Способы ретентатной хроматографии для разделения аналитов в образце

 

Изобретение относится к биологии и медицине, к способам ретентатной хроматографии для разделения аналитов в образце. Данные способы предусматривают адсорбирование аналитов на субстрате во множестве различных условий селективности и обнаружение удержанных на субстрате аналитов десорбционной спектрометрией. Способы обеспечивают возможность проводить клиническую диагностику и скрининг новых лекарств с высокой точностью. 2 с. и 45 з.п.ф-лы, 33 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Способ идентификации аналитов, которые дифференциально представлены в первом и втором биологическом образцах, предусматривающий следующие этапы: а) выбор множества различных условий селективности, в которых обрабатываются первый и второй образцы, в ходе которого: i) каждое условие селективности определяется комбинацией адсорбента и элюанта, ii) в каждом отличающемся условии селективности присутствуют другой адсорбент и тот же самый или другой элюант и iii) обработка образца при определенном условии селективности включает приведение образца в контакт с адсорбентом, связанным субстратом, и промывку адсорбента элюантом с целью удержания аналита в образце с помощью адсорбента; б) определение аналитов в первом образце путем: i) параллельной обработки первого образца при каждом из различных условий селективности и ii) определения аналитов, удержанных адсорбентами, с помощью масс-спектрометрии, при этом масс-спектрометрия включает десорбцию и ионизацию аналита из адсорбента с помощью источника энергии и обнаружение десорбированных и ионизированных аналитов с помощью детектора; в) определение аналитов во втором образце путем: i) параллельной обработки второго образца при каждом из различных условий селективности и ii) определения аналитов, удержанных адсорбентами, с помощью масс-спектрометрии, а также г) сравнение аналитов, обнаруженных в первом биологическом образце, с аналитами, обнаруженньми во втором биологическом образце, с целью идентификации аналитов, которые дифференциально представлены в первом и втором биологическом образце.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первый биологический образец получен от здорового субъекта, а второй биологический образец получен от субъекта, страдающего от патологического процесса.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологический образец включает первый и второй клеточные экстракты.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап сравнения аналитов, обнаруженных в первом и втором образце, производится с помощью программируемого цифрового компьютера.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что различные адсорбенты имеют различную основу притяжения, и основы притяжения выбираются из группы, состоящей из адсорбентов гидрофобного взаимодействия, гидрофильного взаимодействия, анионного взаимодействия, катионного взаимодействия, координатного ковалентного взаимодействия, триофильного взаимодействия и гликопротеинового взаимодействия.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что различные адсорбенты представляют собой различные биоспецифичные адсорбенты.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в нем используются одни и те же элюанты.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюанты выбираются из группы, состоящей из элюанта на основе рН, элюанта на основе ионной силы, элюанта на основе структуры воды, элюанта на основе детергентов и элюанта на основе гидрофобности.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выбираются по меньшей мере четыре различных условия селективности.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед этапом (а) осуществляется этап введения агента в первый биологический образец, но не во второй биологический образец.

11. Способ по п. 1, отличающийся повторением этапов б) и в) с параллельным использованием условий селективности, при которых используются те же адсорбенты, что и в этапах б) и в), но различные элюанты.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что до этапа определения аналитов включает этап конверсии аналита в по меньшей мере один фрагмент, молекулярная масса которого меньше массы аналита.

13. Способ по п. 2, отличающийся тем, что образец выбран из группы, включающей кровь, мочу, сыворотку и ткань.

14. Способ по п. 2, отличающийся тем, что предусматривает идентификацию аналита, присутствующего в большем количестве во втором биологическом образце, чем в первом биологическом образце, при этом аналит идентифицируется как возможный диагностический маркер патологического состояния.

15. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первый клеточный экстракт получен из здоровой клетки, а второй клеточный экстракт получен из раковой клетки.

16. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первый клеточный экстракт получен из здоровой клетки, а второй клеточный экстракт получен из клетки с патологией.

17. Способ по п. 9, отличающийся тем, что по меньшей мере четыре различных условия селективности определяются адсорбентами, имеющими различную основу притяжения, и основы притяжения выбираются из группы, состоящей из адсорбентов гидрофобного взаимодействия, гидрофильного взаимодействия, анионного взаимодействия, катионного взаимодействия, координатного ковалентного взаимодействия, триофильного взаимодействия и гликопротеинового взаимодействия.

18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что аналиты включают нуклеиновую кислоту.

19. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что аналиты включают углеводы.

20. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что аналиты включают полипептиды.

21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что адсорбент выполняется в виде зонда, который вставляется в масс-спектрометр и состоит из субстрата, обладающего внешней поверхностью, а адсорбент прикреплен к этой поверхности в предопределенном месте, на которое направляется источник энергии.

22. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что адсорбент выполняется в виде бусины, имеющей твердую фазу, к которой крепится адсорбент, причем, после того как образец и адсорбент входят в контакт, бусина помещается на поверхность зонда, который вставляется в масс-спектрометр, в предопределенном месте поверхности, на которое направляется источник энергии.

23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что масс-спектрометр представляет собой лазерный масс-спектрометр с использованием десорбции/ионизации.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что перед проведением масс-спектрометрии аналит приводится в контакт с молекулой, поглощающей энергию.

