаха и жгучего вкуса.

Стандартное жидкое растительное противометастатическое средство - жидкость коричневого цвета, своеобразного запаха и жгучего вкуса, содержащая 0,01-0,007% алкалоида.

Растительное противометастатическое средство, содержащее сумму алкалоидов - это белый порошок своеобразного запаха.

Авторы не нашли в проанализированной ими литературе данных отличительных признаков. Данная совокупность отличительных признаков явным образом не следует для специалиста. Предлагаемые средства можно использовать в медицинской практике.

Таким образом, предлагаемое решение соответствует критериям изобретения -"новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства Впервые установлено, что средства, содержащие вытяжки из сухой измельченной надземной части травы аконита байкальского 30%, 40%-ным этанолом в предлагаемом соотношении, а также сумма алкалоидов обладают высокой противометастатической активностью.

Примеры конкретного получения средств, обладающих противометастатической активностью.

Пример 1. Экстракцию ведут методом мацерации. Собранную воздушно-сухую траву аконита байкальского измельчают до 3 мм, 100 г сырья заливают 1000 л 40% этиловым спиртом и в закрытом сосуде настаивают 7 дней при комнатной температуре, периодически помешивая. Фильтруют через фильтровальную бумагу и измеряют объем извлечения. Он равен 860 мл. Сырье хорошо отжимают, заливают шрот недостающим количеством экстрагента (140 мл) и еще раз отжимают, доводят извлечение до первоначального объема (1000 мл) 40% этиловым спиртом. Получено 2% растительное средство - 2% настойка аконита байкальского.

Пример 2. Экстракцию ведут методом дробной мацерации. 100 г воздушно-сухой измельченной травы аконита байкальского помещают в перколятор, снабженный ложным дном, обтянутым слоем фильтрующего материала (бязь). Сырье утрамбовывают и помещают сверху прижимную решетку В перколятор подают 0,54 л 30% этилового спирта, перколятор герметизируют и оставляют для настаивания на 24 часа.

Во второй день из перколятора в сборник сливают 0,25 л извлечения, одновременно подавая в перколятор 0,25 л экстрагента (30% этиловый спирт), и оставляют для настаивания на 2 часа.

Через 2 часа из перколятора в сборник сливают 0,25 л извлечения, одновременно подавая в перколятор 0,25 л экстрагента, и оставляют для настаивания на 2 часа.

Через 2 часа из перколятора сливают 0,25 л извлечения, одновременно подавая в перколятор 0,20 л экстрагента, и оставляют для настаивания на 2 часа.

Через 2 часа из перколятора полностью сливают извлечение в сборник. Извлечение из сборника перекачивают в отстойник и оставляют на 5 суток при комнатной температуре либо в прохладном месте.

Из отстойника извлечение сливается послойно, не взмучивая осадка, и фильтруется через тройной слой бязи. Выход готового продукта должен быть не менее 1 л. Получено 10% растительное средство - 10% настойка аконита байкальского.

Пример 3. По 200 г воздушно-сухой измельченной травы аконита байкальского загружают в пять экстракторов и в первый из них подают сверху 40%-ный этанол в количестве, создающим слой над сырьем в 5-7 см и оставляют на 17 часов. По истечении указанного срока жидкость из первого экстрактора сливают во второй, а в 1-ый экстрактор подают 40%-ный этанол до получения исходного уровня. Через 17 часов производят последовательные сливы из 2-го экстрактора в 3-ий, из 1-го во 2-ой, а в первый подают свежий растворитель. Через каждые 17 часов повторяют указанные операции до заполнения 5-го экстрактора. Затем из 5-го экстрактора получают 200 мл экстракта, одновременно производя последовательные сливы из 1-го во 2-ой, из 2-го в 3-ий, из 3-го в 4-ый, а из 4-го в 5-ый экстрактор. Через интервал в 17 часов из 5-го экстрактора при аналогичной последовательности передвижки жидкости получаем порциями по 200 мл еще четыре раза жидкий экстракт. Полученные экстракты объединяют (1 л). Получено 50% жидкое растительное средство - экстракт аконита байкальского жидкий.

