Новые пептиды для применения в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний

 

Изобретение относится к новым пептидам, имеющим аминокислотную последовательность из 9-55 аминокислотных остатков, включающим аминокислотную последовательность FTLASAETT (SEQ ID NO:l), фармацевтической композиции для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащей один или более из названных пептидов и фармацевтически приемлемый носитель. 2 с. и 4 з.п.ф-лы, 5 табл., 6 ил.

Изобретение относится к новым пептидам, к их применению для лечения хронического разрушения хряща суставов при аутоиммунных заболеваниях, к фармацевтическим композициям, содержащим указанный пептид, и к способу диагностики, направленной на определение аутореактивных Т-клеток в тестируемом образце.

Работа иммунной системы основана на принципе дискриминации между чужеродными антигенами (не своими антигенами) и аутоантигенами (своими антигенами, являющимися принадлежностью конкретного индивидуального организма), достигаемой в результате развития толерантности по отношению к своим антигенам.

Иммунная система защищает индивидуумов от чужеродных антигенов и при встрече с чужеродным антигеном отвечает активацией специфических клеток, таких как Т- и В-лимфоциты, и продукцией растворимых факторов, таких как интерлейкины, антитела и факторы комплемента. Антиген, на который реагирует иммунная система, подвергается деградации с помощью антиген-представляющих клеток (APCs), и фрагмент антигена, связанный с гликопротеином главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II, экспрессируется на поверхности клетки. Комплекс МНС-гликопротеин-фрагмент антигена представляется Т-клеткам, которые с помощью своих Т-клеточных рецепторов узнают фрагмент антигена совместно с белком МНС класса II, с которым они связаны. Т-клетка становится активированной, т.е. пролиферирует и/или продуцирует интерлейкины, что ведет к экспансии активированных лимфоцитов, направленных на антиген, против которого направлена иммунная атака (Grey et al., Sci. Am., 261:38-46, 1989).

Аутоантигены также постоянно подвергаются процессингу и представлению фрагментов антигена с помощью гликопротеинов МНС Т-клеткам (Jardetsky et al., Nature 353:326-329, 1991). Таким образом, самораспознавание является свойством, присущим иммунной системе. В нормальных условиях иммунная система толерантна к аутоантигенам, и активация иммунного ответа посредством аутоантигенов не осуществляется.

Когда толерантность к аутоантигенам теряется, иммунная система может активироваться против одного или более аутоантигенов, что ведет к активации аутореактивных Т-клеток и продукции аутоантител. Этот феномен известен как аутоиммунная реакция. Так как иммунный ответ в общем виде является деструктивным, т.е. подразумевает разрушение инвазивного чужеродного антигена, аутоиммунные ответы могут вызывать разрушение ткани собственного организма.

Вклад Т-клеток в развитие аутоиммунных заболеваний установлен в нескольких исследованиях. У мышей экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) опосредуется крайне ограниченной группой Т-клеток, объединяемой по их специфичности в отношении одного эпитопа основного белка миелина (МБР) в комплексе с молекулой МНС класса II. У крыс Lewis, линии с высокой восприимчивостью к различным аутоиммунным заболеваниям, заболевание, как показано, опосредуется Т-клетками. У человека аутоиммунные заболевания также, как полагают, связаны с индукцией аутоагрессивных Т-клеток.

Деструктивный аутоиммунный ответ вовлечен в развитие различных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (RA), при котором целостность хряща сустава разрушается под действием хронического воспалительного процесса, возникающего в результате присутствия большого числа активированных лимфоцитов и клеток, экспрессирующих МНС класса II. Само присутствие хряща кажется необходимым для поддержания местного воспалительного ответа: предполагается, что разрушение хряща связано с активностью чувствительных к хрящу аутореактивных Т-клеток при RA (Sigal et al., Clin. Exp. Rheumat. 6:59, 1988; Glant et al., Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester et al., Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (Eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Более того, удаление хряща у больных RA хирургическим путем, как показано, ведет к уменьшению воспалительного процесса (R.S. Laskin, J. Bone Joint Surgery (Am) 72:529, 1990). Белки хряща, следовательно, рассматриваются как аутоантигены-мишени, которые компетентны в отношении стимуляции Т-клеток. Активация этих аутореактивных Т-клеток ведет к развитию аутоиммунного заболевания. Однако идентификация аутоиммунных компонентов, которые играют роль в развитии ревматоидного артрита, до сих пор остается неясной.

