Способ обнаружения клинически релевантных изменений последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты онкогена ki-ras, его применение и набор для теста раннего выявления опухолей

 

Изобретение относится к медицине и касается способа обнаружения клинически релевантных изменений последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты онкогена Кi-ras, его применение и набор для теста раннего выявления опухолей. Сущность изобретения включает экстракцию геномной дезоксинуклеиновой кислоты из клинических проб материала посредством многократных этапов очистки для удаления мешающих веществ - ингибиторов и обнаружение изменений по комплементарной реакции гибридизации оснований после добавления шести олигонуклеотидов с определенной комплементарностью к измененной последовательности участков геномной ДНК. Набор для теста раннего выявления опухолей на основе клинически релевантных изменений последовательности ДНК онкогена Ki-ras включает соответствующие реактивы и зонды олигонуклеотидов. Преимущество заключается в повышении чувствительности способа. 2 с. и 18 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, касается способа обнаружения клинически релевантных изменений последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты - ДНК онкогена Ki-ras, предпочтительно геномной ДНК в каловой массе, и испытательное оборудование, и может быть использовано для раннего выявления опухолей, в особенности опухолей поджелудочной железы и толстой кишки.

Опухоли поджелудочной железы и толстой кишки являются раковыми заболеваниями, наиболее часто встречающимися во всем мире. Они находятся на третьем-четвертом местах в статистике смертности от злокачественных опухолей. Проблематика этих заболеваний проявляется особенно четко в опухоли поджелудочной железы. В связи со скрытым протеканием заболевания в течение длительного периода диагноз опухолей поджелудочной железы ставится так поздно, что средний процент выживаемости 5 лет больных не превышает 2%, несмотря на применение высокоразвитых хирургических методов.

В настоящее время не существуют удовлетворительных лабораторных параметров для раннего выявления опухолей поджелудочной железы. Для диагностики колоректальных карциномов - рака толстой или прямой кишки применяется тест гемокультуры на наличие скрытой крови в каловой массе. Аналитическая выразительность этого теста неудовлетворительна, потому что скрытая кровь встречается в каловой массе и в случае незлокачественных заболеваний геморроидальных узлов и, кроме того, положительные результаты проб могут быть связаны с множеством интерферирующих, накладывающих влияний компонентов каловой массы, с такими как пероксидазы и каталазы. С другой стороны, известно, что опухоли диаметра меньше 2 см не отдают достаточно крови, чтобы быть обнаруженными в тесте гемокультуры.

Таким образом, даже при наличии прогрессирующих опухолей толстой кишки чувствительность диагностики теста гемокультуры составляет только около 50-70%.

Возможной альтернативой для раннего выявления опухолей поджелудочной железы и толстой кишки является молекулярно-биологическое обнаружение релевантных мутаций в онкогенах, предпочтительно в протоонкогене Ki-ras. Было обнаружено, что мутации в протоонкогене Ki-ras встречаются в 75-90% опухолей поджелудочной железы (Almoguera S., Shiate D., Forrester К., Martin J., Arnheim N., Perrucho M. (1988) Cell 53, 549-554) и, по крайней мере, в 50% колоректальных карциномов - рака рака толстой или прямой кишки (Forrester К., Alomugera С. , Наn К., Grizzle W.E., Perrucho, M. (1987) Nature 327, 298-303).

Частота заболевания раком поджелудочной железы до сих пор самая высокая, которая встречалась для онкогена в случае специфической опухоли.

Кроме того, релевантные мутации ограничиваются на кодонах трех аминокислот; в случае рака поджелудочной железы - только одной аминокислоты. Это обстоятельство может существенно облегчить обнаружение мутации.

Для опухолей поджелудочной железы и толстой кишки существует возможность непроникающего обнаружения состояния онкогена в каловой массе. Впервые такое обнаружение было продемонстрировано Зидрански и его сотрудниками в 1992 г. (Sidransky D. , Tokino Т., Hamilton S.R., Kinler К.W., Levin В., Vogelstein В. (1992); Science 256, 102-105). Оно успешно, потому что, с одной стороны, в каловую массу переводится достаточное количество эпителиальных клеток поджелудочной железы и кишки, причем возможно, что в условиях, встречающихся в каловой массе, клетки опухоли стабильнее, чем нормальные эпителии. Во вторых, бактерии не имеют генов Ki-ras. Таким образом, на диагностику не влияет интерференцией флора кишечника и эпителиальных клеток. Через обнаружение активированного гена Ki-ras возможно диагностировать аденомы с размерами от 1 см³.

Несмотря на эти благоприятные предварительные условия для применения, в лабораторной диагностике до сегодняшнего дня не существует применяемого стандартного способа обнаружения мутаций онкогена Ki-ras анализом его ДНК в каловой массе.

В связи с этим основная проблема состоит в существенной трудности выделения при разумных затратах достаточного качества геномной ДНК из проб каловой массы. Метод экстрагирования, применяемый чаще всего, включает ряд многочасовых этапов очистки и отнимает, по крайней мере, одну рабочую неделю.

