Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ

 

Изобретение относится к области фармакологии, фармации и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности (АОА) различных многокомпонентных смесей без их предварительного разделения. Способ включает подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. Способ позволяет оценить суммарную антиоксидантную активность с высокой точностью и воспроизводимостью и с использованием простого и доступного оборудования. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области медицины, фармакологии, фармации и может быть использовано для оценки антиокислительной активности различных лекарственных препаратов, пищевых продуктов и БАДов. Антиоксидантная активность (потенциал) лекарственного препарата есть показатель качества препарата, характеризующий его восстанавливающие свойства, т.е. свойства вступления в реакцию с активными формами кислорода (АФК), как in vivo так in vitro, которые образуются в организме в присутствии кислорода, при его неполном восстановлении с образованием следующих радикалов:

- супероксидный анион-радикал (О 1/2);

- гидропероксидный радикал (СНОО·)

- пероксид водорода (Н₂О₂)

- гидроксил радикал (НО·) и др.

В случае гипероксидации АФК организма могут выступать в роли радикалов, атакующих липиды в клеточных мембранах, белки тканей, энзимы, полисахариды и ДНК.

Процесс старения и тяжелые заболевания связаны с повреждением организма человека активным кислородсодержащим радикалами, особенно при их избытке или при снижении активности эндогенной антиоксидантной системы организма человека.

Для поддержания необходимой концентрации в организме свободных радикалов и используются лекарственные препараты, биологически активные вещества, в том числе в виде пищевых продуктов или БАДов.

Известен способ определения антиоксидантной активности, в котором измеряется общее хемилюминесцентное изменение спустя 3 с от момента добавления к перекиси водорода гипохлорида натрия в присутствии биологически активного вещества в сравнении с контролем. Способ позволяет ускорить анализ и расширить круг исследуемых веществ (RU 2033609, 20.04.1995).

Известен способ определения антиокислительной активности вещества путем спектральной оценки их способности подавлять появление ОН-радикалов в реакции Фентон, где оценку осуществляют по интенсивности хемилюминесценции реакции Фентон по формуле А=(А0-А+)/А0, где А0 - максимальная амплитуда хемилюминесценции реакции Фентон при отсутствии испытуемого вещества, А+ - максимальная амплитуда свечения реакции в присутствии испытуемого вещества и при значениях А>0,3 делают вывод об антиоксидантных свойствах у испытуемого вещества (RU 2163021, 10.02.2001).

Недостатком известных способов является образование люминесцирующих веществ также из индивидуальных соединений и отсутствие избирательности к окислительным веществам в сложных многокомнентных системах (комплексные лекарственные препараты, экстракты из лекарственных растений, БАДы и пищевые продукты).

Известен способ определения суммы антиокислительных веществ, таких как фенольные соединения, с помощью фотометрического титрования по Левенталю, основанный на окислении в кислой среде перманганатом калия в присутствии индикатора индигокармина, являющегося регулятором реакции окисления. Для расчета используют коэффициент, равный 6,792 мг суммы фенольных соединений хмеля и соответствующий 1 мл 0,1 H раствора перманганата калия.

Недостатком способа является то, что фенольные соединения представляют собой не единственные действующие вещества растений и фитопрепаратов на их основе - настоев, отваров, эликсиров, настоек, которые реагируют с перманганатом калия. (Ляшенко Н.И. и др. Методы количественного определения полифенолов в хмеле. Хмелеводство, в.2, Киев, Урожай, 1980, с.57-64).

Известен способ определения антиокислительной активности индивидуальных веществ, основанный на электрохимическом поглощении кислорода, например, активность 1,5Д-антифруктозы определяют в эмульсии метилового эфира лимонной кислоты. Окислительную реакцию в системе инициируют добавлением раствора метиоглобина. Непосредственно после инициирования реакции образец инжектируют в термостатированную (25,0±0,1°С) закрытую ячейку, обеспечивая при этом надежную защиту от попадания в систему кислорода. Поглощение кислорода определяют по электроду Кларка, который подсоединен к управляемой компьютером базе данных. Относительную концентрацию (%) кислорода определяют через каждые 30 с (см. описание к RU 2140988, 10.11.1989). Данный способ не пригоден к определению суммарной антиокислительной активности препаратов. Вообще способы, использующие на конечной стадии спектроскопическое детектирование, в большинстве случаев используются в сочетании с методами жидкостной хроматографии и применяются для количественного определения конкретного вещества, обладающего антиокислительными свойствами. (Grosset С. Cantin P. Alarys. Количественное определение в галеновых формах антиоксидантов методом жидкостной хроматографии. //Analusis, 1989, 17, № 7, р.409-412).

