Способ оценки корригирующего влияния магнитного поля на энергетический метаболизм при развитии злокачественного процесса в эксперименте

 

Изобретение относится к медицине, в частности к биофизическим исследованиям в экспериментальной онкологии. Способ включает регистрацию изменений величин полярографических параметров процессов дыхания и субстратного фосфорилирования митохондрий в пробах гомогенатов печени и мозга подопытных животных на 1, 5 и 9 неделях после введения химического канцерогена, в течение которых на животных воздействуют сверхнизкочастотным магнитным полем (СНЧМП) индукцией 3,2 мТл в частотно-временном алгоритме 0,03 Гц - 5 мин, 0,3 Гц - 1 мин, 3 Гц - 1 мин, 9 Гц - 1 мин. При этом выявляют корреляцию изучаемых параметров с выраженностью антиканцерогенного эффекта СНЧМП. Способ позволяет обнаружить особенности поведения системы окисления янтарной кислоты в митохондриях мозга и печени при развитии опухолей на ранних стадиях канцерогенеза, дает возможность моделирования состояния энергетики митохондрий при использовании СНЧМП как триггерного механизма формирования неспецифической резистентности к росту опухоли и дезинтоксикационных функций организма.

Изобретение относится к медицине, в частности к биофизическим исследованиям в экспериментальной онкологии, и может быть использовано для выявления митохондриальных процессов при росте злокачественных опухолей на ранних стадиях канцерогенеза, а также проведения коррекции энергетического метаболизма в условиях применения сверхнизкочастотного магнитного поля.

Известно, что в возникновении стойких патологических состояний процессы накопления и расходования энергии играют важную роль, а их идентификация по активности митохондриальных процессов (энергизация, активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и др.) позволяет оценить возможность компенсации энергозатрат.

Известен способ коррекции метаболических состояний при патологическом ослаблении энергетических реакций при заболеваниях сердца, почек, мышц, токсических нагрузках и инфекции, заключающийся в непосредственной регуляции митохондриальных процессов путем энергизации янтарной кислотой в сочетании с веществами, регулирующими СДГ (Маевский Е.И., Розенфельд А.С., Гришина Е.В., Кондрашова М.Н. “Коррекция метаболического ацидоза путем поддержания функций митохондрий”. Пущино, 2001, 155 с.).

Однако известный способ коррекции метаболических состояний не дает детализации энергообеспечения организма ни в процессе роста опухоли, ни после контакта организма с канцерогеном до выхода опухоли и не рассматривает пути предотвращения генерализации патологических сдвигов митохондриальных процессов при воздействии физическими факторами для достижения противоопухолевого эффекта.

Известен способ воздействия поличастотным полем на развитие перевивной саркомы С-45 у белых беспородных крыс (Шихлярова А.И., Шейко Е.А., Пиль Э.А. “Оценка противоопухолевого эффекта и анализ активности дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови крыс с опухолью С-45 при воздействии слабых инфранизкочастотных магнитных полей”. Вопросы онкологии, 1999. Т.45. № 3. С.287-291), выбранный нами в качестве прототипа. Оценка эффективности противоопухолевого влияния выбранного воздействия проводилась по показателям динамики роста опухоли. Наряду с этим оценивалось состояние лимфоцитов по уровню активности ферментов основных энергетических циклов - цикла Кребса и гликолиза. Авторами показано, что поличастотное воздействие электромагнитным полем приводит к повышению надежности систем противоопухолевой защиты, а энергетический статус лимфоцитов периферической крови сможет свидетельствовать о степени повреждения или восстановления не только на уровне клеточных компонентов иммунной системы, но и на уровне целостного организма.