Даже по способу, усовершенствованному Калдасом и его сотрудниками (Caldas С., Hahn S.A., Hruban R.H., Redston M.S., Yeo С.J., Kem S.E. (1994); Cancer Res. 54, 3568-3573), требует несколько дней.

Каловая масса представляет собой комплексную смесь из отрубевидных клеток, микроорганизмов, не переваренных составных частей пищи, слизи, красителей и других растворимых и нерастворимых компонентов желудочно-кишечного тракта. Такой комплексный состав связан с наличием множества мешающих, тормозящих веществ-ингибиторов, которые могут выступать как загрязняющие составные части изолированного выделенного раствора геномной ДНК, а также прямо внедряться (интеркалироваться) в ДНК или быть связанными с ней, что препятствует применению выделенной геномной ДНК для дальнейших исследований.

Задачей изобретения является разработка для соответствующей системы диагностики гена стандартного, рутинного метода обнаружения, причем подходящему методу экстрагирования, выделения геномной ДНК придается ключевая функция в создании подходящего стандартного теста и, в конце концов, разработка автоматизируемого теста ДНК онкогена Ki-ras, а также разработка на основе этого набора для теста раннего выявления опухолей, преимущественно опухолей поджелудочной железы и толстой кишки.

Результатом изобретения является способ обнаружения клинически релевантных изменений последовательности геномной ДНК онкогена Ki-ras, набор для теста раннего выявления опухолей поджелудочной железы и толстой кишки, позволяющий сократить время проведения обнаружения и обеспечить диагностирование аденом с размерами от 1 см³.

Сущность изобретения.

Задача реализуется в соответствии с пунктами 1-20 формулы.

По способу обнаружения клинически релевантных изменений последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) онкогена Ki-ras, в котором в качестве ДНК используют геномную ДНК онкогена Ki-ras, экстрагирование геномной ДНК из проб материала для анализа осуществляют многократными этапами очистки для удаления мешающих веществ-ингибиторов, а обнаружение изменений осуществляют по результату комплементарной реакции гибридизации оснований после добавления шести олигонуклеотидов с определенной комплементарностью к измененной последовательности участков геномной ДНК со следующими последовательностями: 5'-GTT-GGA-GCT-CGT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-TGT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-AGT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-GCT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-GAT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-GTT-GGC-GTA-3'.

При экстрагировании геномной ДНК в качестве этапов очистки используют лизис содержащихся в пробе материала клеток с помощью буферного раствора, содержащего хаотропные соли, инкубирование лизата с минеральным веществом-носителем для связывания геномной ДНК, отделение вещества-носителя со связанной геномной ДНК от лизата центрифугированием, промывку связанной с веществом-носителем геномной ДНК буферным раствором промывки, элюирование геномной ДНК инкубированием вещества-носителя с буферным раствором с небольшой концентрацией ионов, инкубирование отделенной геномной ДНК с содержащим хаотропную соль буферным раствором для удаления из геномной ДНК связанных с ней веществ, повторное инкубирование буферного раствора с отделенной геномной ДНК с минеральным веществом-носителем, отделение раствора от минерального вещества-носителя центрифугированием, промывку вещества-носителя со связанной геномной ДНК раствором промывки, элюирование связанной геномной ДНК с помощью буферного раствора с небольшой концентрацией ионов, при этом в качестве первого этапа очистки для удаления мешающих веществ-ингибиторов используют инкубирование ее с хроматографическими веществами, обладающими адсорбционными свойствами, а в качестве хроматографического материала используют раствор-суспензию из активированного угля.

При экстрагировании в качестве хаотропных солей для лизиса используют изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, хлорид лития или смеси из хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М, а в качестве минерального вещества-носителя используют непористые частицы SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, и удельной поверхностью 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г, в качестве буферного раствора промывки используют смесь, состоящую из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, а также 70 объемных процентов этанола, в качестве буферного раствора небольшой концентрации для элюирования ДНК используют 10 мМ Tris HC1, 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, а элюирование ведут при температуре 48-65^oС, в качестве буферного раствора для инкубирования элюированной геномной ДНК используют раствор, содержащий йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия, при концентрации ионов более 4 М, а инкубирование ведут при непрерывном встряхивании. Кроме того, в качестве буферного раствора для лизиса используют раствор, содержащий изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол и цитрат натрия, а для повторного инкубирования - раствор, содержащий 5 М йодида натрия.

Комплементарную реакцию гибридизации оснований проводят инкубированием олигонуклеотидов и участков геномной ДНК с измененной последовательностью, подлежащей обнаружению, причем или олигонуклеотиды, или участки геномной ДНК с измененной последовательностью, подлежащей обнаружению, маркированы, а обнаружение результата гибридизации проводят по маркированию или другими методами обнаружения гибридизации для двуцепочечной ДНК, при этом олигонуклеотиды и/или участки геномной ДНК с измененной последовательностью или гибридизированную ДНК наносят на твердую фазу, в качестве которой используют плату для микротитрования, световод или чип из кремния. При этом геномную ДНК с последовательностью, подлежащей обнаружению, амплификацируют парой праймеров, причем один праймер маркирован в его 5' позиции, связывают с твердой фазой, переводят в одну цепь, инкубирование ведут в течение 15-45 минут при температуре 38-45^oС и затем промывают от одного до пяти раз в течение 5-15 минут раствором промывки, содержащем додецилсульфат натрия или смесь хлорида и цитрата натрия, при температуре 45-55^oС, причем связывание с твердой фазой осуществляют через стрептавидин-биотиновый мост, инкубирование ведут в течение 30 минут при температуре 42^oС, а промывку - 3 раза по 10 минут раствором, содержащим 0,03% додецилсульфат натрия и 0,03% смеси хлорида и цитрата натрия, при температуре 50^oС. При осуществлении способа в качестве проб материала клеток для анализа используют каловую массу, жидкости секрета поджелудочной железы и полипы кишки, полученных при эндоскопии.

