Способ оценки токсического действия химических веществ на органы и ткани рыб
Владельцы патента RU 2258926:
Федеральное государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Астраханский государственный технический университет (ФГОУ ВПО АГТУ) (RU)
Изобретение относится к области биологии, а именно ихтиологии, и может быть, в частности, использовано для определения наличия интоксикации в организме рыб. Способ оценки токсического действия химических веществ на органы и ткани рыб включает микроскопическое исследование гомогенатов органов и тканей рыб, подвергшихся действию экзогенных факторов химической природы, при котором исследуемый гомогенат в форме капли наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре в течение суток, затем просматривают полученные образцы в поляризованном свете и при появлении цветных анизотропных образований проводят оценку о токсичности химических веществ. Технический результат: упрощение способа и повышение скорости оценки. 2 табл.
Изобретение относится к области ихтиологии, в частности к способам определения наличия интоксикации в организме рыб.
Известен способ оценки токсического действия факторов, химической природы на рыб, включающий исследование биохимических параметров сыворотки крови, характеризующих функциональное состояние внутренних органов и систем (см. кн. Лукъяненко В.И. Токсикология рыб. М., Пищевая промышленность. 1967. - 216 с.; Лукъяненко В.И. Общая ихтиотоксикология М., Легкая и пищевая промышленность, 1983; 320 с.).
Однако способ имеет существенные недостатки, которые ограничивают его использование - потребность в большом количестве исследуемого материала, реактивов и свежих биологических жидкостей.
Известен также способ оценки токсического действия факторов, химической природы на рыб, включающий изменение ряда гематологических показателей: содержание гемоглобина, количество, резистентность и морфология эритроцитов, состав лейкоцитарной формулы, скорость свертывания крови (см. кн. Житенева Л.Д. Долтавцева Т.Г., Рудницкая О.А. Атлас нормальных и патологически измененных клеток крови рыб. Ростов-на-Дону, Кн. изд-во, 1989-112 с.). Недостатками этого способа также являются сложность его осуществления гематологических показателей, многоэтапность и необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов.
Наиболее близким к предлагаемому способу является метод оценки токсического действия факторов, химической природы на рыб, включающий гистологическое исследование биологических тканей организма, позволяющее установить морфологические особенности внутренних органов и тканей при действии токсикантов (Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. Часть 1, глава 5, "Медицина", Москва, 1981, стр.204-216). Недостатками этого способа являются: длительность исследования (не менее 10 дней с момента взятия материала), сложность осуществления, необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов в условиях специализированной лаборатории.
Техническая задача - устранение указанных недостатков и создание такого способа оценки, который позволил бы в короткие сроки, на малых объемах биологических жидкостей и экономно установить признаки токсического воздействия химических веществ на организм рыб. Технический результат - упрощение способа и повышение скорости оценки. Это достигается тем, что в способе оценки токсического действия, включающем микроскопическое исследование высушенных гомогенатов тканей и органов рыб, подвергшихся действию экзогенных факторов химической природы, 0,02 мл исследуемого гомогената наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре, затем просматривают полученные препараты в поляризованном свете и при появлении цветных анизотропных образований судят о токсическом действии химического вещества.
Способ осуществляют следующим образом.
Контрольная или опытная рыба декапитируется, отбираются кусочки органов и тканей рыб, необходимых для дальнейшего исследования. Полученный материал в количестве 1 г помещается в фарфоровую ступку, заливается физиологическим раствором в соотношении 1:2 и тщательно растирается до получения однородной массы (гомогената). После чего 0,02 мл полученного гомогената в форме капли наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре 18-25°С при относительной влажности воздуха 50-70% в течение суток. Полученные препараты просматривают в поляризованном свете и оценивают анизотропные структуры: размер, монохромность или наличие цветных вставок, их количество. Появление цветных кристаллов свидетельствует о токсическом действии химического вещества на органы и ткани рыб (табл.1 и 2).
| Таблица 1 | ||
| Анизоптропные структуры гомогенатов дорзальных мышц экспериментальных рыб | ||
| Группа | Монохромные структуры(%) | Цветные структуры (%) |
| Контроль | 100 | - |
| 10 суток | 20 | 80 |
| 20 суток | 60 | 40 |
| 30 суток | 70 | 30 |
| Таблица 2 | ||
| Анизотропные структуры гомогенатов печени экспериментальных рыб | ||
| Группа | Монохромные структуры (%) | Цветные структуры (%) |
| Контроль | 100 | - |
| 10 суток | 60 | 40 |
| 20 суток | 25 | 75 |
| 30 суток | 10 | 90 |
Предлагаемый способ прошел успешную лабораторную апробацию.
Пример 1 осуществления способа.