Однако проведенное исследование не дает представления о состоянии энергетического обмена систем и структур организма, к которым адресованы и через которые происходит реализация электромагнитного воздействия. Такими структурами являются, в частности, структуры мозга, которые обеспечивают формирование общих реакций организма и включение каскадных механизмов регуляции внутренней среды. Кроме того, в прототипе использована модель перевивной опухоли, а контакт организма с таким мощным токсическим фактором, каким является 3,4-бензпирен, безусловно должен отразиться на функционировании митохондрий основного дезинтоксикационного органа - печени.

Целью изобретения является коррекция энергетического метаболизма мозга и печени крыс на ранних этапах химического канцерогенеза при влиянии на мозг сверхнизкочастотных магнитных полей (СНЧМП).

Поставленная цель достигается тем, что регистрируют изменения величин полярографических параметров процессов дыхания и субстратного фосфорилирования митохондрий, изменения полярографических параметров регистрируют в пробах гомогенатов печени и мозга подопытных животных на 1, 5 и 9 неделях после введения химического канцерогена, в течение которых на животных воздействуют сверхнизкочастотным магнитным полем (СНЧМП) индукцией 3,2 мТл в частотно-временном алгоритме 0,03 Гц - 5 мин, 0,3 Гц - 1 мин, 3 Гц - 1 мин, 9 Гц - 1 мин, и выявляют корреляцию изучаемых параметров с выраженностью антиканцерогенного эффекта СНЧМП.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с известными позволяет сделать вывод о существенности отличий и достижения технического результата, заявленного в цели изобретения, т.е. выявляет корреляцию между биотрансфармационными изменениями на ранних этапах химического канцерогенеза и исследуемыми показателями энергопродукции митохондрий в гомогенатах мозга и печени при коррекции состояния организма СНЧМП выбранных параметров.

Теоретическое обоснование представленного “Способа оценки корригирующего влияния магнитного поля на энергетический метаболизм при развитии злокачественного процесса в эксперименте” заключается в том, что в патогенезе злокачественной трансформации происходит нарушение кислород-зависимых систем метаболизма. Утилизация кислорода связана, прежде всего, с накоплением супероксидного радикала, инициирующего свободно-радикальные реакции. При этом истинная ферментативная активность супероксиддисмутазы (СОД), осуществляющей защиту от накопления в клетках супероксидных радикалов, подменяется выходом в гуморальную среду RF-белков, обладающих неферментативной СОД-активностью. Нарушается взаимодействие кислорода с компонентами митохондриальной дыхательной цепи, сопряженной с процессами окислительного фосфорилирования.

На “докислородных” и “гипоксических” этапах эволюции живой природы накопление сукцината так же, как и лактата, происходило в результате анаэробных превращений углеводов и аминокислот (Кондрашова М.Н., 1972; Хочачка П., Сомера Дж., 1977, 1987). Индуцированная химическим канцерогеном и ростом опухоли перестройка биохимической среды на эволюционно древний путь (Франциянц Е.М., 1996) сопряжена с уменьшением доли сукцината в окислительно-восстановительных процессах энергетического обмена за счет преобладания процессов гликолиза. Вместе с тем раковая и лекарственная интоксикация вызывают ингибирование дыхания митохондрий и способствуют разобщению его с окислительным фосфорилированием. При этом фонд эндогенной ЯК, обладающей максимальным энергизующим митохондрий действием, значительно снижается, а резкое уменьшение обеспечения митохондрий субстратами окисления ведет к некомпенсируемым отклонениям в область гипоэргических реакций и опосредованно влияет через катехоламиновую систему на регуляторные нейроэндокринные механизмы (Дильман В.М. и соавт., 1976; Кондрашова М.Н., 1978; Kondrashova M.N. et al., 1980).