Набор для теста раннего выявления опухолей на основе клинически релевантных изменений последовательности геномной ДНК онкогена Ki-ras, преимущественно для раннего выявления опухолей поджелудочной железы и толстой кишки на основе анализа каловой массы, включает систему экстракции ДНК, содержащую раствор для удаления веществ-ингибиторов, буферный раствор для лизиса, содержащий хаотропные соли, минеральный носитель для связывания ДНК, буферный раствор промывки, буферный раствор инкубирования, дополнительный буферный раствор инкубирования, содержащий хаотропные соли; смесь праймеров для селективной амплификации исследуемой выявляемой последовательности ДНК гена Ki-ras; контрольные клеточные линии ДНК для амплификации дикого типа гена Ki-ras или мутированного типа клеточной линии гена Ki-ras; зонды олигонуклеоитодов, где используют олигонуклкеотиды со следующими последовательностями: 5'-GTT-GGA-GCT-CGT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-TGT-GGC-GTA-3' 5'-GTT-GGA-GCT-AGT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GCT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GAT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GTT-GGC-GTA-3';
а также твердую фазу в виде платы для микротитрования, световода или чипа из кремния, имеющей поверхность, покрытую стрептавидином, и раствор промывки из додецилсульфата натрия и смеси хлорида и цитрата натрия. Раствор для удаления мешающих веществ-ингибиторов представляет собой суспензию из активированного угля, буферный раствор лизиса, содержащий хаотропные соли, в качестве хаотропных солей содержит изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, хлорид лития или смесь хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол, цитрат натрия, а в качестве минерального носителя для связывания ДНК используют суспензию непористых частиц SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, и удельной поверхностью 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г. Буферный раствор промывки содержит NaCl, Tris НСl, этилендиаминтетрауксусную кислоту, а также 70 объемных процентов этанола, буферный раствор инкубирования содержит Tris HCl, этилендиамитетрауксусную кислоту с небольшой концентрацией ионов, а дополнительный буферный раствор инкубирования, содержащий хаотропные соли, отличается тем, что в качестве хаотропных солей буферный раствор содержит йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно 5 М йодида натрия.

Таким образом, задачу в соответствии с изобретением решают путем экстрагирования геномной ДНК онкогена Ki-ras из проб материалов, предпочтительно из проб каловой массы, многократными этапами очистки, причем все вещества-ингибиторы высокоселективно удаляют. Изолированную геномную ДНК выделяют для дальнейшего применения.

Исходными материалами для проб при осуществлении изобретения могут быть пробы каловой массы, биоптаты из желудочно-кишечных полипов после эндоскопического взятия, жидкости секрета из поджелудочной железы, мокрота и, в случае необходимости, кровь, плазма, сыворотка и моча (урина).

По изобретению на первом этапе для удаления веществ-ингибиторов преимущественно пробы кала инкубируют с материалами, имеющими сорбционные свойства. Содержащиеся в пробах клетки лизируют с буфером, содержащим хаотропные соли.

Геномную ДНК - ДНК онкогена Ki-ras с возможными измененными участками ее последовательности - затем связывают с минеральным веществом-носителем, очищают в дальнейшем процессе промывки, а потом отделяют от материала-носителя с помощью буферного раствора с невысокой концентрацией ионов. Затем на заключительном этапе очистки удаляют вещества-ингибиторы, связанные с геномной ДНК. Именно эти связанные с геномной ДНК вещества представляют собой наиболее мощные ингибиторы. Их вытесняют из уже выделенной геномной ДНК инкубированием совместно с буферным раствором с концентрацией ионов более 4 М, содержащим хаотропную соль, например йодид натрия. Последующая добавка вещества-носителя для повторного связывания геномной ДНК, последующая промывка и элюирование геномной ДНК представляют собой окончание процесса очистки. Изолированную таким образом из проб геномную ДНК предоставляют для дальнейшего молекулярно-биологического исследования.