Пример 4. По 200 г воздушно-сухой измельченной травы аконита байкальского загружают в пять экстракторов и в первый из них подают сверху 40%-ный этанол в количестве, создающим слой над сырьем в 5-7 см и оставляем на 17 часов. По истечении указанного срока жидкость из первого экстрактора сливают во второй, а в 1-ый экстрактор подают 40%-ный этанол до получения исходного уровня. Через 17 часов производят последовательные сливы из 2-го экстрактора в 3-ий, из 1-го во 2-ой, а в первый подают свежий растворитель. Через каждые 17 часов повторяем указанные операции до заполнения 5-го экстрактора. Затем из 5-го экстрактора получают 200 мл экстракта, одновременно производя последовательные сливы из 1-го во 2-ой, из 2-го в 3-ий, из 3-го в 4-ый, а из 4-го в 5-ый экстрактор. Через интервал в 17 часов из 5-го экстрактора при аналогичной последовательности передвижки жидкости получают порциями по 200 мл еще четыре раза жидкий экстракт. Полученные экстракты объединяют (1 л). Жидкий экстракт упаривают под вакуумом с последующим измельчением полученного остатка до порошкообразного состояния. Выход целевого продукта составляет 12,5% от массы воздушно-сухого сырья. Получено 50% сухое растительное средство - экстракт аконита байкальского сухой.

Пример 5. Поступают, как в примере 2. Полученную настойку анализируют на содержание алкалоидов по [4, 5] и разбавляют 30% этиловым спиртом по расчету до концентрации 0,01-0,007%.

Пример 6. 100 г высушенного и измельченного сырья смачивают 5% раствором соды и загружают в перколятор. Через 2 часа после загрузки заливают в него 2000 мл хлороформа. Экстракцию хлороформом проводят на лабораторной установке непрерывного действия, состоящей из перколятора, пленочного испарителя и прямого холодильника. Непрерывная циркуляция растворителя проводится со скоростью 2 л/ч. Продолжительность исчерпывающей экстракции 5 дней. Сконцентрированный хлороформный экстракт сливают через кран испарителя. Последняя порция хлороформного экстракта из перколятора сливается через нижний кран перколятора и концентрируется в испарителе. Полученный хлороформный экстракт алкалоидов очищают от неалкалоидных соединений экстракцией водным раствором серной кислоты. Дальнейшую очистку суммы алкалоидов проводят повторной хлороформной экстракцией из сернокислого извлечения после нейтрализации и подщелачивания его до рН=10-12. Для того чтобы избавиться от следов щелочи, которые могли перейти в хлороформный слой, его промывают 50 мл воды. Затем хлороформный экстракт фильтруют через осушитель (15 г безводного сульфата натрия). На последней стадии полученную сумму алкалоидов упаривают досуха. Выход продукта 0,23%. Получено растительное средство, содержащее сумму алкалоидов. Установлено, что в состав суммы алкалоидов входят известные дитерпеновые алкалоиды: напеллин, зонгорин, мезаконитин, гипаконитин и новый алкалоид N-окись 12-эпинапеллииа [6].

Для подбора наиболее эффективной лекарственной формы аконита байкальского были использованы: 2% растительное средство (2% настойка), 10% растительное средство (10% настойка), 50% жидкое и сухое растительные средства (экстракты жидкий и сухой), растительное средство, содержащее сумму алкалоидов.