Тесные взаимоотношения нервной системы, в частности моно-аминэргических систем головного мозга и опухолевого процесса (Балицкий К.П., 1991), заинтересованность клеточно-глиальных элементов, гипоталамуса, ретикулярной формации в реакциях мозга на магнитные поля (Холодов Ю.А., Лебедева Н.Н., 1992; Холодов Ю.А., 1995), доступность к управлению механизмами опухолевого роста сверхнизкочастотных магнитных полей - СНЧМП (Музалевская Н.И., Урицкий В.М., 1997) и возможность формирования с помощью СНЧМП антистрессорных реакций организма, повышающих его противоопухолевую резистентность (Гаркави Л.Х. и соавт., 1998), определяют основные источники и компоненты патогномоничности показателей митохондриальной энергетики целостного организма-опухоленосителя в условиях корригирующего влияния СНЧМП.

Пример конкретного применения “Способа оценки корригирующего влияния магнитного поля на энергетический метаболизм при развитии злокачественного процесса в эксперименте”.

На стандартных моделях развития опухоли - первичноиндуцированных химическим канцерогеном (3,4-бенз(а)пирен) и воздействия СНЧМП мы проанализировали комплекс изменений параметров энергетического метаболизма в мозге и печени, включая показатели дыхания и энергизованности митохондрий, а также состояние ферментативных систем энергообеспечения. Экспериментальная часть работы выполнена на 72 белых беспородных крысах-самцах. Методики индуцирования химическим канцерогеном (3,4-бенз(а)пирен) опухолей традиционны. Исследование показателей энергообеспечения мозга и печени проводили сразу же после декапитации животных.

Учитывая закономерный и стадийный характер перестройки биохимических процессов при химическом канцерогенезе, изучение параметров функционального состояния MX проводилось на 1, 5 и 9-й неделях канцерогенеза, в течение которых на голову подопытных животных воздействовали СНЧМП индукцией 3,2 мТл в частотно-временном алгоритме 0,03 Гц (5') - 0,3 Гц (1') - 3 Гц (1') - 9 Гц (1'). Контрольная группа была представлена животными с аналогичными сроками канцерогена, но без воздействия СНЧМП.

Объектами исследования служили мозг и печень, гомогенаты которых получали по общепринятой методике (Кондрашова М.Н., Ананенко А.А. Обследование состояний выделенных митохондрий // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М., 1973. С.106-129). Гомогенат сохраняли на льду, в бюксе под крышкой, в камере из пенопласта. Использовали часть гомогената в пределах толстого слоя. Затем отбираемую дозированной пипеткой часть гомогената инкубировали в термостатируемой ячейке объемом 1 мл³ при температуре 26°С. С помощью открытого платинового вращающегося в ячейке электрода полярографически регистрировали дыхание MX гомогенатов в разных метаболических состояниях: в состоянии покоя - при окислении субстрата без АДФ и в активном состоянии - при фосфорилировании добавленной АДФ. Исследования проводили на фоне добавления различных субстратов окисления. Среду выделения добавляли в пропорции 1:1,5 по отношению к весу ткани печени. Среда выделения для гомогенатов печени содержала 0,3 М сахарозы, ЭДТА 1·10^-4 М, триса 1·10 ^-3 М, рН 7,4 при t=0°C. Гомогенат инкубировали в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при 26°С в среде: сахароза 0,2 М, КСl 3·10^-3 М, КН₂РO ₄ 1·10^-3 М, MgSО₄ 6·10 ³ М, рН 7,4. Среда выделения для гомогенатов мозга содержала 0,3 М маннит и 0,01 М трис (1:2 по отношению к весу ткани).Среда инкубации для гомогенатов мозга содержала: 0,17 М маннит, 0,04 М КСl, 0,01 КН₂РO₄, 0,02 М трис, 0,1 mM ЭДТА.

Исследовали окисление добавленной ЯК 6·10^-3 М, и НАД-зависимого субстрата β-оксимасляной кислоты (ОМ) 6·10^-3 М. При определении фонда ЭЯК вместо ЯК в среду инкубации вносили ОМ или ОМ с ингибитором СДГ малонатом 2,2·10^-3 М. Тормозимая малонатом часть дыхания служила мерой ЭЯК. Для выявления щавелево-уксусного ограничения (ЩО) изучали дыхание гомогената в присутствии глутаминовой кислоты (ГК) 4,8·10^-3 М, изолимонной кислоты (ИЗЛ) 2·10^-3 М, β-оксимасляной кислоты 2·10^-3 М и 2·10^-3 М α-глицерофосфата. Скорости дыхания выражали в г-атО₂/мин на мг сухого веса.