По изобретению последовательно осуществляют следующие этапы очистки:
а) в случае необходимости, если используют пробу каловой массы, для удаления веществ-ингибиторов инкубирование ведут преимущественно с хроматографическими материалами, обладающими адсорбционными свойствами, предпочтительно с раствором-суспензией активированного угля;
б) лизис содержащихся в пробах материала клеток ведут с использованием буферного раствора, содержащим хаотропные соли, как, например, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуаднидина, хлорид лития или смесь из хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М;
в) инкубирование лизата с минеральным веществом-носителем для связывания геномной ДНК, причем в качестве вещества-носителя предпочтительно применяют высокодисперсные, непористые частицы SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, с удельной поверхностью 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г;
г) отделение вещества-носителя от лизата центрифугированием;
д) промывка связанной с веществом-носителем геномной ДНК, предпочтительно буферным раствором промывки, состоящим из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl (универсальный буферный раствор) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты - ЭДТА, а также 70 объемных процентов этанола, и отделение геномной ДНК инкубированием при температуре 48-65^oС вещества-носителя с буферным раствором с небольшой концентрацией ионов, содержащем предпочтительно 10 мМ Tris HCl, 0,1 мМ ЭДТА;
е) инкубирование отделенной геномной ДНК с буферным раствором, содержащим хаотропную соль, предпочтительно йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия с концентрацией ионов более 4 М, при непрерывном встряхивании, предпочтительно с 5 М раствором йодида натрия, для удаления веществ, связанных с геномной ДНК.

ж) повторное инкубирование буферного раствора с геномной ДНК и минеральным веществом-носителем, предпочтительно из высокодисперсных непористых частиц SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, при удельной поверхности 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г;
з) отделение раствора от минерального вещества-носителя центрифугированием;
и) промывка вещества-носителя со связанной геномной ДНК, предпочтительно буферным раствором, состоящим из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl и 1 мМ ЭДТА, а также 70 объемных процентов этанола, и повторное отделение связанной геномной ДНК буферным раствором с небольшой концентрацией ионов, предпочтительно 10 мМ Tris HCl, 0,1 мМ ЭДТА, при температуре 48-65^oС.

Для экстрагирования по изобретению применяют или непрерывный хроматографический способ в колонках, или непрерывный хроматографический способ формата плат для микротитрования.

Общий процесс экстрагирования требует менее 2 часов для, по крайней мере, 10 различных проб, что впервые, таким образом, идеально решает проблему экстрагирования геномной ДНК из проб каловой массы и других материалов. Способ по изобретению за крайне короткое время позволяет выделить геномную ДНК из отрубевиых клеток проб каловой массы, причем предпочтительное использование раствора-суспензии активированного угля неожиданно позволило способом очистки по изобретению удалить вещества-ингибиторы, прямо не связанные с геномной ДНК.

Затем обнаружение клинически релевантных изменений последовательности ДНК онкогена Ki-ras в соответствии с изобретением осуществляют через комплементарные реакции гибридизации оснований известными методами, по крайней мере, с шестью различными олигонуклеотидами определенной комплементарности к возможно мутационно измененным участкам последовательности ДНК онкогена Ki-ras.

После окончания экстракции геномной ДНК из клинической пробы следует генерирование, выделение последовательности ДНК онкогена Ki-ras, подлежащей анализу.

Олигонулеотиды и подлежащие обнаружению измененные участки последовательности ДНК онкогена Ki-ras инкубируют, причем маркируют или олигонуклеотиды, или обнаруживаемые измененные участки последовательности ДНК онкогена Ki-ras, а обнаружение результата, факта гибридизации определяют по маркированию или с применением других известных способов, используемых для обнаружения результата, факта гибридизации двуцепочечной ДНК.

Для этого олигонуклеотиды и/или измененные участки последовательности ДНК онкогена Ki-ras, или гибридизированную ДНК наносят на твердую фазу, предпочтительно на плату для микротитрования, световод или чип из кремния, особенно предпочтительно на микротест-плату.

Амплификационную реакцию осуществляют с использованием пары праймеров, причем один из праймеров в его 5' позиции связан маркированием, предпочтительно маркированием биотином. Генерированный, выделенный после окончания реакции размножения фрагмент ДНК тоже маркируют. Это маркирование в предпочтительном варианте позволяет осуществить связь амплифицированного фрагмента ДНК онкогена Ki-ras с поверхностью, покрытой стрептавидином твердой фазы, преимущественно с поверхностью микротест-платы по мосту стрептавидин-биотин.

Связанный на поверхности двуцепочечный фрагмент ДНК переводят в одну цепь добавкой известного раствора денатурирования, например, NaOH. После отсасывания раствора денатурирования на поверхности микротест-платы остается только цепь ДНК, зафиксированная мостом стрептавидина-биотин. Все это представляет собой объект анализа и соответствует участку ДНК онкогена Ki-ras, исследуемому на мутацию отдельных оснований. Одноцепочечный участок ДНК онкогена Ki-ras, зафиксированный на плате, воздействием стандартного буфера гибридизации последующими стадиями инкубируют с аллело-специфическими олигонуклеотидами - зондами гибридизации. В связи с этим олигонуклеотиды соответствуют возможной точечной мутации ДНК онкогена Ki-ras или последовательности дикого типа Ki-ras.

В соответствии с изобретением выбор олигонуклеотидов осуществляют в аспекте проведения реакций гибридизации для каждого из различных аллело-специфических олигонуклеотидов, применяя абсолютно идентичные параметры реакции, для одновременного осуществления тестов различных точечных мутаций на микротест-плате.

Решающий фактор для обнаружения мутации отдельного основания ДНК состоит в высокооптимизированных реакционных условиях для важных этапов промывки после окончания реакции гибридизации.