Воспалительный ответ, в результате которого наступает разрушение хряща, можно лечить с помощью нескольких лекарств, таких, например, как стероидные лекарства. Однако эти лекарства часто представляют собой такие лекарства-иммуносупрессоры, которые являются неспецифическими и имеют токсические побочные эффекты. Невыгодность неспецифической иммуносупрессии делает их крайне неблагоприятными для лечения.

Антиген-специфическая нетоксичная иммуносупрессорная терапия создает очень привлекательную альтернативу неспецифической иммуносупрессии. Эта антиген-специфическая терапия включает в себя лечение больных аутоантигеном-мишенью или синтетическими пептидами, происходящими от этого антигена и реактивными в отношении Т-клеток. Эти синтетические пептиды соответствуют эпитопам антигена для Т-клеток и могут быть использованы для индукции специфической толерантности Т-клеток как к самим себе, так и к антигену. Хотя десенситизация иммунной системы с помощью того же самого антигена, который отвечает за активацию иммунной системы, кажется парадоксальной, контролируемое введение (ауто)антигена-мишени может быть очень эффективным в отношении десенситизации иммунной системы. Десенситизация, или иммунологическая толерантность, иммунной системы основана на давно наблюдаемом феномене, заключающемся в том, что животные, которым давали с пищей или с помощью ингаляции антиген или эпитоп, менее подвержены развитию системного иммунного ответа в отношении указанного антигена или эпитопа, когда указанный антиген или эпитоп поступает при системном введении.

Гликопротеин-39 хряща человека (НС gp-39) ранее идентифицирован как аутоантиген-мишень при ревматоидном артрите (RA) (Verheijden et al., Arthritis Rheum. 40:1115-1125, 1997). Стратегия, которая последовала за идентификацией относящихся к этому эпитопу НС gp-39, была основана на предположении, что молекулы DR4 или DR1 предрасполагают к развитию RA (Gao et al., Arthritis Rheum. 33:939-946, 1990; Nelson et al., Rheumatoid Arthritis, In Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference. Vol 1, Tsuji et al Ed, Oxford University Press, 1991) на двух уровнях, во-первых, определяя набор Т-клеток и, во-вторых, детерминируя их селекцию. Участвующий эпитоп, найденный среди молекул DR, ассоциированных с RA, может быть вовлечен в селекцию сходного круга пептидов для презентации Т-клеткам (Gregerson et al., Arthritis Rheum. 30:1205-1213, 1987). Предполагаемые связывающие последовательности в первичной структуре НС gp-39 были идентифицированы при использовании связывающего мотива пептида DR4 (В1*0401) (Verheijden et al., Arthritis Rheum. 40:1115-1125, 1997). НС gp-39, белок, состоящий из 362 аминокислот, не считая сигнальной последовательности (Hakala et al., J. Biol. Chem. 268:25803-25810, 1993), содержит шесть районов, вмещающих этот мотив. Отобранные таким образом четыре пептида были синтезированы и протестированы на связывание с вариантами DR1 и DR4 (В1*0401 и 0404), ассоциированными с RA. Все основанные на мотиве пептиды, включающие в себя остатки 103-116, 259-275, 263-275 и 326-338 НС gp-39, как было обнаружено, связываются с высоким относительным сродством с молекулами DRB1*0401. Затем было исследовано узнавание этих пептидов Т-клетками периферической крови больных RA и здоровых доноров. Все основанные на мотиве пептиды легко узнавались у больных RA, в результате чего предполагается высокая встречаемость специфичных в отношении НС gp-39 Т-клеток при RA. Ответ на 263-275 был наиболее выражен; 8 из 18 больных RA отвечали на этот пептид (Verheijden et al., Arthritis Rheum. 40:1115-1125, 1997). Таким образом, НС gp-39 является мишенью для иммунного узнавания в суставе.

Значение этого белка для заболевания артритом было далее продемонстрировано по его способности индуцировать артрит у мышей линии Balb/c. Однократное введение в район грудной клетки мкг количеств белка, смешанного с IFA (неполным адъювантом Фрейнда), вызывало хроническое воспаление сустава, напоминающее RA (Verheijden et al., Arthritis Rheum. 40:1115-1125, 1997).