Было выявлено выраженное токсогенное влияние на процессы митохондриальной энергетики мозга и печени. Возникающий дисбаланс процессов дыхания и фосфорилирования проявлялся уже на 1-й неделе после введения канцерогена 3,4 БП. В гомогенатах печени признаки угнетения были наиболее выраженными: отмечалось уменьшение диапазона скоростей дыхания (ΔV ₃-V_н=2,25), увеличение времени фосфорилирования (Т_ср=28,3±5,1), появление НЭС при достаточно большом К_р (1,66±0,07). Подобные изменения были выявлены и в мозге, которые усугублялись нарастанием ЩО.

На 5-й неделе канцерогенеза повреждения митохондрий печени были менее выражеными, чем мозга, где отмечалось нарастание НЭС и резкое уменьшение К_р.

Утомление работы дыхательной цепи митохондрий и печени, и мозга ярко проявлялось на 9-й неделе химического канцерогенеза. Дальнейшее нарастание НЭС в печени сочеталось с дефицитом ЯК и повышением К_р (2,1±0,11). В митохондриях мозга сочетание низкого фонда ЭЯК с низкой потребностью в ЯК при отсутствии ЩО указывало на еще более выраженный дисбаланс энергетических процессов. Торможение скоростей дыхания на добавленную ЯК указывало на вероятность блокирования дыхательной цепи на уровне флавиновых ферментов, через которые, преимущественно, происходит поступление ЯК, минуя НАД, или возможность конкурирующего малонового ингибирования митохондриальной СДГ.

Таким образом, на модели химического канцерогенеза мы фактически проследили изменения процессов энергообеспечения органов (мозга и печени), в которых опухоль не развивалась и не возникала от момента контакта канцерогена с организмом вплоть до ее появления. Иными словами, мы проанализировали показатели митохондриальной энергетики, свойственные возникновению опухолевого процесса, и в этих условиях выявили их патогномоничность и принадлежность к чувствительным индикаторам структурно-функциональных повреждений в биомембранах организма.

Сопоставительный анализ состояния энергетического метаболизма опытной и контрольной групп показал, что воздействие СНЧ МП в 1-ю неделю химического канцерогенеза способствовало смягчению признаков НЭС и некоторой интенсификацией дыхания MX. В гомогенатах печени снималось угнетение дыхания на добавленную ЯК (К_як =1,3±0,02 относительно 0,92±0,15 контрольной группы животных через одну неделю от момента введения 3,4 БП, Р<0,05), а возникающее ЩО в сочетании с возросшим К_як и уменьшающимся фондом ЭЯК (2,47±0,08, в контроле 3,76±0,58; Р≤0,05) свидетельствовало об активизации СДГ цикла Кребса. В гомогенатах мозга обнаруживалось увеличение фонда ЭЯК на 20% по отношению к его уровню в контроле при одинаково выраженной потребности в ЯК, а отсутствие ЩО в этих условиях свидетельствовало о возрастании энергизованности митохондрий.

Если на 5-й неделе канцерогенеза СНЧ МП не внесло существенных позитивных изменений в функционирование митохондрий мозга и печени, то на 9-й неделе мы обнаружили два типа поведения систем энергообеспечения, особенно выраженных в гомогенатах мозга. Первый тип характеризовался сохранением состояния повышенной утомляемости митохондрий мозга (торможение на добавленную АДФ в мягких условиях ΔV ₃-V_H=-1,1; время фосфорилирования (Т _ф) очень велико и не определяется, высокая потребность в ЯК - К_як=2,0±0,11 при низком фонде ЭЯК - 1,0±0,15). Второй тип отражал сбалансированную работу митохондрий, что подтверждалось "входом" практически всех изучаемых показателей в зону нормы (К_як<1,35; ФЭЯК>2,45; Т_ф<Т _{ф.контр.}; ΔV ₃-V_H=+1,0), хотя сохранились еще низкие скорости фосфорилирования и щавелево-уксусного ограничения активности СДГ цикла Кребса.