В соответствии с изобретением после инкубирования в течение 15-45 минут, предпочтительно 30 минут, при температуре 38-45^oС, предпочтительно 42^oС, осуществляют от одного до пяти, предпочтительно три, этапа промывки, в течение 5-15 минут, предпочтительно 10 минут, при температуре 45-55^oС промывным раствором из додецилсульфата натрия (SDS - sodium dodecyl sulfate) и смеси хлорида и цитрата натрия (SSC - sodium chloride и sodium citrate), предпочтительно 0,03% додецилсульфата и 0,03% смеси хлорида и цитрата натрия при температуре 50^oС в течение 10 минут.

В связи с этим решающим фактором является то, что продукт гибридизации сохраняется только при полной комплементарности оснований между таргетом гена Ki-ras и соответствующим олигонуклеотидом гибридизации, а каждая некомплементарность основания ведет к селективному удалению зонда олигонуклеотидов.

Эти условия идеальным образом возможно выполнить в способе по изобретению, поскольку оптимизированные условия промывки позволяют дополнительно одновременно осуществить тест по обнаружению шести различных мутаций ДНК онкогена Ki-ras на тест-плате.

Обнаружение результата гибридизации осуществляют по известному косвенному способу колориметрического обнаружения ферментов. Способ основан на том, что олигонуклеотиды гибридизации имеют стандартное маркирование, например дигоксигенином или флуороизотиогуанатом (FITC-Fluorescemisothiocyanat), против которого используют сопряженные с ферментами антитела. После добавки субстратного раствора определяют интенсивность цветной реакции - параметра для обнаружения результата гибридизации - путем ее измерения в проходящем свете в устройстве считывания микротест-плат. Стандартные пробы ДНК для обнаружения мутации гена Ki-ras или дикого типа гена Ki-ras используются в качестве опорных величин при оценке анализов проб.

Обнаружение осуществляют предпочтительно на платах для микротитрования, предоставляя, таким образом, преимущество возможности анализа множества различных проб и позволяя автоматизацию способа.

Известные до сих пор способы обнаружения мутаций по реакциям гибридизации осуществляют только путем применения известных молекулярно-биологических методов, как, например, Dot - Blot - гибридизации на мембранных фильтрах, в рамках которых обнаружение реакции гибридизации осуществляют по обнаружению радиоактивного маркирования. Такой метод занимает много времени и, кроме того, очень опасен в связи с применением радиоактивных методов обнаружения, который также невозможно автоматизировать.

Способ по изобретению требует времени около 8 часов, включая экстракцию ДНК из проб. Это время впервые позволяет определять состояние онкогена Ki-ras в обычной лабораторной диагностике для раннего выявления злокачественных изменений, предпочтительно толстой кишки и поджелудочной железы, как самого важного клинического параметра.

Такая диагностика существенно содействует снижению норм смертности этих заболеваний.

Кроме того, это изобретение включает набор для теста раннего выявления опухолей по обнаружению мутаций в гене Ki-ras. Комплект для теста характеризуется модульной структурой и включает:
1. Систему для экстракции ДНК, которая предпочтительно включает:
а) раствор-суспензию из активированного угля для удаления веществ-ингибиторов, если используют пробу каловой массы;
б) буферный раствор для лизиса содержащихся в пробах материала клеток, содержащий хаотропные соли, как, например, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, хлорид лития или смеси из хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол (DTT - Dithiotreitol), цитрат натрия;
в) для инкубирования лизата - минеральный носитель для связывания ДНК, предпочтительно высокодисперсные, непористые частицы SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, при удельной поверхности в 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г;
г) буферный раствор промывки, состоящий из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HC1 и 1 мМ ЭДТА, а также 70 объемных процентов этанола, и для отделение ДНК инкубированием вещества-носителя - буферный раствор с небольшой концентрацией ионов, предпочтительно 10 мМ Tris HCl; 0,1 мМ ЭДТА,
д) дополнительный буферный раствор для инкубирования отделенной геномной ДНК, содержащий хаотропную соль, предпочтительно йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно 5 М йодид натрия;
е) буферный раствор для промывки связанного с ДНК вещества-носителя, состоящий из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl и 1 мМ ЭДТА, а также 70 объемных процентов этанола.

2. Первичное смешивание для селективной амплификации исследуемой обнаруживаемой последовательности ДНК онкогена Ki-ras.

3. Контрольные клеточные линии ДНК для амплификации дикого типа гена Ki-ras или мутированного типа клеточной линии гена Ki-ras,
4. Шесть зондов олигонуклеотидов с последовательностями:
5'-GTT-GGA-GCT-CGT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-TGT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-AGT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GCT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GAT-GGC-GTA-3'
5'-GTT-GGA-GCT-GTT-GGC-GTA-3'
5. Твердую фазу, предпочтительно плату для микротитрования, включая реагенты, необходимые для проведения теста, как написано выше.

Способ обнаружения и набор для теста применяют предпочтительно при исследовании ДНК каловой массы для раннего выявления желудочно-кишечных опухолей, специально для раннего выявления предопухолевых, воспалительных заболеваний, сопряженных с ростом ткани.