Препаратами сравнения были: 5-фторурацил - антиметаболит из группы фторпиримидинов. Это базовый препарат, обладающий широким спектром противоопухолевой активности и наиболее широко использующийся в онкологической практике [7] и прототип - бефунгин - полугустой экстракт из чаги (березовый гриб). Клинические исследования препарата из чаги показали ряд положительных эффектов. Имеются литературные данные об успешном лечении рака молочной железы [8] , неоперабельных форм рака женской половой сферы [9], лучевой лейкопении [10] и др. В экспериментальной медицине применение препаратов чаги приводит к задержке развития перевиваемых опухолей, а зачастую и их рассасыванию [11].

Известен способ получения противоопухолевого средства бефунгина (экстракт чаги), представляющего собой полугустой экстракт, получаемый из грибных наростов (березового гриба-чаги), образуемых на березах фитопатогенным паразитом Inonotus obliguus [12].

Исследование влияния растительных средств из аконита байкальского на рост и диссеминацию метастазов проведены на мышах с карциномой легких Льюис, меланомой В-16. Эксперименты проведены на неинбредных мышах обоего пола массой 18-25 г, полученных из коллекционного фонда НИЛ экспериментального биомедицинского моделирования ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Перевивку опухолей проводили стандартными общеизвестными методами [13].

1 - R=OH мезаконитин 2 - R=H гипаконигин Мезаконитин (1) - C₃₃H₄₅NO₁₁, М⁺ 631, т. пл. 195,5-196^oС (метанол), [α]²⁰₅₄₆+32,75 (С 3,47; хлороформ).

Гипаконитин (2) - C₃₃H₄₅NO₁₀, M⁺ 615, т. пл. 179-181^oС (метанол) 3 - R₁=oh, R₂=H напеллин 4 - R₁+R₂=O зонгорин Напеллин (3) - C₂₂H₃₃NO₃, M⁺ 359, т. пл. 156-157^oС (ацетон) Зонгорин(4) - С₂₂Н₃₁NO₃, M⁺ 357, т.пл. 182-187^oС (эфир).

N-окись 12-напеллнна
N-окись 12-напеллина (5) -C₃₃H₃₃NO₄, M⁺ 375
Выше приведена структура алкалоидов надземной части аконита байкальского.

Для моделирования метастатического процесса лечение начинали в более поздние сроки (10 сутки) после перевивки опухоли Наиболее эффективные дозы 2% настойки аконита для каждого вида опухоли подобраны опытным путем: для меланомы В-16 - доза 2,5 мл/кг, для карциномы легких Льюиса - 10 мл/кг. 10% настойка, жидкий и сухой экстракты вводились животным в дозах, равнозначных эффективным дозам 2% настойки аконита в пересчете на сухое сырье. Алкалоидная вытяжка вводилась в дозе 0,5 мг/кг, Наиболее эффективная доза бефунгина (1,0 мл/кг) выбрана согласно литературным данным [14]. 5-фторурацил вводили в дозе 15,0 мг/кг [15]. Все растительные средства и препарат-прототип бефунгин вводили внутрижелудочно, 5-фторурацил внутримышечно. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. Противометастатическое действие препаратов определяли по частоте метастазирования опухоли и проценту животных с метастазами по отношению к общему количеству животных в группе, также по среднему числу метастазов в легких у мышей на одно животное в группе. Критериями оценки эффективности противометастатического действия препаратов служили также:
- процент увеличения продолжительности жизни животных, который вычисляли по формуле

- индекс ингибирования метастазирования рассчитывали по формуле

где Ак - частота метастазирования в контрольной, А - в опытной группах, Вк - среднее число метастазов у животных контрольной, В - опытной группы.

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем расчета средней и среднеквадратичной ошибки (m) О достоверности различий судили, используя параметрический (критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) методы. Для сравнения результатов экспериментов, где показатели выражались в долях, достоверность определяли с помощью углового преобразования Фишера [16].