Недавно был выделен и описан новый белок хондроцитов человека YKL-39 (Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 19415-19420, 1996). Белок проявляет значительную идентичность последовательности с НС gp-39 (YKL-40). Другой гомолог НС gp-39 секретируется макрофагами человека и обозначается как хитотриозидаза (Boot et al., J. Biol. Chem. 270: 26252-26256, 1995). Последовательности, соответствующие пептиду RSFTLASSETGVG НС gp-39 (263-275) (SEQ ID N0:3), идентифицированы как HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO:2) в белке YKL-39 (266-278) и как RSFTLASSSDTRVG (SEQ ID NO: 4) в хитотриозидазе макрофагов (269-282) соответственно (таблица 1).

Пептид хитотриозидазы Chi (269-282) содержит мотив связывания пептида DRB1*0401, который ранее использовали для селекции эпитопов Т-клеток в белках. Напротив, пептид YKL-39 (266-278) не содержит этот 0401 мотив.

Должно быть ясно, что возникновение толерантности реактивных к НС gp-39 (263-275) Т-клеток может быть выгодно больным RA. Сходным образом, мимикрийные эпитопы НС gp-39 (263-275) могут выполнять сходную функцию и могут быть использованы для индукции толерантности. Предпочтительно, чтобы такие мимикрийные эпитопы обладали, по меньшей мере, такой же способностью вызывать толерантность.

Для эффективного применения терапии с помощью индукции толерантности при лечении разрушения хряща, опосредуемого Т-клетками, возникает существенная потребность в идентификации реактивных в отношении Т-клеток пептидов, которые могут десенситизировать больных к действию аутоантигена, который активирует Т-клетки, отвечающие за процесс воспаления.

Хотя пептид YKL-39 не содержит мотив 0401, неожиданно было обнаружено, что эпитоп YKL-39 (266-278) является мимикрийным эпитопом НС gp-39 (263-275).

Этот эпитоп, следовательно, применим для индукции толерантности аутореактивных Т-клеток с активностью, направленной на НС gp-39 (263-275), YKL-39 (266-278) или их мимикрийные эпитопы у больных ревматоидным артритом.

Целью изобретения является предложение пептидов, которые способны вызывать системную иммунологическую толерантность, более конкретно, толерантность специфичных Т-клеток, предпочтительно в отношении реактивного антигена хряща у больных, страдающих опосредуемым Т-клетками разрушением хряща. Пептиды настоящего изобретения характеризуются тем, что они включают в себя одну или более аминокислотных последовательностей FTLASAETT (SEQ ID NO:l). Более конкретно, пептид согласно изобретению включает в себя HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO:2).

В объем изобретения также включены мультимеры пептидов согласно изобретению, такие, например, как димер или тример пептидов согласно изобретению. Мультимер согласно изобретению может быть либо гомомером, состоящим из множества одинаковых пептидов, либо гетеромером, состоящим из различных пептидов.

Типичные аминокислотные последовательности пептидов согласно изобретению могут примыкать к случайным аминокислотным последовательностям. Предпочтительными являются фланкирующие последовательности, которые обладают стабилизирующим действием на пептиды, увеличивая тем самым их биологическую доступность.

Гликопротеин 39 хряща человека является аутоантигеном-мишенью у больных RA, который активирует специфичные Т-клетки, вызывая тем самым или опосредуя воспалительный процесс. Пептиды из НС gp-39 преимущественно узнавались аутореактивными Т-клетками больных RA, но редко Т-клетками здоровых доноров, что указывает, таким образом, на то, что НС gp-39 является аутоантигеном при RA. Вызывающая артрит природа НС gp-39 была впоследствии подтверждена у мышей линии Balb/c. Однократное подкожное введение указанного белка мышам линии Balb/c было способно вызывать признаки артрита у животных. Ход индуцированного НС gp-39 заболевания характеризовался периодически происходящими рецидивами в четырех лапах и/или задних лапах и постепенно развивался от артрита средней тяжести к более тяжелой форме заболевания. Аналогичным образом наблюдалось симметричное распределение поврежденных суставов, что вместе с наблюдением повторяющихся рецидивов напоминает развитие заболевания при артрите, особенно RA.

Неожиданно было обнаружено, что пептид YKL-39 266-278 эффективен в качестве индуктора толерантности. Для специалиста должно быть ясно, что пептиды могут быть расширены с любой стороны пептида или с обеих сторон и при этом будут проявлять ту же иммунологическую функцию. Расширяющая часть может быть аминокислотной последовательностью, сходной с природной последовательностью белка YKL-39.