Данный способ имеет следующие недостатки: метод определения косвенный, включает в себя несколько этапов, и, как следствие, достаточно продолжительный по времени. Сложность оборудования, требующего для обслуживания специалиста и оборудованного места установки. Достаточно высокий процент ошибки определения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, позволяющий определить суммарную антиокислительную активность биологически активных веществ, который заключается в подготовке дозы анализируемого и стандартного веществ, их окислении и расчете антиокислительной активности по формуле, в частности, что 0,05 H раствор перманганата калия в 0,024 М растворе серной кислоты титруют при комнатной температуре раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации БАВ проводят по формуле в пересчете на кверцетин.

Показателем относительной АОА служит объем препарата (объекта) в миллилитрах, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия. Чем меньше объем препарата, израсходованный на титрование, тем выше антиокислительная активность препарата. Для количественной оценки АОА препаратов (объектов) вводится показатель активности - В. Эта величина представляет собой сумму БАВ восстанавливающего характера и выражается количеством миллиграммов кверцетина в 1 мл или 1 г препарата (объекта). Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект (RU 2170930, 20.07.2001). Недостатком способа, выбранного за прототип, является титрование перманганатом калия в препарате веществ, не обладающих восстановительным потенциалом, а следовательно, не участвующем в ингибировании активных радикалов.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой точностью и воспроизводимостью, оценивать суммарную антиоксидантную активность фармацевтических препаратов, лекарственных растений, биологически активных добавок и пищевых продуктов (чай, вино, пиво, соки). Способ должен быть простым в применении и не слишком дорогим.

Поставленная задача решается описываемым способом определения антиоксидантной активности биологически активных веществ, который включает подготовку доз анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление путем непосредственной поочередной подачи подготовленных доз в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора с получением сигналов в виде соответствующих импульсов электрического тока, усиление сигналов, регистрацию в виде выходных кривых и расчет площадей полученных пиков анализируемого (S) и стандартного (Sст) веществ, при этом расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:

где S_a - площадь пика анализируемого препарата; S_c - площадь пика стандарта; m_с - навеска стандарта; V_c - объем раствора стандарта, мл; Р - чистота используемого стандарта, %; n - разбавление анализируемого препарата.

Предпочтительно подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью. Способ предусматривает, что в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом. Например, в качестве стандартных веществ используют вещества, выбранные из ряда: кверцетин, дигидрокверцитин, рутин.

В основе предложенного способа использовано свойство антиоксидантов, как активных восстановителей, имеющих различный "редокс-потенциал". Например: Редокс-потенциал кверцетина = 0,3 В. Редокс-потенциал дигдрокверцитина = 0,5 В. Редокс-потенциал рутина = 0,6 В.

Использовать стандартное вещество можно достаточно точно определить редокс-потенциал любых многокомпонентных препаратов, имеющих еще большее различие в антиокислительной активности.

Предложенный способ применим к исследуемым объектам в жидком состоянии. Твердые вещества перед анализом переводят в жидкие формы.

Для осуществления способа создана установка, изображенное схематически на чертеже.

Установка содержит

1 - емкость для растворителя;

2 - насос;

3 - кран-дозатор;

4 - амперометрический детектор с термостатируемой электрохимической ячейкой;

5 - усилитель электрического сигнала;

6 - аналого-цифровой преобразователь;

7 - регистрирующее устройство (компьютер с принтером);

8 - устройство ввода анализируемого и стандартного веществ.

Установка работает следующим образом: насос (2) прокачивает растворитель из емкости (1) через всю систему. В кран-дозатор стандартным шприцем на 1 мл вводят исследуемый раствор (8). Поток растворителя подает дозу исследуемого вещества в ячейку детектора (4). В ячейке происходит электрохимическое окисление вещества на поверхности рабочего электрода. При этом возрастает ток между двумя электродами. Возникающие токи малы (10^-16-10^-9 А), поэтому они усиливаются в устройстве (5), с помощью аналого-цифрового преобразователя (6) преобразуются в цифровой сигнал и регистрируются на дисплее компьютера (7).

Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа с использованием вышеописанной установки.