В связи с универсальностью способа экстракции ДНК и модульной структурой набора для теста возможно исследование клинически релевантных исходных материалов на мутации ДНК онкогена Ki-ras. При этом система обнаружения остается всегда постоянной.

Собственные результаты исследований показали наличие мутации Ki-ras после экстракции ДНК из секретов поджелудочной железы - еrрс-пробы. Таким образом, впервые возможно выявить у больных из группы риска заболевания опухолями поджелудочной железы после исследования этого материала проб. Специалист знает, что воспалительные процессы поджелудочной железы - острые или хронические панкреатиты - могут часто перерождаться в злокачественные фенотипы. Но в момент обнаружения существующей опухоли поджелудочной железы ее больше невозможно лечить. Таким образом, возможно привлечь для постановки соответствующего прогноза обнаружение мутационных изменений ДНК онкогена Ki-ras как решающий параметр.

Кроме того, способ по изобретению идеальным образом пригоден для исследования проб биоптатов из желудочно-кишечных полипов после их эндоскопического взятия. И на основе этих проб через обнаружение мутации онкогена Ki-ras возможно рано ставить диагноз возможных злокачественных изменений и возможно классифицировать больных как больных группы риска. Своевременным хирургическим удалением полипов с мутированным онкогеном Ki-ras возможно предотвратить образование опухоли. До сегодняшнего дня такая постановка диагноза не осуществлялась из-за отсутствия подходящей стандартной системы обнаружения.

В соответствии с изобретением для исследования обнаруживаемой последовательности ДНК онкогена Ki-ras применяют, по крайней мере, шесть различных олигонуклеодидов, которые показывают определенную комплементарность к известным мутационно измененным участкам последовательности ДНК онкогена Ki-ras. Таким образом, возможно ясно обнаружить больше чем 80% всех мутаций онкогена Ki-ras, связанных с злокачественным фенотипом.

В заключении изобретение объясняется во всех подробностях на примере осуществления - обнаружение точечных мутаций ДНК онкогена Ki-ras в каловой массе.

Загрузка около 300-500 мг пробы каловой массы в реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 2,0 мл. Добавка 350 мкл раствора промывки, содержащий NaCl, Tris (стандартный буфер - гидроксиметиламинометан), ЭДТА и его предварительная обработка.

Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 2 мин при 14000 об/мин и ее загрузка в новый реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 2 мл.

Добавка 250 мкл раствора, суспензии из активированного угля, встряхивание пробы в течение 10 мин. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 2 мин при 14000 об/мин и ее загрузка в новый реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 1,5 мл. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 1 мин при 14000 об/мин и ее загрузка в новый реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 2 мл.

Добавка 1 мл буферного раствора, содержащего изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол (DTT), цитрат натрия для лизиса клеток, и инкубирование в течение 30 мин при температуре помещения.

Добавка 20 мкл минеральной суспензии носителя из высокодисперсных непористых частиц SiO₂ с размером зерна около 40 нм и удельной поверхностью около 50 м²/г и инкубирование в течение 5 мин при температуре помещения. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 1 с при 10000 об/мин и ее осторожное удаление.

Добавка 1 мл буферного раствора промывки, содержащий NaCl, Tris, ЭДТА, этанол, и повторное превращение остатка в суспензию. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 1 с при 10000 об/мин и ее осторожное удаление. Двухразовое повторение стадии промывки. Короткое инкубирование открытого реакционного сосуда при температуре 60^oС до полного удаления этанола.

Добавка 100 мкл раствора элюирования, содержащего 10 мМ Tris HCl, 0,1 мМ ЭДТА, повторное превращение остатка в суспензию и инкубирование реакционного сосуда в течение 5 мин при 60^oC. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 2 мин при 14000 об/мин и ее загрузка в новый реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 1,5 мл. Смешивание выделенной ДНК с раствором йодида натрия при легком встряхивании в течение 5 мин.

Повторная добавка 15 мкл минеральной суспензии носителя в буферный раствор с геномной ДНК и инкубирование в течение 5 мин на льду. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 1 с при 10000 об/мин и ее осторожное удаление.

Добавка 1 мл буферного раствора промывки и повторное превращение остатка в суспензию. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 1 с при 10000 об/мин и ее осторожное удаление. Двухразовое повторение промывной стадии. Короткое инкубирование открытого реакционного сосуда при температуре 60^oC до полного удаления этанола. Добавка 50 мкл буферного раствора для элюирования, содержащего 10 мМ Tris HCl, 0,1 мМ ЭДТА, повторное превращение остатка в суспензию и инкубирование реакционного сосуда в течение 5 мин при 60^oC. Центрифугирование отстоянной жидкости, расположенной вверху, в течение 2 мин при 14000 об/мин и ее загрузка в новый реакционный сосуд Эппендорфа емкостью 1,5 мл.

После экстракции 1-10 мкл ДНК для ферментативного размножения исследуемой специфической выявляемой последовательности гена Ki-ras используют цепную реакцию полимеразы - ЦРП.