Результаты исследования с использованием меланомы В-16 приведены в табл. 1. Мышей линии F1 (CBA•C 57 DL6) с меланомой В-16 начинали лечить на 11 сутки. Препарат сравнения 5-фторурацил на этой модели не проявил существенной противометастатической активности, отмечена лишь тенденция к снижению среднего числа метастазов, индекс ингибирования метастазирования 13% Под действием бефунгина лишь у 50% мышей были зафиксированы метастазы в легких (в контроле у 100%) Под влиянием 2% настойки аконита только у 20% зафиксированы метастазы (в контроле у 78%) Процент торможения роста метастазов (по их количеству) в группе, получавшей бефунгин, равен 12,9% (различие с контролем статистически недостоверно), а в группе, получавшей настойку аконита 97% (р<0,01). Различия между этими эффектами высоко достоверны (р<0,01), что свидетельствует о явном преимуществе настойки. Под влиянием 2% настойки аконита у 20% животных зафиксированы метастазы (в контроле у 78%), среднее число метастазов 0,2±0,2 (в контроле 6,6±3,4), индекс ингибирования метастазирования в 1,8 раза больше, чем у бефунгина (99 против 56 соответственно) Жидкий и сухой экстракт аконита достоверно снижали частоту метастазирования меланомы В-16. Индекс ингибирования метастазирования под действием сухого экстракта превосходил таковой препарата сравнения бефунгина в 1,3 раза. Несколько ниже этот показатель был в группе, где животные получали жидкий экстракт, тем не менее он превосходил препарат сравнения 5-фторурацил в 3,2 раза. Под действием алкалоидной вытяжки было получено 100% ингибирование метастазирования, что существенно превосходило по эффективности препарат-прототип бефунгин и тем более препарат-сравнения 5-фторурацил.

На следующем этапе мы провели сравнительное исследование антиметастатической активности на другой опухолевой модели - карциноме легких Льюис. Штамм этой опухоли известен высокой степенью поражения легких метастазами. В первой серии экспериментов мышей с перевитыми опухолями оставляли на выживаемость. Препарат сравнения 5-фторурацил не оказывал достоверного влияния на продолжительность жизни мышей с этой метастазирующей опухолью (табл.2). 2% настойка аконита, напротив, в 1,4 раза увеличивала этот показатель, практически так же, как и 10% настойка и сухой экстракт. Жидкий экстракт приводил к явной тенденции увеличения этого параметра. Растительное средство, содержащее сумму алкалоидов, в 1,7 раза увеличивало продолжительность жизни мышей с опухолью. Во второй серии экспериментов изучали влияние растительных средств на рост и диссеминацию опухолевых клеток. Результаты опытов показали, что препарат сравнения 5-фторурацил оказал существенное влияние на среднее количество метастазов (в 1,6 раза снижал этот показатель по сравнению с контролем), но не влиял на частоту метастазирования (табл. 3). Препарат-прототип бефунгин в 2,3 раза снижал среднее число метастазов и в 2,5 раза частоту метастазирования, что сказалось на высоком индексе ингибирования метастазирования - 83%. Несколько ниже был этот показатель под действием 2% настойки аконита, но среднее число метастазов было в 1,9 раза меньше контрольного. 10% настойка проявила еще более существенный противометастатический эффект, т.к. в 2,5 раза снижала среднее число метастазов в легких и в 2,2 раза частоту метастазирования. Индекс иигибирования 10% настойки превосходил таковой бефунгина. Жидкий и сухой экстракт оказали явную тенденцию к снижению как среднего числа метастазов, так и числа животных с метастазами, а индекс иигибирования метастазирования превосходил в 1,5 и в 1,4 раза соответственно этот показатель препарата-сравнения 5-фторурацила. Алкалоидная вытяжка в 5,4 раза снижала среднее количество метастазов, только у 82% животных зафиксирована диссеминация опухолевого процесса, индекс ингибирования составил 85%.

Таким образом, как видно из экспериментальных исследований, все средства, содержащие вытяжки из высушенной и измельченной надземной части аконита байкальского, оказывают достаточно высокое противометастатическое действие с наибольшей активностью у 10% растительного средства аконита байкальского, 2% растительного средства аконита байкальского и растительного средства, содержащего сумму алкалоидов.

