Способ выявления канцерогенности химических соединений

 

Изобретение относится к области медицины. Способ выявляет канцерогенность химических соединений, основан на индукции соматических мутаций и пигментнов эпителии глаз эмбрионов рыб Danio rerio (Н), отличается тем, что выявляют в глазах тригетерозиготных по локусам gol, brs и alb эмбрионов клонов мутантных клеток, индуцированных на стадии дробления 60-минутной инкубацией при температуре 30^oС предварительно дехорионизированных эмбрионов, в среде, содержащей тестируемое вещество и систему внешней метаболической активации с последующей инкубацией эмбрионов в чистой среде на протяжении 72 ч и их фиксацией по истечении этого срока в 4%-ном растворе нейтрального формальдегида в течение 24 ч для подсчета количества мозаичных участков в пигментном эпителии глаз. Способ позволяет существенно увеличить возможности тестовых систем, применяемых для оценки безопасности новых лекарственных препаратов и загрязнителей окружающей среды, их информативности и предсказательности.

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к экспериментальной онкологии, молекулярной генетике, фармакологии, экологии.

Согласно современным представлениям в основе развития рака лежит возникновение соматических мутаций в определенных типах генов. Поэтому особый интерес для обнаружения потенциально канцерогенных химических соединений представляют тестовые системы, предназначенные для выявления соматических мутаций, возникающих в отдельных клетках многоклеточных организмов.

В настоящее время известны следующие способы оценки канцерогенного потенциала химических соединений, основанные на индукции соматических мутаций: 1. Индукция соматических мутаций (spot-test) у мышей (Styles J.A., Penman M. G. , The mouse spot test. Evaluation of its performance in identifying chemical mutagens and carcinogens, Mutat-Res. 1985 Nov; v. 154(3), p. 183-204). Для этого используют следующие типы скрещиваний для получения гетерозиготных и полигетерозиготных зародышей мышей: C 57 BL ("дикий тип" - черные) х Т (гомозиготная линия, несущая одну или несколько мутаций в различных генах, определяющих отличную от черной вариацию окраски шерсти) и Т x НТ (другая гомозиготная линия, аналогичная линии Т, но несущая фенотипически сходные мутации в других генных локусах). Затем на 10 день беременности самкам вводят тестируемое вещество одним из стандартных способов. Сразу после рождения животных проверяют на наличие тератогенных эффектов. Визуальная оценка наличия мутагенного эффекта производится на 12 день после рождения. При этом животных умерщвляют и производят визуальный подсчет (иногда с использованием микроскопа) количества измененных по цвету участков шерстяного покрова (пятен), происходящих из мутантных по локусам RS, VMVS, DS меланоцитов. Обычно для изучения одной дозы тестируемого соединения используется не менее 150 животных.

2. Индукция соматических мутаций в щетинках у гетерозиготных самок Drosophila, полученных при скреищвании самок гомозиготной линии у+/у+ (yellow - рецессивный ген, обуславливающий развитие желтой окраски тела и щетинок; ген локализован в Х-хромосоме) и самцов линии sn3/Y (singed3 - извитые щетинки; ген локализован в X-хромосоме) melanogaster (Белицкий Г.A., Шарупич Е.Г., Хованова Е.М., Методические рекомендации по применению соматического мутагенеза в качестве тест системы для ускоренного определения канцерогенов, Москва. 1982, 24 стр.). Через каждые три дня родителей переносят в чистые пробирки с кормом, в которые предварительно внесены определенные дозы тестируемых соединений. Температура в течение опыта поддерживается на уровне 20^oС. По мере вылета особей поколения F1 производят просмотр самок под стереоскопическим микроскопом и фиксируют наличие мутантных щетинок типа у и sn3 и, в зависимости от их количества и сочетания, делают заключение о мутагенном потенциале и генетических механизмах действия тестируемого соединения.