В связи с этим в течение первой реакции ЦРП осуществляют амплификацию смесью праймеров, где во время амплификационной реакции ДНК гена дикого типа Ki-ras генерируется ограничивающий стык. Однако этот стык не будет устроен во всех амплифицированных фрагментах ДНК, не соответствующих дикому типу.

После окончания амплификационной реакции ДНК гена дикого типа Ki-ras разрезают с применением ограничивающего фермента.

Во второй амплификационной реакции в качестве матрицы ДНК используют 1-2 мкл ограничивающей исходной смеси. При этом осуществляют селективное обогащение не разрезанных мутированных фрагментов ДНК гена Ki-ras. Эта амплификационная реакция осуществляется с использованием пары праймеров, где один праймер маркирован биотином на его 5' позиции.

После окончания реакции амплификации 1-5 мкл продукта амплификации вносят в 420 мкл буферного раствора связывания, содержащего Tris, этилендиаминтетрауксусную кислоту, NaCl.

50 мкл этой исходной смеси наносят на 7 отверстий-wells микротест-платы. Затем эти отверстия-wells служат для анализа фрагмента ДНК гена Ki-ras на мутационные изменения.

После короткого инкубирования связывающий буферный раствор отсасывают, добавляют 50 мкл раствора денатурации, содержащего NaOH, и инкубируют при легком встряхивании. Этим генерируют, выделяют одну цепь ДНК, против которой впоследствии осуществляют специфическую для последовательности реакцию гибридизации. После удаления второй цепи ДНК, не зафиксированной на поверхности платы с помощью буферного раствора промывки, содержащего tris, этилендиаминтетрауксусная кислота, NaCl, каждое из 7 отверстий-wells микротест-платы увлажняют одним из специфических маркированных, например, дигооксигенином или флуороизотиогуанатом (FITC), зондов олигонуклеотидов под стандартным буферным раствором гибридизации.

После инкубирования в течение 30 минут при температуре 42^oС осуществляют гибридизацию соответствующих зондов с фрагментом ДНК гена Ki-ras, связанным с поверхностью платы.

Специфичность обнаружения достигают осуществлением дополнительных стадий промывки в чрезвычайно строгих условиях. Эти стадии промывки осуществляют трижды раствором из 0,03% додецилсульфата натрия (SDS); 0,03% смеси хлорида и цитрата натрия (SSC) при температуре 50^oС в течение 10 мин. В этих условиях удаляют все зонды, не показывающие полной комплементарности оснований к выявляемой последовательности ДНК гена Ki-ras.

В последующем осуществляют обнаружение результата гибридизации известными колориметрическими методами, применяя устройства для считывания плат для микротитрования. В связи с этим измеренная интенсивность сигнала служит критерием оценки для обнаружения продукта гибридизации, а таким образом, обнаружения мутации ДНК гена Ki-ras или гена дикого типа Ki-ras.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения клинически релевантных изменений последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) онкогена Ki-ras, характеризующийся тем, что в качестве ДНК используют геномную ДНК онкогена Ki-ras, экстрагирование геномной ДНК из проб материала для анализа осуществляют многократными этапами очистки для удаления мешающих веществ-ингибиторов, а обнаружение изменений осуществляют по результату комплементарной реакции гибридизации оснований после добавления шести олигонуклеотидов с определенной комплементарностью к измененной последовательности участков геномной ДНК со следующими последовательностями:
5'-GTT-GGA-GCT-CGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-TGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-AGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-GCT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-GAT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-CTT-GGC-GTA-3'.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при экстрагировании геномной ДНК в качестве этапов очистки используют лизис содержащихся в пробе материала клеток с помощью буферного раствора, содержащего хаотропные соли, инкубирование лизата с минеральным веществом-носителем для связывания геномной ДНК, отделение вещества-носителя со связанной геномной ДНК от лизата центрифугированием, промывку связанной с веществом-носителем геномной ДНК буферным раствором промывки, элюирование геномной ДНК инкубированием вещества-носителя с буферным раствором с небольшой концентрацией ионов, инкубирование отделенной геномной ДНК с содержащим хаотропную соль буферным раствором для удаления из геномной ДНК связанных с ней веществ, повторное инкубирование буферного раствора с отделенной геномной ДНК с минеральным веществом-носителем, отделение раствора от минерального вещества-носителя центрифугированием, промывку вещества-носителя со связанной геномной ДНК раствором промывки, элюирование связанной геномной ДНК с помощью буферного раствора с небольшой концентрацией ионов.

3. Способ по пп. 1 и 2, характеризующийся тем, что в качестве первого этапа очистки для удаления мешающих веществ-ингибиторов используют инкубирование ее с хроматографическими веществами, обладающими адсорбционными свойствами.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве хроматографического материала используют раствор-суспензию из активированного угля.

5. Способ по п.2, характеризующийся тем, что при экстрагировании в качестве хаотропных солей для лизиса используют изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, хлорид лития или смеси из хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М, в качестве минерального вещества-носителя используют непористые частицы SiO₂ с размером зерна 7 нм-1 мкм, предпочтительно 40 нм, и удельной поверхностью 10-300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г, в качестве буферного раствора промывки используют смесь, состоящую из 50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, а также 70 об.% этанола, в качестве буферного раствора небольшой концентрации для элюирования ДНК используют 10 мМ Tris HСl, 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, а элюирование ведут при 48-65^oС, в качестве буферного раствора для инкубирования элюированной геномной ДНК используют раствор, содержащий йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия, при концентрации ионов более 4 М, а инкубирование ведут при непрерывном встряхивании.