Явление возрастания эндогенной ЯК и тенденция к нормализации систем энергообеспечения мозга под влиянием СНЧМП свидетельствовали о возможности профилактирования нарушений, наступающих при канцерогенезе. Однако очевиден фазный характер такого влияния СНЧ МП, что, вероятно, может быть обусловлено колебательной динамикой митохондриальных процессов, связанной с дефицитом субстратов и поэтапной перестройкой “биохимической среды” организма.

Сопоставляя процессы энергообеспечения в начальные сроки канцерогенеза, считаем необходимым выделить достоверность увеличения фонда эндогенной ЯК, появление признаков динамической вовлеченности сукцината в цикл Кребса и сбалансированность работы митохондрий как признаков коррекции метаболизма. Эти показатели энергетического метаболизма коррелировали с выраженностью антиканцерогенного эффекта - значительной задержкой выхода гистологически верифицированных опухолей в среднем на 8 недель. Обнаруженные при этом изменения в энергетике печени и мозга мы рассматриваем как пример возможного преодоления стрессорной реакции организма на канцерогенную интоксикацию, оказывающую выраженное токсическое воздействие на организм.

Становится очевидным, что изучаемые показатели работы энергетических систем мозга и печени адекватно отражают степень функциональной нагрузки, позволяя дифференцировать как некомпенсируемые отклонения, так и возможность реализации компенсации энергозатрат путем корректировки процессов на уровне клеточных мембран. Также очевиден и тот факт, что биологические мембраны являются модификаторами передачи информации от сигнального воздействия (канцероген, СНЧМП) в клетку и определяют эффективность перестройки энергетического метаболизма на это воздействие.

Установленные нами факты реакции системы энергопродукции митохондрий мозга и печени на ранних этапах канцерогенеза, когда опухоль еще не манифестирует, является абсолютно новым звеном в патогенезе опухолевой болезни. Привлекает внимание новый факт изменения не столько абсолютных значений показателей энергообеспечения MX, сколько нормализация их соотношений, а именно накопление фонда ЭЯК и потребности в ЯК, скоростей дыхания и времени фосфорилирования. Восстановление нарушенных соотношений этих важных характеристик клеточного метаболизма демонстрируют возможность регуляторного влияния на системно-межсистемные связи и усиление процессов жизнедеятельности.

Примером регуляции митохондриальной энергетики центральных (мозг) и периферических (печень) органов служит, прежде всего, изменение состояния высокочувствительной к токсическим воздействиям дыхательной цепи MX. При нарастании интоксикации в организме под влиянием канцерогена, страдает, прежде всего, энергетика мозга. На это указывало заблокирование дыхательной цепи, тестируемое по реакции на добавку ДНФ - разобщителя процессов окисления и фосфорилирования, а заблокированность дыхательной цепи свидетельствует об утомлении митохондрий. Сопряженность этих процессов со снижением дезинтоксикационных функций печени и ослаблением регуляторных влияний мозга коррелировала с изменением сроков выхода опухоли после введения канцерогена.

Анализ найденных изменений позволяет заключить, что системы дыхания MX мозга более чувствительны к повреждению, чем печени, энергетика которой страдает меньше при введении канцерогена. На воздействия центрально-регуляторного характера (СНЧМП) система энергетики печени реагирует слабее, чем мозг, хотя достаточность фонда ЭЯК и повышение К_як позволяет оценить направленность к повышению энергизации MX как одного из условий, обеспечивающего нормализацию дезинтоксикационного барьера. Энергетика мозга реагирует на управляющее воздействие не только сохранностью функционирования дыхательной цепи (проба на ДНФ) митохондрий, но и высоким уровнем процессов окислительного фосфорилирования, обеспечивая тем самым условия для регуляции и повышения неспецифической и противоопухолевой резистентности.