Отмеченные способы обладают рядом ограничений и недостатков. В частности, эксперименты на мышах чрезвычайно трудоемки и дорогостоящи, т.к. требуют относительно большого количества животных (несколько сотен) и имеют большую продолжительность (около 2 месяцев). Кроме того, ряд тестируемых соединений не способны преодолевать плацентарный барьер в силу своих физико-химических свойств или вследствие разрушения ферментными системами тканей плаценты. С другой стороны, тесты на D. melanogaster требуют меньше времени (примерно 1 месяц), однако метаболизм личинок и взрослых особей, а также механизмы развития органов и тканей насекомых сильно отличаются от позвоночных животных. При этом использование внешних систем метаболической активации практически невозможно, т.к. личинки развиваются в воздушной среде и их хитиновый покров практически непроницаем для чужеродных соединений.

Наиболее близким к предлагаемому методу является индукция соматических мутаций в клетках пигментного эпителия глаз гетерозиготных эмбрионов D. rerio (Grunwald-DJ, Streisinger-G. Induction of recessive lethal and specific focus mutations in the zebrafish with ethyl nitrosourea, Genet-Res. 1992 Apr; 59(2), p. 103-16). Для этого эмбрионов рыб, полученных при скрещивании гомозиготных по одному из генов gol, brs или alb животных с особями дикого типа, подвергают воздействию тестируемого соединения на стадии дробления в течениe 60 минут при температуре 28,5^oС. При этом оболочки икринок не удаляются. По истечении срока инкубации икринки отмывают в трех сменах чистой среды и культивируют на протяжении 72 часов в инкубаторе при той же температуре. Затем эмбрионы подвергают фиксации в растворе 4% нейтрального формальдегида в течениe 24 часов. Визуальный осмотр эмбрионов на наличие соматических мутаций производят под контролем стереоскопического микроскопа при 12-24-кратном увеличении в проходящем свете. Общая продолжительность исследования не превышает одной недели, что выгодно отличает его от описанных выше тестов с использованием мышей и D. melanogaster. Однако данный подход обладает следующими недостатками: невысокая чувствительность тестового объекта, обусловленная наличием единственной маркерной мутации; наличие барьера в виде оболочек икринок (хорион), способных препятствовать контакту тестируемых соединений с эмбрионами; относительно невысокая способность эмбрионов рыб, находящихся на стадии дробления, к метаболической активации чужеродных соединений. В результате возрастает вероятность получения ложно негативных результатов вследствие влияния одного из перечисленных факторов или их сочетанного действия, что ограничивает сферу применения этого теста.

Задачей на решение которой направлено изобретение, является: а) увеличениe чувствительности тестового организма на генетическом уровне; б) улучшение доступности объекта для тестируемых соединений; в) усиление способности к биотрансформации химических соединений.

Указанная задача решается путем создания высокочувствительной тестовой системы, способной выявлять различные типы генотоксических нарушений, происходящих в соматических клетках позвоночных животных под воздействием потенциально канцерогенных соединений как прямого, так и опосредованного (т.е. требующих предварительной метаболической активации) действия.

Изобретательский уровень предлагаемого изобретения подтверждается тем, что способ получения соматических мутаций включает в себя следующие, ранее не применяемые для этой цели этапы: 1) используeтся новый подход in organismo к конструированию тестовой системы, сочетающий в себе признаки как системы in vitro (тестируемое соединение и система метаболической активации находятся во внешней по отношению к тестовому объекту культуральной среде), так и in vivo (тестовой объект представляет собой целостный организм позвоночного животного); 2) в качестве тест-организма используeтся тригетерозиготная высокочувствительная линия рыб, несущая фенотипически близкие мутации в генных локусах gol, brs и alb; 3) используется внешняя система метаболической активации проканцерогенов/промутагенов; 4) производится дехорионизация (ферментативное удаление внешних оболочек икринок), повышающая доступность мишени для тестируемых соединений.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Впервые применяемым этапом является получение тригетерозиготных по локусам gol, brs и alb эмбрионов рыб D. rerio посредством скрещивания тригомозиготной по этим локусам линии рыб с рыбами дикого типа или дигомозиготной линии по любым двум локусам с гомозиготной линией по дополнительному локусу.

