Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ

 

Изобретение относится к области анализа биологически активных веществ. Предложена установка для определения суммарной антиоксидантной активности, содержащая емкость для растворителя, насос, устройство ввода анализируемого образца, дозатор, выход которого непосредственно связан с электрохимической ячейкой амперометрического детектора с характерной электронной схемой, усилитель сигнала, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Изобретение позволяет оценить антиоксидантную активность многокомпонентных проб с высокой точностью и воспроизводимостью. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использована для оценки антиокислительных свойств различных препаратов и пищевых продуктов.

Известна установка для определения антиоксидантной активности препаратов, содержащая термостатируемую емкость с субстратом окисления - полиненасыщенными жирными кислотами кукурузного масла, куда вводят антиоксидантный препарат и воздействуют индикаторами окисления, емкость соединена со спектрофотометром или с хемилюминесцентным прибором, снабженным специализированной компьютерной программой, при этом антиокислительная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Установка позволяет стандартизировать оценку результатов, а также использовать доступный субстрат окисления (RU 2182706 20.05.2002).

Известна система для испытания антиокислительной активности полимерных алкиларилполиэфирспиртов, в качестве молекулы-мишени окислителей применяют салицилат. Гидроксильный радикал реагирует с салициловой кислотой (2-оксибензойной кислотой) с образованием двух диоксибензойных кислот, в частности 2,3- и 2,5-диоксибензойной кислоты. Эти гидроксилированные продукты являются доказательством образования ОН.

Определение 2,3- и 2,5-диоксибензойных кислот осуществляют при помощи жидкостной хроматографии высокого разрешения с электрохимическим детектором. Для образования и обнаружения ОН используют суспензии 10 мкМ FеСI₃, 1,0 мМ Н₂O₂, 1,0 мМ аскорбата и 10,0 мкМ салициловой кислоты Добавляют 0,1 мл нормального солевого раствора или тилоксапола (конечные концентрации от 0,0 до 10 мг/мл). Реакционные смеси выдерживают при 45°С в течение 30 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 1200 g. Надосадочную жидкость центрифугируют (Beckman Microfuge E) через трубчатый фильтр (0.22 микрона) (PGC Scientific N 352 - 118) при 15000 g 100 мкл образца элюата подают в колонку ЖХВР 018 RP (250×4,7 мм. Beckman N 235329). Гидроксилированные продукты салицилата определяют количественно при помощи электрохимического детектора Coulochem (ESA модель 5100А), причем восстановительный потенциал детектора устанавливают равным - 0.40 В (постоянный ток). Окислительный потенциал предохранительной ячейки (используемой в качестве экрана) устанавливают на +0,40 В (постоянный ток). Измерения проводятся дважды (RU 2147235, 10.04.2000).

Описана также другая методика, предназначенная для анализа пептидов, состоящая в определении физического показателя пептидов, имеющих сшивки 3-гидроксипиридиния. Один из подобных физических показателей основывается на электрохимическом детектировании. Метод заключается в инъектировании аликвоты биологической жидкости, например мочи, в электрохимический детектор, основанный на окислительно-восстановительном потенциале. Рекомендовано использовать амперометрический или кулонометрический детектор. Кулонометрический детектор более чувствителен в данной системе поскольку достигается полное окисление или восстановление анализируемой молекулы в колоночном элюенте. Отсеивающие или охранные электроды могут быть помещены в восходящем направлении от аналитического электрода с селективным окислением или восстановлением мешающих веществ, значительным улучшением в результате селективности. Для разрушения мешающих веществ устанавливают одну или несколько ячеек предварительной обработки (RU 2139541, 10.10.1999).

Известен количественный способ определения альфа-токоферола, являющегося антиоксидантом, в котором осуществляют электрохимическое определение токоферола методом циклической вольтамперометрии. Данный метод основывается на способности токоферолов к 1-электронному окислению и реализуется с помощью системы для электрохимических измерений, состоящей из программатора ПР-8, потенциостата ПИ-50 и прибора двухкоординатного регистрирующего ПДА-1. Измерения вели в электрохимической ячейке, сопряженной с системой для электрохимических измерений. Рабочий объем ячейки 3 мл. В качестве рабочего электрода использовали платиновый стационарный дисковый электрод (d 2 мм). Электрод сравнения хлорсеребряный с водонепроницаемой диафрагмой. Вспомогательный электрод - платиновая спираль. Так как электрохимические измерения проводились в неводных средах, предусматривалась аналоговая компенсация омических потерь с помощью потенциостата ПИ-50 (RU 2102747, 20.01.1998).

Однако все вышеописанные установки пригодны только для анализа индивидуальных веществ.