Пептиды согласно изобретению могут быть получены хорошо известными способами органической химии для синтеза пептидов, такими, например, как твердофазный пептидный синтез, описанный, например, в J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963) и Int. J. Petide Protein Res. 35:161-214 (1990). Пептиды согласно изобретению могут быть также получены с помощью методов рекомбинантной ДНК. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид согласно изобретению или мультимер указанных пептидов, вставляют в экспрессирующий вектор. Подходящие экспрессирующие векторы содержат необходимые области контроля репликации и экспрессии. Экспрессирующий вектор может быть перенесен для экспрессии в клетку-хозяина. Подходящими клетками-хозяевами являются, например, бактерии, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Такие способы хорошо известны в науке - смотри, например, Sambrooke et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

Пептиды могут быть стабилизированы с помощью С- и/или N-концевых модификаций, которые должны снижать катализируемый экзопептидазой гидролиз. Модификации могут включать в себя С-концевое ацилирование (например, ацилирование = Ас-пептид), введение N-концевого амида (например, пептид-NH₂), сочетания ацилирования и введения амида (например, Ас-пептид-NH₂) и введение D-аминокислот вместо L-аминокислот (Powell et al., J. Pharm. Sci., 81:731-735, 1992).

Другие модификации сфокусированы на предотвращении гидролиза эндопептидазами. Примерами таких модификаций являются следующие: введение D-аминокислот вместо L-аминокислот, модифицированные аминокислоты, циклизация внутри пептида, введение модифицированных пептидных связей, например, восстановленных пептидных связей ψ[CH₂NH] и, например пептоидов (N-алкилированных производных глицина) (Adang et al, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 113:63-78, 1994 и Simon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, 1992).

Пептиды согласно изобретению являются эпитопами Т-клеток, которые узнаются аутореактивными Т-клетками и способны их стимулировать. Эти аутореактивные Т-клетки могут быть обнаружены, например, в крови больных, страдающих аутоиммунными заболеваниями.

Таким образом, согласно изобретению по пептидам указанные пептиды, напоминающие рестриктированные эпитопы Т-клеток МНС класса II, присутствуют на аутоантигене-мишени, включающем в себя пептид SEQ ID NO:l или SEQ ID NO:2, являются весьма подходящими для применения в терапии для индукции специфической толерантности Т-клеток к указанному аутоантигену у млекопитающих, более конкретно у людей, страдающих от опосредуемого Т-клетками разрушения хряща, такого, например, как артрит, более конкретно - ревматоидный артрит. Необязательно такое лечение может сочетаться с введением других лекарств, таких как DMARDs (модифицирующие болезнь антиревматоидные лекарства), например сульфасалазин, противомалярийные препараты (хлорохин, гидроксихлорохин), вводимое или применяемое перорально золото, метотрексат, D-пеницилламин, азатиоприн, циклоспорин, микофенолат), NSAIDs (нестероидные противовоспалительные лекарства), кортикостероиды или другие лекарства, которые, как известно, влияют на течение болезни у больных аутоиммунным заболеванием.

Пептиды согласно изобретению могут быть также применены для модуляции лимфоцитов, которые реактивны в отношении антигенов, отличных от указанного аутоантигена, но которые присутствуют в той же ткани, что и аутоантиген, т.е. белков или их частей, включающих в себя пептид в соответствии с SEQ ID NO:l или SEQ ID NO: 2. Путем индукции специфичной в отношении антигена толерантности Т-клеток можно лечить аутоиммунные заболевания с помощью наблюдаемого подавления. В более общем виде, модулируемые клетки представляют собой гемопоэтические клетки. В целом, для того, чтобы функционировать в качестве индуктора толерантности, пептид должен удовлетворять, по меньшей мере, двум условиям, т.е. он должен обладать иммуномодулирующей способностью и он должен экспрессироваться местно в виде части более крупного белка.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ лечения больных, страдающих от воспалительных аутоиммунных заболеваний, путем введения фармацевтического препарата, включающего в себя пептид в соответствии с изобретением. Такие больные могут страдать от заболеваний, подобных болезни Грейвса, ювенильному артриту, первичному гломерулонефриту, остеоартриту, синдрому Шегрена, миастении gravis, ревматоидному артриту, болезни Аддисона, первичному билиарному склерозу, увеиту, системной красной волчанке, воспалительному заболеванию кишечника, множественному склерозу или диабету. Пептиды в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, могут быть применены для приготовления лекарства для индукции толерантности у больных, страдающих от этих заболеваний.