25. Способ идентификации аналитов, которые дифференциально представлены в первом и втором биологическом образцах, предусматривающий следующие этапы: а) выбор множества различных условий селективности, в которых обрабатываются первый и второй образцы, при котором i) каждое условие селективности определяется комбинацией адсорбента и элюанта ii) в каждом отличающемся условии селективности присутствуют тот же самый адсорбент и другой элюант, и iii) обработка образца при определенном условии селективности включает приведение образца в контакт с адсорбентом, связанным субстратом, и промывку адсорбента элюантом с целью удержания аналита в образце с помощью адсорбента; б) определение аналитов в первом образце путем: i) параллельной обработки первого образца при каждом из различных условий селективности, и ii) определения аналитов, удержанных адсорбентами, с помощью масс-спектрометрии, при этом масс-спектрометрия включает десорбцию и ионизацию аналита из адсорбента с помощью источника энергии и обнаружение десорбированных и ионизированных аналитов с помощью детектора; в) определение аналитов во втором образце путем:
i) параллельной обработки второго образца при каждом из различных условий селективности, и
ii) определения аналитов, удержанных адсорбентами, с помощью масс-спектрометрии, а также
г) сравнение аналитов, обнаруженных в первом биологическом образце, с аналитами, обнаруженными во втором биологическом образце, с целью идентификации аналитов, которые дифференциально представлены в первом и втором биологическом образце.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что первый биологический образец получен от здорового субъекта, а второй биологический образец получен от субъекта, страдающего от патологии.

27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что биологические образцы включают первый и второй клеточные экстракты
28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что этап сравнения аналитов, обнаруженных в первом и втором образце, производится с помощью программируемого цифрового компьютера.

29. Способ по п. 25, отличающийся тем, что адсорбент имеет основу притяжения, выбранную из группы, состоящей из адсорбентов гидрофобного взаимодействия, гидрофильного взаимодействия, анионного взаимодействия, катионного взаимодействия, координатного ковалентного взаимодействия, триофильного взаимодействия и гликопротеинового взаимодействия.

30. Способ по п. 25, отличающийся тем, что адсорбент представляет собой биоспецифичный адсорбент.

31. Способ по п. 25, отличающийся тем, что различные элюанты имеют различные показатели элюции, и показатели элюции выбираются из группы, состоящей из элюанта на основе рН, элюанта на основе ионной силы, элюанта на основе структуры воды, элюанта на основе детергентов и элюанта на основе гидрофобности.

32. Способ по п. 25, отличающийся тем, что выбираются по крайней мере четыре различных условия селективности.

33. Способ по п. 25, отличающийся тем, что перед этапом (а) осуществляется этап введения агента в первый биологический образец, но не во второй биологический образец.

34. Способ по п. 25, отличающийся повторением этапов б) и в) с параллельным использованием условий селективности, при которых используются те же адсорбенты, что и в этапах б) и в), но различные элюанты.

35. Способ по п. 25, отличающийся тем, что до этапа определения аналитов включает этап конверсии аналита в по меньшей мере один фрагмент, молекулярная масса которого меньше массы аналита.

36. Способ по п. 26, отличающийся тем, что образец выбран из группы, включающей кровь, мочу, сыворотку и ткань.

37. Способ по п. 26, отличающийся тем, что предусматривает идентификацию аналита, присутствующего в большем количестве во втором биологическом образце, чем в первом биологическом образце, в результате чего аналит идентифицируется как возможный диагностический маркер патологического состояния.

38. Способ по п. 27, отличающийся тем, что первый клеточный экстракт получен из здоровой клетки, а второй клеточный экстракт получен из раковой клетки.

39. Способ по п. 27, отличающийся тем, что первый клеточный экстракт получен из здоровой клетки, а второй клеточный экстракт получен из клетки с патологией.

40. Способ по п. 32, отличающийся тем, что по крайней мере четыре условия селективности определяются элюантами с различными показателями элюции, и показатели элюции выбираются из группы, состоящей из элюанта на основе рН, элюанта на основе ионной силы, элюанта на основе структуры воды, элюанта на основе детергентов и элюанта на основе гидрофобности.

41. Способ по любому из пп. 25-40, отличающийся тем, что аналиты включают нуклеиновую кислоту.

42. Способ по любому из пп. 25-40, отличающийся тем, что аналиты включают углеводы.

43. Способ по любому из пп. 25-40, отличающийся тем, что аналиты включают полипептиды.

44. Способ по любому из пп. 25-43, отличающийся тем, что адсорбент выполняется в виде зонда, который вставляется в масс-спектрометр и состоит из субстрата, обладающего внешней поверхностью, а адсорбент прикреплен к этой поверхности в предопределенном месте, на которое направляется источник энергии.

45. Способ по любому из пп. 25-43, отличающийся тем, что адсорбент выполняется в виде бусины, имеющей твердую фазу, к которой крепится адсорбент, причем после того как образец и адсорбент вошли в контакт, бусина помещается на поверхность зонда, который вставляется в масс-спектрометр, в предопределенном месте поверхности, на которое направляется источник энергии.

46. Способ по любому из пп. 25-43, отличающийся тем, что масс-спектрометр представляет собой лазерный масс-спектрометр с использованием десорбции/ионизации.

47. Способ по п. 46, далее отличающийся тем, что перед проведением масс-спектрометрии аналит приводится в контакт с молекулой, поглощающей энергию.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151, Рисунок 152, Рисунок 153, Рисунок 154, Рисунок 155, Рисунок 156, Рисунок 157, Рисунок 158, Рисунок 159, Рисунок 160, Рисунок 161, Рисунок 162, Рисунок 163, Рисунок 164, Рисунок 165