Известна система высокоэффективного жидкостного хроматографического (ВЭЖХ) анализа с потоковым детектором для анализа многокомпонентных смесей, содержащая насос, устройство ввода пробы, хроматографическую колонку, датчик давления на входе хроматографической колонки, электрохимический детектор, устройство регистрации выходного сигнала детектора и интерфейс связи детектора с устройством регистрации выходного сигнала детектора. Потоковым детектором является любой электрохимический детектор, а устройством регистрации выходного сигнала может быть или вычислительный интегратор с принтером для записи хроматограммы, или персональная ЭВМ. (Агеев А.Н., Мигунов И.М., Орлов В.И.. Радченко А.Ю., Яшин Я.И. Журнал физической химии, 1991 г., т 65, № 10, с.2660-2662).

Описана аналогичная установка для анализа смесей, содержащая емкость с растворителем, капиллярную трубку, датчик расхода, устройство ввода пробы, хроматографическую колонку, детектор, нормировщик выходного сигнала и устройство регистрации. При протекании элюента через датчик расхода на его выходе вырабатывается выходной сигнал датчика расхода, который определяется расходом элюента через термостатируемую высокоэффективную предколонку датчика расхода и имеет линейную зависимость от расхода элюента. Термостатирование предколонки в таком датчике расхода применяется для исключения зависимости выходного сигнала датчика расхода от изменения температуры окружающей среды (RU 2148824, 10.05.2000).

Использование описанной системы анализа в сочетании с потоковым детектором и устройством нормировки возможно только в системе ВЭЖХ анализа, так как только при ВЭЖХ анализе ВЭТТ практически не зависит от элюента, не искажает обратную зависимость между шириной пика и расходом элюента.

Однако известная установка не предназначена для измерения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ.

Чтобы правильно дозировать в организм лекарственные вещества или БАДы, обладающие антиоксидантным действием, необходимо знать их антиоксидантную активность in vitro, которую и определяют для каждого лекарственного вещества, являющегося многокомпонентной системой, но пока, к сожалению, нет надежной и достоверной методики для определения этого показателя качества.

Задачей настоящего изобретения является разработка установки, позволяющей напрямую, без предварительных разделений определять суммарную антиоксидантную активность (АОА) лекарственных препаратов, растений, других субстанций, например пищевых продуктов.

Поставленная задача решается описываемой установкой для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ путем их электрохимического окисления, которая содержит емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный и виде многоходового крана, связанного с выходом насоса, с устройством ввода анализируемого вещества и с термостатируемой электрохимической ячейкой амперометрического детектора, усилитель электрического сигнала, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала, при этом установка содержит амперометрический детектор, электронная схема которого предусматривает возможность функционирования в режимах постоянного потенциала, импульсных потенциалов, сканирования потенциалов во всем диапазоне и автоматической подачи восстанавливающего сигнала, а электрохимическая ячейка не содержит электрода сравнения. Предпочтительно, рабочий электрод ячейки выполнен из стеклоуглерода, а корпус детектора, выполняющий функцию вспомогательного электрода, выполнен из нержавеющей стали.

Выполнение установки в объеме вышеизложенной совокупности признаков позволяет проводить прямые количественные измерения с высокой точностью как окислительной, так и восстановительной активности исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения. В установке используют амперометрический детектор, известный из уровня техники (см. А.Я.Яшин, Я.И.Яшин. Приборы, 2002, №6, с.43), работающий в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне. Использование известного детектора в заявленной установке дает возможность определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений. Конструкция без электрода сравнения, использованная в заявленной установке, не влияет на стабильность определения, но упрощает схему.

На чертеже представлена принципиальная схема заявленной установки, в которой

1 - емкость для растворителя,

2 - насос,

3 - дозатор,

4 - амперометрический детектор с термостатируемой ячейкой,

5 - усилитель,

6 - аналого-цифровой преобразователь,

7 - устройство регистрации,

8 - устройство ввода анализируемого вещества.

Заявленная установка работает следующим образом.

Насос (2) постоянно прокачивает растворитель, забирая его из емкости (1), через всю систему. В кран-дозатор в положении “отбор проб” вводится устройством (8) (стандартным шприцем на 1 мл) в дозируемую петлю дозатора (3) исследуемый раствор. Поворотом ручки крана в положение “анализ” поток растворителя направляет определенную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора (4). В ячейке детектора на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами: рабочим электродом из стеклоуглерода и вторым электродом, которым является материал корпуса детектора (нержавеющая сталь).

Работа детектора возможна в трех режимах.

1. Режим работы при постоянном потенциале.

При этом на рабочий электрод подается определенный потенциал, при котором исследуемое вещество может окисляться, либо восстанавливаться. В этом режиме через некоторое время (обычно около нескольких месяцев - года) электрод загрязняется продуктами реакции и его необходимо очищать.

2. Работа в импульсном режиме.