Лечение аутоиммунных расстройств пептидами согласно изобретению позволяет использовать тот факт, что наблюдаемое подавление вызывается неродственными, но совместно локализованными антигенами. Регуляторные клетки секретируют специфичный в отношении антигена тип плейотропных белков, таких как цитокины, которые могут подавлять иммунный ответ.

Согласно изобретению, больных, страдающих от опосредуемого Т-клетками разрушения хряща сустава, можно лечить с помощью терапевтической композиции, содержащей один или более пептидов согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Введение фармацевтической композиции согласно изобретению должно вызывать системную иммунологическую толерантность, в частности толерантность специфических аутореактивных Т-клеток этих больных по отношению к аутоантигенным белкам хряща сустава, подвергающегося их атаке, и другим аутоантигенам, которые экспонируют идентифицированные эпитопы МНС класса II, связываемые Т-клетками, и которые по аминокислотным последовательностям характеризуют или имитируют один или более пептидов согласно изобретению. Вызванная таким образом толерантность должна вести к снижению местного воспалительного ответа в подвергаемом атаке хряще сустава.

Весьма подходящими пептидами для применения в фармацевтической композиции согласно изобретению являются пептиды, включающие в себя пептид YKL-39 (268-276) или YKL-39 (266-278), с примыкающими последовательностями вплоть до общей длины 55 аминокислот. Более предпочтительные пептиды имеют длину 25 аминокислот. Еще более предпочтительная аминокислотная последовательность пептидов представляет собой FTLASAETT или HSFTLASAETTVG.

Пептиды согласно изобретению имеют преимущества в том, что они оказывают специфическое действие на аутореактивные Т-клетки и таким образом оставляют интактными другие компоненты иммунной системы по сравнению с неспецифическим подавляющим действием иммуносупрессорных лекарств. Лечение пептидами согласно изобретению должно быть безопасным и не оказывать побочных токсических эффектов.

Системная иммунологическая толерантность может быть достигнута введением высоких или низких доз пептидов согласно изобретению. Количество пептида должно зависеть от способа введения, времени введения, возраста больного, а также от общего состояния здоровья и диеты.

В целом, может быть применена дозировка от 0,01 до 10000 мкг пептида на кг веса тела, предпочтительно от 0,05 до 500 мкг, более предпочтительно от 0,1 до 100 мкг.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам и включают в себя, например, стерильный физиологический раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, пектин, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и воду. Другими носителями могут быть, например, молекулы МНС класса II, если это необходимо, заключенные в липосомы.

Кроме того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя один или более адъювантов. Подходящие адъюванты включают в себя, наряду с другими, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, амфиген, токофенолы, монофосфенильный липид А, дипептиды мурамила и сапонины, такие как Quill А. Предпочтительно, чтобы адъюванты, применяемые при терапии, индуцирующей толерантность, согласно изобретению, были мукозными, такими как В-субъединица холерного токсина или карбомеры, которые связываются с эпителием слизистой. Количество адъюванта зависит от природы самого адъюванта.

Более того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя один или более стабилизаторов, таких, например, как углеводы, включая сорбит, маннит, крахмал, сахародекстрин и глюкоза, белки, такие как альбумин или казеин, и буферы, подобные фосфатам щелочных металлов.

Подходящими способами введения являются, например, внутримышечные инъекции, подкожные инъекции, внутривенные инъекции или внутрибрюшинные инъекции, пероральное введение и интраназальное введение, такое как спреи.

Другой целью изобретения является предложение способа определения аутореактивных Т-клеток, вовлеченных в разрушение хряща сустава, и набора для тестирования для применения в указанном способе. Таким образом, пептиды согласно изобретению являются также весьма подходящими для применения в способе диагностики для выявления наличия активированных аутореактивных Т-клеток, вовлеченных в хроническое воспаление и разрушение хряща сустава.

Диагностический способ согласно изобретению включает в себя следующие стадии:

а) выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови индивидуума,

b) культивирование указанных РВМС в подходящих условиях,

c) инкубацию указанной культуры РВМС в присутствии одного или более пептидов согласно изобретению, и

d) определение ответа Т-клеток, например пролиферативного ответа, указывающего на присутствие активированных аутореактивных Т-клеток у индивидуума.

