Способ получения смеси глюкозамина, олигосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана (варианты)

Заявленная группа изобретений относится к области химии и медицины и может быть использована для лечения различного рода заболеваний. Сущность изобретения заключается в том, что концентрированные растворы хитозана в среде органических кислот: уксусной, аскорбиновой, янтарной - подвергаются последовательной ферментативной деструкции с применением хитозиназы и липаина. Реакция гидролиза идет в мягких условиях при t=45°C длительное время. Гидролизат подвергают распылительной сушке. Способы позволяют получить продукт, содержащий в своем составе фракции низкомолекулярного хитозана, олигомеров хитозана и глюкозамин, обладающий широким спектром действия, что позволяет применять его при различного рода заболеваниях. 2 н.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу получения смеси глюкозамина, олигомеров хитозана и низкомолекулярного хитозана, используемой для лечения различного рода заболеваний.

Хитозан представляет собой полимер биологического происхождения. С химической точки зрения хитозан представляет собой деацетилированный, обычно более 70%, хитин (поли-2 ацетамидо - 2 дезокси - Д - глюкоза).

Хитозаны, как обычные полисахариды достаточно легко деполимеризуются различными методами, в частности под воздействием кислот или ферментов.

Известен способ получения глюкозамина путем кислотного гидролиза (Новиков В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана. Материалы седьмой международной конференции «Современные перспективы в использовании хитина и хитозана». 2003 г., стр. 38-42).

Путем избирательного гидролиза можно получить олигомеры (2-20). Патент КР 142373 от 31.03.1998 г.

Путем частичного гидролиза можно получить низкомолекулярный хитозан растворимый в воде (Ilyina A.V., Tatarinova N.Yr., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii. Process Biochemistry - 1999 - V.34 - P.875-878).

Все перечисленные продукты имеют достаточно выраженные терапевтические свойства, характерные в большей степени продукту определенной степени деполимеризации.

Способы получения продуктов хитозана, имеющих широкое молекулярно-массовое распределение, имеющих в своем составе фракции низкомолекулярного хитозана, олигомеров хитозана и глюкозамина, ни в научной, ни в патентной литературе не описаны.

Задача изобретения состоит в создании нового способа, позволяющего получить продукт, содержащий в своем составе фракции низкомолекулярного хитозана, олигомеров хитозана и глюкозамин.

Полученный продукт обладает широким спектром терапевтической активности, что определяет возможность его лечебного применения при различного рода заболеваниях.

Глюкозамин аккумулируется в суставной и костной ткани. Он тормозит разрушение хряща за счет ингибирования коллагеназы-1, торможения перекисного окисления липидов, а также стимулирует синтез хрящевой ткани.

Олигосахариды хитозана имеют иммуномодулирующую активность, противоопухолевую и антиатеросклеротическую активность, активность в отношении дистрофически - дегенеративных поражений суставов.

Низкомолекулярные хитозаны связывают желчные кислоты, необходимые для всасывания жиров, способствуя снижению веса и, как следствие, снижению нагрузки на дегенеративно пораженные суставы.

Согласно изобретению возможно, реализуя способ деполимеризации хитозана путем подбора ферментов и условий ферментативного гидролиза, получить продукт с широким молекулярно-массовым распределением, включающим глюкозамин, олигомеры хитозана (n=2-25) и низкомолекулярный водорастворимый хитозан (n<200).

Сущность изобретения заключается в следующем:

для получения смеси глюкозамина, олигосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана предварительно растворяют хитозан в воде, содержащей смесь уксусной и аскорбиновой или уксусной и янтарной кислот, затем в раствор вносят хитозаназу и проводят ферментативный гидролиз в течение 20-30 часов, после чего добавляют в раствор липаин и продолжают ферментативный гидролиз в течение 3-5 часов, далее полученный гидролизат фильтруют и подвергают распылительной сушке.

В другом варианте для получения смеси глюкозамина, олигосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана предварительно растворяют хитозан в воде, содержащей уксусную кислоту или смесь аскорбиновой и янтарной кислот, затем в раствор вносят липаин и проводят ферментативный гидролиз в течение 3-5 часов, после чего в раствор добавляют хитозаназу и продолжают ферментативный гидролиз в течение 20-30 часов, далее полученный гидролизат фильтруют и подвергают распылительной сушке.

Примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1.

Хитозан со степенью деацетилирования 98% и исходной вязкостью 32 сПз (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте), ТУ 9289-058-04689375-2001, полученный из крошки панциря краба путем последовательной деминерализации, депротеирования и деацетилирования, используют для получения его 5% раствора в воде, содержащей 0,7% уксусной кислоты и 1,2% аскорбиновой кислоты.