ПРИМЕР 1

1 мл лекарственного препарата "Иммунал" вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл доводят объем колбы водой до метки и перемешивают. 20 мкл полученного раствора вручную или с использованием автоматического дозатора вводят в кран-дозатор установки, в котором проба смешивается с проходящим растворителем и насосом подается непосредственного в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора, с получением от него соответствующего сигнала в виде импульса электрического тока, усилением этого импульса и его графической регистрации в виде дифференциальной кривой (площадь пика S_n), одновременно проводится подготовка 100 мл раствора стандартного вещества антиоксиданта (рутин чистоты-98%), обладающего высоким редокс-восстанавливающим потенциалом, который также вводят в кран дозатор и проба поступает на тот же детектор с выдачей импульса в виде площади пика (S_c), a количественную оценку антиоксидантной активности (АОА) анализируемого вещества проводят расчетным путем по следующей математической зависимости:

где S_n - площадь пика анализируемого препарата;

s_ст - площадь пика стандарта рутина;

n - разбавление анализируемого препарата;

m_c - навеска стандарта рутина, мг;

V_c - объем приготовленного раствора стандарта антиоксиданта рутина, мл.

Найдено экспериментально:

Площадь пика у препарата "Иммунал" S_n=396,0

Площадь пика у стандарта рутина S_c=165,0

ПРИМЕР 2

ЗЕЛЕНЫЙ ЧАЙ. 5 г (точная навеска) зеленого чая заливают 200 мл нагретой до кипения дистиллированной водой, накрывают часовым стеклом и настаивают в течение 5 мин, затем полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр "белая лента", охлаждают и доводят объем до 200 мл водой (раствор для анализа). Раствор через дозатор подают в электрохимическую ячейку детектора. Получение площадей анализируемого чая и стандарта рутина, а также количественный расчет величины АОА проводят, как в примере № 1, в расчете на 1 мл или на 1 г сухого чая.

Для анализируемого сорта зеленого чая

АОА=3,92 мг/мл или 157 мг/г сухого зеленого чая.

Аналогичным образом проведены исследования по оценке антиоксидантной активности различных веществ. Результаты представлены в примерах 3-5.

ПРИМЕР 3

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ЭЛИКСИР "ФИТОИММУНАЛ"

Определение площадей пиков препарата и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 1.

Для анализируемого образца препарата "Фитоиммунал"

АОА=7,42 мг/мл

ПРИМЕР 4

КОНЬЯК "ДАГЕСТАНСКИЙ"

Определение площадей пиков анализируемого коньяка и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 1

Для анализируемого образца коньяк "Дагестанский"

АОА - 1,18 мг/мл

ПРИМЕР 5

ЧЕРНЫЙ ЧАЙ

Приготовление извлечения и определение исследуемых пиков извлечения и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводится как в примере 2.

Для анализируемого сорта черного чая.

АОА - 6,4 мг/л или 256 мг/г черного чая.

Проведенные измерения показали, что предложенный способ прост в применении и в зависимости от анализируемого объекта обладает высокой воспроизводимостью и точностью, что превышает аналогичные характеристики способа-прототипа.

Результаты предложенного способа могут быть использованы в лечебной практике для правильной дозировки лекарственных веществ и БАДов в организм человека, а также для надежной стандартизации лекарственных препаратов, лекарственных растений и БАДов. Поскольку антиоксидантная активность - интегральный показатель качества, то было бы целесообразно ввести такой показатель в нормативные документы (ГОСТ, ТУ, Фармстатьи и т.д.)

Формула изобретения

1. Способ определения антиоксидантной активности биологически активных веществ, включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их окисление и расчет показателя антиоксидантной активности, отличающийся тем, что окисление анализируемого и стандартного вещества проводят электрохимически путем непосредственной поочередной подачи подготовленных проб в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора с получением сигналов в виде соответствующих импульсов электрического тока, усиление сигналов, регистрацию в виде дифференциальных выходных кривых и расчет площадей полученных пиков анализируемого (S) и стандартного (S_ст) веществ, при этом расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:

где S_a - площадь пика анализируемого препарата;

S_c - площадь пика стандарта;

m_с - навеска стандарта;

V_c - объем раствора стандарта, мл;

Р - чистота используемого стандарта, %;

n - разбавление анализируемого препарата.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве стандартных веществ используют вещества, выбранные из ряда: рутин, кверцитин, дигидрокверцитин.

РИСУНКИРисунок 1