Амперометрическое детектирование в импульсном режиме может выполнять автоматически, с помощью серии нескольких потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается подходящим для определения соответствующих соединений и накладывается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего периода 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается большим положительным потенциалом в течение 50-200 мс, а затем восстанавливается отрицательным потенциалом до первоначального состояния, прежде чем наступил новый цикл.

3. Работа в сканирующем режиме.

В этом режиме автоматически снимается циклическая вольтамперограмма, т.е. зависимость электрического тока от приложенного напряжения. По максимумам на этой кривой судят об оптимальном потенциале, при котором необходимо определять анализируемые соединения.

Величина электрического тока зависит от природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду.

Возникающие электрические токи очень малы в пределах l0^-16-10^-9 A, аналоговые сигналы усиливаются в усилителе (5), а затем с помощью АЦП (6) преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера (7), в случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.

Далее приведены примеры определения АОА на предложенной установке для конкретных веществ.

Пример 1

1 мл лекарственного препарата "Иммунал" вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем колбы водой до метки и перемешивают.

20 мкл полученного раствора вручную или с использованием автоматического дозатора вводят в кран-дозатор установки, в котором проба смешивается с проходящим растворителем и насосом подается непосредственно в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора. К рабочему электроду прикладывается постоянный потенциал +1,3 V, который установлен после сканирования. Сигнал в виде электрического тока, усиливается и регистрируется в виде дифференциальной кривой (площадь пика S_n), одновременно проводится подготовка 100 мл раствора стандартного вещества антиоксиданта (рутин чистоты 98%), обладающего высоким редокс-восстанавливающим потенциалом, который также вводят в кран-дозатор, и проба поступает на тот же детектор с выдачей импульса в виде площади пика (S_c), а количественную оценку АОА анализируемого вещества проводят расчетным путем по следующей математической зависимости:

где S_n - площадь пика анализируемого препарата;

S_c - площадь пика стандартного рутина;

n - разбавление анализируемого препарата;

m_c - навеска стандарта рутина, мг;

V_c - объем приготовленного раствора стандарта антиоксиданта рутина, мл.

Найдено экспериментально.

Площадь пика у препарата "Иммунал" S_n=396,0

Площадь пика у стандарта рутина S_c=165,0

Пример 2

Зеленый чай. 5 г (точная навеска) зеленого чая заливают 200 мл нагретой до кипения дистиллированной воды, накрывают часовым стеклом и настаивают в течение 5 мин, затем полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр "белая лента", охлаждают и доводят объем до 200 мл водой (раствор для анализа). Подачу анализируемого чая осуществляют в ячейку детектора как в примере 1. Анализ проводят при постоянном потенциале +1,0, т.к. катехины, содержащиеся в чае, определяются при этом потенциале.

Получение площадей анализируемого чая и стандарта рутина, а также количественный расчет величины АОА проводят как в примере №1, в расчете на 1 мл или на 1 г сухого чая.

Для анализируемого сорта зеленого чая получено значение АОА=3,92 мг/мл или 157 мг/г сухого зеленого чая.

Пример 3

Лекарственный препарат Эликсир "Фитоиммунал"

Подачу анализируемого чая осуществляют в ячейку детектора, как в примере 1.

Определение площадей пиков препарата и стандарта рутина и количественный расчет АОА также проводится как в примере №1.

Определение проводят в импульсном режиме: детектирующий потенциал +0,8 V, очищающие +1,3 V, восстанавливающий - 1,3 V.

Для анализируемого образца препарата "Фитоиммунал" получено значение

АОА=7,42 мг/мл

Таким образом, предложенная установка использует свойство антиоксидантов, являющихся восстановителями и обладающих различными “редокс-потенциалами” для оценки качества различных типов препаратов и пищевых продуктов и биологически активных добавок с точки зрения их антиокислительной активности и может быть использована в практической работе лабораторий, институтов, центров, контролирующих и стандартизирующих качество лекарственных препаратов, пищевых продуктов и БАДы.

Формула изобретения

1. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ путем их электрохимического окисления, характеризующаяся тем, что она содержит емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, связанного с выходом насоса, с устройством ввода анализируемого вещества и с термостатируемой электрохимической ячейкой амперометрического детектора, усилитель электрического сигнала, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала, при этом установка содержит амперометрический детектор, электронная схема которого предусматривает возможность функционирования в режимах постоянного потенциала, импульсных потенциалов, сканирования потенциалов во всем диапазоне и автоматической подачи восстанавливающего сигнала, а электрохимическая ячейка не содержит электрода сравнения.

2. Установка по п.1, отличающаяся тем, что рабочий электрод ячейки выполнен из стеклоуглерода, а корпус детектора, выполняющий функцию вспомогательного электрода, изготовлен из нержавеющей стали.

РИСУНКИРисунок 1