На втором этапе ранее не использовавшимся подходом является ферментативное удаление внешних оболочек (дехорионизация) икринок, способных в ряде случаев препятствовать проникновению тестируемых соединений или их метаболитов к клеткам-мишеням. Для этого икринки на стадии одной или двух клеток помещают в 5 мл объем 0.5% раствора проназы или 1% раствора трипсина на 1.5 минуты при температуре 25^oС. Затем эмбрионы переносят в чистую среду для культивирования, которая представляет собой разведенный в 3 раза дистиллированной водой раствор Рингера (рН 7.2) содержащий исходно: NaCl - 116 mM, КСl - 2.9 mМ, CaCl₂ - 1.8 mМ, HEPES - 5 mМ. В указанном растворе икринки освобождают от оболочек посредством пипетирования. После удаления оболочек эмбрионы отмываются в трех сменах чистой среды по 100 мл каждая.

Следующим этапом является ранее не применявшееся для данной цели использование внешней системы метаболической активации промутагенов/проканцерогенов, содержащей микросомную фракцию S9 млекопитающих и необходимые кофакторы. Для этого лишенные оболочки эмбрионы на стадии 1-2 клетки переносят вместе с минимальным количеством жидкости (около 20 мкл) в среду, содержащую: а) 0.1 мл раствора тестируемого вещества в одном из стандартных растворителей (вода, ДМСО, этанол); б) 4 мл среды для культивирования; в) 1 мл метаболизирующей смеси, имеющей следующий состав (в расчете на объем 5 мл): S9 - фракция микросом печени, индуцированных Ароклором 1254, крыс - 0.5 мл; солевой раствор, содержащий 1.65 М КСl и 0.4 М MgCl₂ - 0.1 мл; 1 М раствор глюкозо-6-фоcфата - 0.025 мл; 0.1 М раствор НАДФ - 0.2 мл; 0.2 М фосфатный буфер - 2.5 мл; вода дистиллированная - 1.7 мл. При этом метаболизирующая смесь готовится заранее и может сохраняться при 0 градусов в течениe 2 часов до момента использования.

В указанной среде эмбрионы инкубируются в стеклянных пробирках на протяжении 60 минут при температуре 30^oС в термостате.

Затем эмбрионы переносятся в чистую среду для культивирования и отмываются от тестируемого вещества и метаболической смеси в трех сменах чистой среды по 50 мл каждая.

Инкубация эмбрионов производится в среде для культивирования в стаканах или стеклянных чашках Петри при температуре 28.5^oС на протяжении 72 часов.

По истечении указанного срока эмбрионы фиксируют в 4% растворе нейтрального формальдегида на протяжении 24 часов.

Подсчет количества мозаичных (прозрачных) участков на черном фоне пигментного эпителия глаз трехдневных эмбрионов производится визуально под контролем стереоскопического микроскопа при увеличении 12-24 раза в проходящем свете.

Предлагаемое изобретение является оригинальным методом выявления потенциально канцерогенных химических соединений, способным существенно увеличить возможности тестовых систем, применяемых для оценки безопасности новых лекарственных препаратов и загрязнителей окружающей среды, их информативности и предсказательности.

Формула изобретения

Способ выявления канцерогенности химических соединений, основанный на индукции соматических мутаций и пигментном эпителии глаз эмбрионов рыб Danio rerio (Н), отличающийся тем, что выявляют в глазах тригетерозиготных по локусам gol, brs и alb эмбрионов клонов мутантных клеток, индуцированных на стадии дробления 60-минутной инкубацией при 30°С предварительно дехорионизированных эмбрионов, в среде, содержащей тестируемое вещество и систему внешней метаболической активации, с последующей инкубацией эмбрионов в чистой среде на протяжении 72 ч и их фиксацией по истечении этого срока в 4%-ном растворе нейтрального формальдегида в течение 24 ч, и при наличии мозаичных участков в пигментном эпителии глаз эмбрионов рыб выявляют канцерогенное химическое соединение.