Источники информации
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства М., 1984. - 575 с.

2. Рудаков В. Ф. Влияние чаги на метастазирование опухоли Эрлиха у мышей/Высшие грибы и их биологически-активные соединения - Л.: Наука, 1973. - С. 52-54.

3. Зуева Е.П. Препараты из растений Сибири и Дальнего Востока в комплексной терапии злокачественных новообразований (экспериментальное исследование). Автореф дисс... докт. биол. наук, Томск, 1999. 50 с.

4. Н. Н. Погодаева, Ц. Жапова, А.А. Семенов /Количественное определение алкалоидов в надземной части Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics//Раст. ресурсы, 1997, 1, С. 87-88.

5. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. /Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов //Раст. ресурсы, вып. 2, 2000 г., С.79-84.

6. Жапова Ц. Исследование химического состава растения Aconitum baicalense. Автореф. дисс... канд. хим. наук, Иркутск, 1995. 19 с.

7. Зидермане А.А. Фторпиримидины в химиотерапии опухолей - Рига: Зинатне, 1982. - 173 с.

8. Bielewski J. Z kasuistyki stoswania huby brozozy/Przegl. Lekar - 1958. - V. 14. - N.3, - S. 93-96.

9. Glowaski H., Tomaszewski J. Proby stosowania wyciagow z czamej huby brzozowej (Poria obliqa Bres) w leczeniu nioperacynego raka narzadow rodnych и Kobiety / Ginecol. Polska. - 1962. - 33. - N.4 - S.445-450.

10. Якимов П.А. и др. Препарат "Бин-чага" /П.А. Якимов, П.К. Булатов, М. П. Березина //Вести. АН СССР 4. - С. 88-91.

11. Боговский П.А., Логна Г.О. О влиянии экстракта чаги на развитие трансплантированных и индуцированных опухолей // Матер, конфер. по опосредованному воздействию на опухолевый процесс - Таллин, 1963. - С. 21-22.

12. Муравьева И.А. Технология лекарств. T.1 "Медицина", 1980. 704 с.

13. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США /З. П. Софьина, А..Б. Сыркин, А. Голдин, А. Кляйню. - М.: Медицина, 1979. - 296 с.

14. Грибель Н.В. - Особенности противоопухолевого действия ряда комплексных препаратов природного происхождения. Автореф. дис... канд. биол. наук, Томск, 1987. 18 с.

15. Mandel H G et. al. Studies of antitumor action of 5-fluorouracil (5FU) / H.G. Mandel, Ph. Klubes, D.J. Fernandes // Bull. Cancer. - 1979. - V.66. - N1. - P.49-54.

16. Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - М.: Медицина, 1978. - 293 с.

Формула изобретения

1. Средство, обладающее противометастатическим действием, содержащее вытяжку из растительного сырья экстрагентом, отличающееся тем, что оно содержит спиртовую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40%-ным спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1: 50.

3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 30%-ным спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1: 20.

4. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит жидкую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40%-ным спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1: 1.

5. Средство по п. 1, отличающееся тем, что средство содержит сухую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского 40%-ным спиртом при соотношении растительного сырья и экстрагента 1: 1.

6. Средство, обладающее противометастатической активностью, содержащее сухую вытяжку из высушенной и измельченной надземной части (травы) аконита байкальского, отличающееся тем, что оно содержит сумму алкалоидов.

7. Средство по п. 6, отличающееся тем, что в качестве алкалоидов оно содержит мезаконитин (С₃₃Н₄₅NO₁₁), гипаконитин (С₃₃Н₄₅NO₁₀), напеллин (С₂₂Н₃₃NO₃), зонгорин (С₂₂Н₃₁NO₃) и N-окись 12-напеллина (С₂₂Н₃₃NO₄).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3