30 экземпляров двухлеток карпа содержали в бассейне (емкостью 150 л) и подвергали действию сублетальной концентрации (150 мг/л) сырой каспийской нефти в течение 10 суток. Контролем служили рыбы той же породы, содержавшиеся в чистой отстоянной воде. По истечении эксперимента рыб выводили путем декапитации. Производили патоморфологическое исследование внутренних органов и тканей (печень, дорсальные мышцы) и поляризационно-оптическое изучение гомогенатов тканей и органов.
Микроскопическое строение дорсальных мышц рыб, подвергшихся действию каспийской нефти в течение 10 суток, имело некоторые отличия от такового рыб контрольной группы. Отмечались изменения тинкториальных свойств, полиморфизм мышечных волокон, их частичное разволокнение (деформация). При этом отмечались небольшие участки некроза отдельных мышечных волокон.
При исследовании гомогенатов мышц в поляризованном свете в структуре фаций преобладали монохромные анизотропные кристаллы, на фоне которых регистрировались единичные цветные образования.
При гистологическом изучении печени рыб данной опытной группы наблюдались выраженные изменения: диффузная дистрофия и некрозы целых групп гепатоцитов, расположенных как в центральных, так и в периферийных отделах печеночной дольки.
Исследование гомогенатов печени поляризационно-оптическим методом позволило установить наличие большого количества цветных анизотропных образований.
Пример 2
30 экземпляров двухлеток карпа содержали в бассейне (емкостью 150 л) и подвергали действию сублетальной концентрации (150 мг/л) сырой каспийской нефти в течение 20 суток. Контролем служили рыбы той же породы, содержавшиеся в чистой отстоянной воде. По истечении эксперимента рыб выводили путем декапитации. Производили патоморфологическое исследование внутренних органов и тканей (печень, дорзальные мышцы) и поляризационно-оптическое изучение гомогенатов тканей и органов.
При гистологическом исследовании дорзальных мышц рыб данной опытной группы отмечались крупные участки мышечных волокон с нарушенными тинкториальными свойствами и выраженным полиморфизмом, хорошо видимым на поперечных срезах, а также распад некоторых волокон на отдельные фрагменты. Наблюдаются участки некроза. При исследовании гомогенатов мышц в поляризованном свете в структуре фаций около 40% наблюдаемых анизотропных образований имели цветные вставки.
При гистологическом исследовании печени отмечались крупные кровоизлияния, обширные участки некротизированной паренхимы. Сохранившиеся гепатоциты часто имели деформированные ядра и вакуолизированную цитоплазму.
При исследовании гомогенатов печени в поляризованном свете в структуре фаций около 75% наблюдаемых анизотропных образований отличались различной цветовой гаммой.
Пример 3
30 экземпляров двухлеток карпа содержали в бассейне (емкостью 150 л) и подвергали действию сублетальной концентрации (150 мг/л) сырой каспийской нефти в течение 30 суток. Контролем служили рыбы той же породы, содержавшиеся в чистой отстоянной воде. По истечении эксперимента рыб выводили путем декапитации. Производили патоморфологическое исследование внутренних органов и тканей (печень, дорзальные мышцы) и поляризационно-оптическое исследование гомогенатов изучаемых тканей и органов.
При гистологическом исследовании дорзальных мышц отмечались отек и выраженный некроз мышечных волокон.
Поляризационно-микроскопическое исследование гомогенатов мышц позволило установить, что большая часть поверхности фаций содержала цветные анизотропные образования.
При гистологическом исследовании печени рыб данной группы отмечаются крупные участки некроза гепатоцитов, диффузная дистрофия и сопутствующая воспалительная реакция.
При исследовании гомогенатов печени в поляризованном свете практически вся поверхность фаций заполнена цветными кристаллами.
Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в упрощении способа. Способ прост в техническом исполнении и анализе результатов, отсутствует многоэтапность, исключается необходимость оценки комплекса биохимических показателей, способ осуществим с использованием незначительного количества биологического материала, что актуально для экспериментальных исследований, возможно использование исследуемого материала через год после хранения при - 18°С. Способ экономичен и быстроосуществим - не требует наличия специализированной лаборатории, использования дорогостоящей аппаратуры, реактивов, красителей.
Способ оценки токсического действия химических веществ на органы и ткани рыб, включающий микроскопическое исследование гомогенатов органов и тканей рыб, подвергшихся действию экзогенных факторов химической природы, отличающийся тем, что исследуемый гомогенат в форме капли наносят на поверхность предметного стекла, высушивают при комнатной температуре в течение суток, затем просматривают полученные образцы в поляризованном свете и при появлении цветных анизотропных образований проводят оценку токсичности химических веществ.