Относительная разбалансировка в работе митохондрий мозга и печени свидетельствует, что способность к восстановлению энергодающих систем при раковой и лекарственной интоксикации определяется различной чувствительностью центральных (мозг) и периферических (печень) звеньев энергопродукции организма не только к повреждающим факторам, но и к регуляторным влияниям (СНЧМП).

Анализ патогенеза опухолевой болезни в свете новых данных о регуляции энергетического обмена позволяет прибавить к арсеналу медицины новые биофизические знания о нормализации патологических отклонений. Нормализующее воздействие СНЧМП следует использовать как дополняющее основной процесс формирования состояния, чтобы компенсировать значительные отклонения от нормы под влиянием злокачественного процесса. Вместе с тем, мы расцениваем митохондриальные процессы как интимные механизмы, адресующиеся к общей основе, составляющие неотъемлемую часть целостной интегральной реакции организма, обеспечивающие и подготавливающие противоопухолевый и защитный эффект при токсических влияниях канцерогена и высокодозной химиотерапии опухолей.

Техническо-экономическая эффективность “Способа оценки корригирующего влияния магнитного поля на энергетический метаболизм при развитии злокачественного процесса в эксперименте” заключается в том, что исследование динамики реакций энергообеспечения в гомогенатах мозга и печени позволяет дать комплексную оценку состояния системы окисления янтарной кислоты в митохондриях, включая измерение скоростей дыхания и степени щавелево-уксусного торможения окисления сукцината, оценку скорости воспроизводства ЯК и величину ее фонда, что определяет значимость совокупности показателей как дифференциально-прогностического теста злокачественного процесса. Использование: биофизические исследования в экспериментальной онкологии для выявления особенностей энергообеспечения на ранних этапах канцерогенеза и воздействиях на мозг, позволяющих моделировать состояние митохондриальной энергетики в ходе развивающейся общей реакции организма. Точность диагностического тестирования энергетического метаболизма достигается тем, что в гомогенатах мозга и печени проводят комплексную оценку функционирования дыхательной цепи митохондрий и состояния системы окисления янтарной кислоты, включающей измерение интенсивности окисления, степени щавелево-уксусного ограничения окисления сукцината, оценку скорости воспроизводства янтарной кислоты и величину ее фонда, т.е. показателей, регламентирующих резистентность клеточных систем к влиянию высокотоксичного канцерогена (3,4 бенз(а)пирен). Положительный эффект использования способа заключается в том, что обнаружение особенностей поведения систем энергообеспечения в мозге и печени может служить дифференциальной диагностикой устойчивости организма при развитии злокачественного процесса, а возможность моделирования состояния энергетики митохондрий с помощью воздействия на мозг СНЧМП может служить триггерным механизмом формирования антистрессорных реакций организма и повышения противоопухолевой резистентности.

Формула изобретения

Способ оценки корригирующего влияния магнитного поля на энергетический метаболизм при развитии злокачественного процесса в эксперименте, включающий регистрацию изменений величин полярографических параметров процессов дыхания и субстратного фосфорилирования митохондрий, отличающийся тем, что изменения полярографических параметров регистрируют в пробах гомогенатов печени и мозга подопытных животных на 1-й, 5-й и 9-й неделях после введения химического канцерогена, в течение которых на животных воздействуют сверхнизкочастотным магнитным полем (СНЧМП) индукцией 3,2 мТл в частотно-временном алгоритме 0,03 Гц - 5 мин; 0,3 Гц - 1 мин; 3 Гц - 1 мин; 9 Гц - 1 мин, и выявляют корреляцию изучаемых параметров с выраженностью антиканцерогенного эффекта СНЧМП.