Определение пролиферативного ответа Т-клеток может быть осуществлено, например, по включению ³H-тимидина.

В объем изобретения также входят наборы для тестирования, которые включают в себя один или более пептидов согласно изобретению. Эти наборы для тестирования пригодны для применения в способе диагностики согласно изобретению.

Следующие примеры служат для иллюстрации изобретения, и их ни в коей мере не следует трактовать как ограничивающие объем изобретения.

ПОДПИСИ К ФИГУРАМ

Фиг.1, 2, 3. Перекрестная реакция трех различных специфичных в отношении НС gp-39 гибридом (8В12, 14G11, 20Н5) с YKL-39 (266-278)

(CVR0271B = НС gp-39 (263-275), KV0432B = YKL-39 (266-278), СС0332В = Chi (269-282), KV0431A = YKL-39 (262-274), HCDA.8B12.1D8, 14G11.1H7 и 20H5.4F6.2F6 представляют собой лишенные HLA-DRB1*0401 гибридомы, специфичные в отношении НС gp-39 (263-275). Активация Т-клеточных гибридом выражена в виде продуцирования IL-2.

Фиг.4. Придача толерантности in vivo с помощью НС gp-39 (263-275) или YKL-39 (266-278)

У мышей линии Balb/c вызывали толерантность путем интраназального введения 50, 10 или 2 микрограммов НС gp-39 (263-275) или YKL-39 (266-278) с последующей иммунизацией НС gp-39 (263-275). В качестве контролей использованы мыши, получавшие в качестве предварительной обработки физиологический раствор, или же интактные мыши.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Сравнение последовательностей

Белок YKL-39 хондроцитов человека проявляет значительную идентичность последовательности с НС gp-39 (YKL-40). Другой гомолог НС gp-39 секретируется макрофагами человека и называется хитотриозидазой (Boot et al., 1995). Последовательности, соответствующие RSFTLASSETGVG (НС gp-39 (263-275), SEQ ID NO:3), были идентифицированы в виде HSFTLASAETTVG в белке YKL-39 (266-278) и в виде RSFTLASSSDTRVG (SEQ ID NO:4) в хитотриозидазе макрофагов (269-282) соответственно (таблица 1). Chi (269-282) содержит мотив связывания пептида HLA-DRB1*0401, который ранее использовали для селекции эпитопов Т-клеток в белках. Напротив, пептид YKL-39 (266-278) не содержит этого мотива. Все пептиды были синтезированы.

Пример 2. Связывание пептидов с HLA-DRB1*0401

Пептиды из примера 1 тестировали на связывание молекул, кодируемых DRB1*0401. Молекулы HLA-DR4 (DRB1*0401) очищали из гомозиготных трансформированных EBV В-лимфобластоидных линий клеток человека Huly138IC2 и проводили конкурентный анализ связывания пептида HLA-DR, в основном как описано Verheijden et al., 1997. Сродство данного пептида в отношении связывания кодируемых DRB1*0401 молекул соотносили с конкуренцией маркерного пептида. Это относительное сродство связывания определяли как концентрацию пептида, при которой сигнал снижался на 50% (IC50). Пептид HA-F является положительным контролем (гемагглютинин 307-319; PKFVKQNTLKLAT; в положении 309 Y заменен на F; SEQ ID NO:5). Известно, что пептид обладает высоким сродством к молекулам DRB1*0401.

Как и ожидалось, было обнаружено, что пептид Chi (269-282) связывается с DBB1*0401 с высоким сродством (смотри таблицу 2). Пептид YKL-39 (266-278), который не содержит эффективного мотива связывания пептида DRB1*0401, связывался с DR4(B1*0401) с очень высоким сродством.

Пример 3. Стимуляция Т-клеточных гибридом

Специфичные в отношении НС gp-39 (263-275) гибридомы тестировали на предмет узнавания соответствующих последовательностей.

Для тестирования перекрестной реакции 3 различных специфичных в отношении НС gp-39 (263-275) гибридомных клеточных линий с пептидом YKL-39 или хитотриозидазы 5×10⁴ гибридомных клеток и 2×10⁵ облученных (12000 RAD) (0,12 Дж/г) EBV-трансформированных, несущих специфичность DRB1*0401 В-клеток инкубировали в объеме 150 мкл в лунках с круглым дном планшета для микротитрования. Пептидный антиген (НС gp-39 (263-275), YKL-39 (266-278), хитотриозидазы (269-282) или контрольный пептид) добавляли в лунки в объеме 50 мкл в двух параллелях. Через сорок восемь часов 100 мкл культурального супернатанта анализировали на образование IL-2 с помощью сэндвичного ИФА с антителами от Pharmingen, специфичными в отношении IL-2 мыши.