Ферментативный гидролиз ведут в присутствии хитозаназы с активностью 250 ед/г (производство фирмы "Lyven", Франция), взятой в количестве 1,5 ед хитозаназы к 1 г хитозана при температуре 45°С в течение 24 часов, затем добавляют липаин в количестве 0,5% от веса хитозана (Lypain 48000 фирмы "Lyven", Франция, активность 36000 NFP/mg, содержит в своем составе папаин, хитопапаин и лизоцим) и продолжают ферментативный гидролиз при температуре 45°С в течение 5 часов. Полученный гидролизат фильтруют через полипропиленовый фильтр, имеющий отверстия с диаметром 5 микрон, а затем сушат в распылительной сушилке PC-1,8 со скоростью подачи раствора 50 л/час, температура входящего горячего воздуха 160-170°С, а температура выходящего воздуха 60-70°С. Полученный продукт имеет вязкость 1,7 сПз. Молекулярно-массовое распределение полученного продукта определялось хроматографическим анализом на хроматографической системе ВЭЖХ - система Bio-Rad XL. Элюент: фосфорный буфер (0,05 М, рН3) с добавлением 0,5 NaNO₃, скорость потока 1,1 мл/мин. Калибровка осуществлялась по декстранам ("Pharmacia Fine Chemicals") с известной массой в диапазоне 20-250 тыс. дальтон, а также по мальтоолигосахаридам ("Sigma") и глюкозе в области низких масс. Молекулярно-массовое распределение полученного продукта:

Глюкозамин	14,2%
Олигомеры хитозана (n=2-25)	76,6%
Низкомолекулярный хитозан (n<200)	9,2%

Пример 2.

Хитозан со степенью деацетилирования 98% и исходной вязкостью 32 сПз (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте), полученный из крошки панциря краба, используют для получения его 5% раствора в воде, содержащей 1,2% аскорбиновой и 1,2% янтарной кислоты. Ферментативный гидролиз ведут в присутствии липаина с активностью 36000 NFP/mg взятого в количестве 0,5% к массе хитозана при температуре 45°С в течение 3 часов, затем добавляют хитозаназу с активностью 250 ед/г, взятой в количестве 1,5 ед. хитозаназы к 1 г хитозана, и проводят ферментативный гидролиз в течение 20 часов. Полученный гидролизат фильтруют и сушат в условиях примера 1. Продукт имеет вязкость 1,6 сПз. Молекулярно-массовое распределение продукта определено в условиях примера 1:

Глюкозамин	14,7%
Олигомеры хитозана (n=2-25)	76%
Низкомолекулярный хитозан (n<200)	9,3%

Пример 3.

Хитозан со степенью деацетилирования 98% и исходной вязкостью 32 сПз (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте) используют для получения его 5% раствора в воде, содержащей 0,7% уксусной кислоты и 1,2% янтарной кислоты. Ферментативный гидролиз ведут в условиях примера 1. Полученный гидролизат фильтруют и сушат в условиях примера 1. Продукт имеет вязкость 1,6 сПз. Молекулярно-массовое распределение продукта определено в условиях примера 1:

Глюкозамин	15,1%
Олигомеры хитозана (n=2-25)	73,2%
Низкомолекулярный хитозан (n<200)	11,7%

Пример 4.

Хитозан со степенью деацетилирования 98% и исходной вязкостью 32 сПз (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте) используют для получения его 5% раствора в воде, содержащей 2,4% уксусной кислоты. Ферментативный гидролиз ведут в условиях примера 2. Полученный гидролизат фильтруют и сушат в условиях примера 1. Продукт имеет вязкость 1,8 сПз. Молекулярно-массовое распределение продукта определено в условиях примера 1:

Глюкозамин	14,7%
Олигомеры хитозана (n=2-25)	73,3%
Низкомолекулярный хитозан (n<200)	12%

Пример 5.

Хитозан со степенью деацетилирования 95% и исходной вязкостью 800 сПз (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте) используют для получения его 3% раствора в воде, содержащей 1% уксусной кислоты. Ферментативный гидролиз ведут в присутствии липаина с активностью 36000 NFP/mg, взятого в количестве 0,5% к массе хитозана, при температуре 45°С в течение 4 часов, затем добавляют хитозаназу с активностью 250 ед/г, взятой в количестве 1,1 ед. хитозаназы к 1 г хитозана, и продолжают гидролиз при температуре 45°С в течение 30 часов. Продукт имеет вязкость 1,7 сПз. Молекулярно-массовое распределение продукта определено в условиях примера 1:

Глюкозамин	15,1%
Олигомеры хитозана (n=2-25)	74,2%
Низкомолекулярный хитозан (n<200)	10,7%

Данные, подтверждающие клиническое применение полученного продукта.

Изучение эффективности и переносимости продукта, полученного согласно изобретению на основе хитозана с широким молекулярно-массовым распределением (ХШММР) при вертеброгенной дорсалгии, проводилось на базе клиники нервных болезней областной клинической больницы им. Семашко (г. Н.Новгород).