6. Способ по п.2, характеризующийся тем, что в качестве буферного раствора для лизиса используют раствор, содержащий изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол и цитрат натрия, а для повторного инкубирования - раствор, содержащий 5 М йодида натрия.

7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что комплементарную реакцию гибридизации оснований проводят инкубированием олигонуклеотидов и участков геномной ДНК с измененной последовательностью, подлежащей обнаружению, причем или олигонуклеотиды, или участки геномной ДНК с измененной последовательностью, подлежащей обнаружению, маркированы, а обнаружение результата гибридизации проводят по маркированию или другими методами обнаружения гибридизации для двуцепочечной ДНК.

8. Способ по пп.1 и 7, характеризующийся тем, что олигонуклеотиды и/или участки геномной ДНК с измененной последовательностью или гибридизированную ДНК наносят на твердую фазу.

9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что в качестве твердой фазы используют плату для микротитрования, световод или чип из кремния.

10. Способ по п.7, характеризующийся тем, что геномную ДНК с последовательностью, подлежащей обнаружению, амплификацируют парой праймеров, причем один праймер маркирован в его 5' позиции, связывают с твердой фазой, переводят в одну цепь, инкубирование ведут в течение 15-45 мин при 38-45^oС и затем промывают от одного до пяти раз в течение 5-15 мин раствором промывки, содержащим додецилсульфат натрия или смесь хлорида и цитрата натрия, при 45-55^oС.

11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что связывание с твердой фазой осуществляют через стрептавидин-биотиновый мост, инкубирование ведут в течение 30 мин при в 42^oС, а промывку - 3 раза по 10 мин раствором, содержащим 0,03% додецилсульфат натрия и 0,03% смеси хлорида и цитрата натрия, при 50^oС.

12. Способ по пп.1 и 2, характеризующийся тем, что в качестве проб материала клеток для анализа используют каловую массу, жидкости секрета поджелудочной железы и полипы кишки, полученных при эндоскопии.

13. Набор для теста раннего выявления опухолей на основе клинически релевантных изменений последовательности ДНК онкогена Ki-ras, преимущественно для раннего выявления опухолей поджелудочной железы и толстой кишки на основе анализа каловой массы, включающий систему экстракции ДНК, содержащую раствор для удаления веществ-ингибиторов, буферный раствор для лизиса, содержащий хаотропные соли, минеральный носитель для связывания ДНК, буферный раствор промывки, буферный раствор инкубирования, дополнительный буферный раствор инкубирования, содержащий хаотропные соли; смесь праймеров для селективной амплификации исследуемой выявляемой последовательности ДНК гена Ki-ras; контрольные клеточные линии ДНК для амплификации дикого типа гена Ki-ras или мутированного типа клеточной линии гена Ki-ras; зонды олигонуклеотидов, где используют олигонуклеотиды со следующими последовательностями:
5'-GTT-GGA-GCT-CGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-TGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-AGT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-GCT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-GAT-GGC-GTA-3';
5'-GTT-GGA-GCT-CTT-GGC-GTA-3',
твердую фазу в виде платы для микротитрования, световода или чипа из кремния; раствор промывки из додецилсульфата натрия и смеси хлорида и цитрата натрия.

14. Набор по п.13, включающий раствор для удаления мешающих веществ-ингибиторов, отличающийся тем, что он представляет собой суспензию из активированного угля.

15. Набор по п.13, включающий буферный раствор лизиса, содержащий хаотропные соли, отличающийся тем, что в качестве хаотропных солей буферный раствор лизиса содержит изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, хлорид лития или смесь хлорида лития и мочевины с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно изотиоцианат гуанидина, дитиотриитол, цитрат натрия.

16. Набор по п.13, включающий минеральный носитель для связывания ДНК, отличающийся тем, что в качестве минерального носителя используют суспензию непористых частиц SiO₂ с размером зерна 7 нм - 1 мкм, предпочтительно 40 нм, и удельной поверхностью 10 - 300 м²/г, предпочтительно 50 м²/г.

17. Набор по п.13, включающий буферный раствор промывки, отличающийся тем, что буферный раствор содержит NaCl, Tris HCl, этилендиаминтетрауксусную кислоту, а также 70 об.% этанола.

18. Набор по п.13, включающий буферный раствор инкубирования, отличающийся тем, что раствор содержит Tris HCl, этилендиаминтетрауксусную кислоту с небольшой концентрацией ионов.

19. Набор по п.13, включающий дополнительный буферный раствор инкубирования, содержащий хаотропные соли, отличающийся тем, что в качестве хаотропных солей буферный раствор содержит йодид натрия, перхлорат натрия или йодид калия с концентрацией ионов более 4 М, предпочтительно 5 М йодида натрия.

20. Набор по п.13, включающий твердую фазу, отличающийся тем, что твердая фаза имеет поверхность, покрытую стрептавидином.