Было обнаружено, что синтетический пептид YKL-39 (266-278) вызывает ответ, сходный с ответом на НС gp-39 (263-275), тогда как Chi (269-282) не вызывает ответа. Результаты позволяют предполагать, что три различные TCRs, использованные в трех различных гибридомах, не различают НС gp-39 (263-275) и YKL-39 (266-278), когда они предъявляются молекулами, кодируемыми DRB1*0401 (фиг.1, 2, 3), но различают НС gp-39 (263-275) и Chi (269-282). Данные показывают, что YKL-39 (266-278) является мимикрийным эпитопом НС gp-39 (263-275) (фиг.1, 2, 3).

Пример 4. Узнавание YKL-39 (266-278) РВМС

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из гепаринизированной периферической крови с помощью стандартного центрифугирования в Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Клетки суспендировали в лунках 24-луночного планшета при концентрации 5×10⁵ клеток на 1 мл. Клетки инкубировали в среде в отсутствие или в присутствии 10 или 50 мкг/мл пептидного антигена (YKL-39 (266-278)). Культуры инкубировали в течение 6 дней при 37°С во влажной атмосфере 5% CO₂. Клетки затем суспендировали, и среду объемом 100 или 150 мкл вносили в 4 параллелях в лунки 96-луночного планшета с лунками с круглым дном. Клетки затем подвергали импульсному действию 0,5 мкКи (1,85×10⁴ Бк (имп./сек)) [3Н]тимидина ([3H]TdR), и через 18 час измеряли включенную радиоактивность. Представленные в таблицах 3а и 3б результаты выражены в виде индексов стимуляции (SI) (специфичные для антигена импульсы/импульсы фона).

На основании таблицы 3а можно заключить, что эпитоп YKL-39 (266-278) легко узнается у больных RA. Таблица 3b показывает, что узнавание YKL-39 (266-278) РВМС совпадает с узнаванием НС gp-39 (263-275) и НС gp-39 и, более того, что узнавание YKL-39 (266-278) в целом более выражено, чем узнавание НС gp-39 (263-275).

SI = специфичные для антигена импульсы/импульсы фона. SI ≥ 5 рассматриваются как позитивные. R - отвечающий, NR - не отвечающий.

Пример 5. Индукция толерантности

Был разработан специфичный в отношении НС gp-39'(263-275) способ анализа DTH, пригодный для мониторинга индукции толерантности с помощью пептидных антигенов. Было обнаружено, что иммунизация мышей Balb/c НС gp-39(263-275) в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) эффективна в плане индукции ответа DTH с последующей нагрузкой пептидом НС gp-39(263-275). Эта основанная на пептиде система DTH была применена для выявления модуляции ответа DTH с помощью интраназальной аппликации пептида НС gp-39(263-275). Было обнаружено, что интраназальная аппликация НС gp-39 (263-275) дозо-зависимым образом негативно модулирует индуцированный НС gp-39 (263-275) ответ DTH. Интраназальная аппликация YKL-39 (266-278), однако, приводила к более сильной негативной модуляции ответа DTH, что указывает на то, что YKL-39 (266-278) может эффективно вызывать толерантность специфического в отношении пептида ответа, индуцированного НС gp-39 (263-275) (таблица 4, фиг.4, 5, 6).

Формула изобретения

1. Пептид, имеющий аминокислотную последовательность из 9-55 аминокислотных остатков, включающий в себя аминокислотную последовательность FTLASAETT (SEQ ID NO:l).

2. Пептид по п.1, включающий в себя аминокислотную последовательность HSFTLASAETTVG (SEQ ID NO:2).

3. Пептид по п.1 или 2, имеющий аминокислотную последовательность до 25 аминокислотных остатков.

4. Пептид по любому из пп.1-3 для применения в качестве терапевтического средства.

5. Пептиды по пп.1-3 для получения фармацевтического препарата для индукции специфической толерантности Т-клеток к аутоантигену у больных, страдающих от аутоиммунных нарушений, более конкретно - артрита.

6. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунных заболеваний, содержащая один или более пептидов по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6