Под наблюдением находилось 16 пациентов в возрасте от 32 до 63 лет, из них 10 женщин и 6 мужчин. Все пациенты страдали вертеброгенной дорсалгией. Длительность болевого синдрома составляла от 3 недель до 14 месяцев. У 4 пациентов диагностировалась вертеброгенная люмбоишиалгия, у 12 - дискогенная радикулопатия с заинтересованностью 5 поясничного и/или первого крестцового корешка. Все наблюдавшиеся пациенты ранее проходили курсы лечения с применением нестероидных противовоспалительных препаратов, витаминов группы В, физиотерапевтических процедур, эффект которых был недостаточным.

Для выполнения поставленной цели было сформировано две группы больных. 10 пациентов, получавших противовоспалительные препараты, витамины группы В, физиотерапевтические и ортопедические процедуры, составили группу контроля. В основную группу вошли 6 пациентов, получавших ХШММР по 700 мг в день в течение 40 дней в сочетании с адекватным ортопедическим режимом и ЛФК. Длительность наблюдения составила 6-8 недель.

Эффективность проводимого лечения оценивалась по следующим критериям:

1. Степень выраженности болевого синдрома по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) в баллах от 1 до 10.

2. Степень нарушения объема движений в поясничном отделе позвоночника (от 0 до 4 баллов).

3. Степень выраженности мышечно-тонических проявлений (от 0 до 4 баллов).

4. Степень выраженности нейродистрофического синдрома (от 0 до 4 баллов).

5. Степень выраженности корешкового синдрома (от 0 до 4 баллов). Оценивалась также переносимость препарата пациентами.

Результаты проведенного лечения в основной группе.

В результате проведенного лечения отмечалось уменьшение выраженности болевого синдрома в среднем на 4,2 балла по данным визуальной аналоговой шкалы.

Степень выраженности кинетических нарушений составила: до лечения - 3,5 балла, после лечения - 1,8 балла.

Степень выраженности мышечно-тонических проявлений: до лечения - 3,3 балла, после лечения - 2,8 балла.

Степень выраженности корешкового синдрома (у больных с радикулопатией): до лечения - 2,7 балла, после лечения - 2,5 балла.

Степень выраженности нейродистрофических проявлений: до лечения - 3,8 балла, после лечения - 2,5 балла.

В результате проведенного лечения в основной группе отмечено достоверное уменьшение болевого синдрома, степени выраженности кинетических нарушений и нейродистрофических проявлений. Препарат хорошо переносился всеми больными. Результаты лечения в основной группе имели достоверные отличия от группы контроля по показателям - кинетические нарушения и нейродистрофические проявления. Следует отметить положительное влияние препарата на сопутствующий суставной алгический синдром, имевший место практически у всех пациентов.

Помимо использования ХШММР для лечения вертеброгенной дорсалгии, полученный продукт может быть использован для нормализации работы печени, лечения гипертонии.

Испытаниями ХШММР в Нижегородской государственной медицинской академии выявлено специфическое биологическое действие препарата, прослеживаются модуляции метаболических параметров у экспериментальных животных-опухоленосителей.

1. Способ получения смеси глюкозамина, олигосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана, характеризующийся тем, что хитозан растворяют в воде, содержащей смесь уксусной и аскорбиновой или уксусной и янтарной кислот, затем в раствор вносят хитозиназу в количестве 1,5 ед на 1 г хитозана, проводят ферментативный гидролиз при температуре 45°С в течение 20-30 ч, после чего добавляют липаин в количестве 0,5% к массе хитозана и продолжают ферментативный гидролиз в течение 3-5 ч, полученный гидролизат фильтруют через фильтр с диаметром 5 мкм, подвергают распылительной сушке со скоростью подачи раствора 50 л/ч, температурой воздуха на входе 160-170°С и температурой воздуха на выходе 60-70°С и получают целевой продукт с вязкостью 1,6-1,8 сПз.

2. Способ получения смеси глюкозамина, олигосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана, характеризующийся тем, что хитозан растворяют в воде, содержащей уксусную кислоту или смесь аскорбиновой и янтарной кислот, в раствор вносят липаин в количестве 0,5% от веса хитозана и проводят ферментативный гидролиз при температуре 45°С в течение 3-5 ч, затем добавляют хитозиназу в количестве 1,5 ед на 1 г хитозана и продолжают ферментативный гидролиз при температуре 45°С в течение 20-30 ч, полученный гидролизат фильтруют через фильтр с диаметром 5 мкм, подвергают распылительной сушке со скоростью подачи раствора 50 л/ч, температурой воздуха на входе 160-170°С и температурой воздуха на выходе 60-70°С и получают целевой продукт с вязкостью 1,6-1,8 сПз.