Применение бисфосфоновых кислот для лечения ангиогенеза

Предложено: применение бисфосфоновых кислот (бисфосфонатов) для эмболического лечения ангиогенеза и соответствующие способы профилактики или лечения ангиогенеза путем эмболизации. Изобретение обеспечивает подавление роста, инвазии или метастазов опухоли, лечение ангиогенеза при ишемии миокарда, ревматоидном артрите, остеоартрите за счет эмболизации вновь образовавшихся сосудов при внутриартериальном введении бисфосфоната (например, памидроновой кислоты или золедроната). 3 н. 7 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и их применению, в частности к фармацевтическим композициям, которые включают бисфосфонаты, и к новым применениям бисфосфонатов в терапии.

Бисфосфонаты широко применяются для ингибирования активности остеокластов при различных доброкачественных и злокачественных заболеваниях, при которых повышается резорбция кости. Так, в настоящее время бисфосфонаты начинают применяться для продолжительного лечения пациентов, страдающих множественной миеломой (ММ). Эти пирофосфатные аналоги не только приводят к снижению случаев поражения скелета, но они также оказывают благоприятное воздействие на пациентов в клинических условиях и снижают смертность. Бисфосфонаты могут предупреждать резорбцию кости in vivo; терапевтическая эффективность бисфосфонатов была продемонстрирована при лечении костной болезни Педжета, вызванной опухолью гиперкальцемии, и в более поздних исследованиях - при метастазе в костную ткань и множественной миеломе (обзор литературы см. у Fleisch Н., 1997, Bisphosphonates clinical. В: Bisphosphonates in Bone Disease. From the Laboratory to the Patient. Изд.: The Parthenon Publishing Group, New York/London, стр.68-163). Механизмы, посредством которых бисфосфонаты ингибируют резорбцию кости, еще не полностью выяснены и, вероятно, варьируются в зависимости от исследуемых бисфосфонатов. Было установлено, что бисфосфонаты интенсивно связываются с гидроксиапатитными кристаллами кости, что приводит к уменьшению обновления и резорбции кости, снижению уровней гидроксипролина или щелочной фосфатазы в крови и, кроме того, к ингибированию как активации, так и активности остеокластов.

ММ представляет собой злокачественное заболевание плазматических клеток, характеризующееся пролиферацией и накоплением злокачественных плазматических клеток в костном мозге. Основными клиническими последствиями являются литические повреждения кости, сопровождаемые патологическими переломами и костной болью. Эти повреждения являются результатом чрезмерной резорбции кости, часто приводящей к гиперкальцемии. Бисфосфонаты предложены для продолжительного лечения ММ в сочетании с общепринятой химиотерапией. В настоящее время было установлено, что бисфосфонаты, такие как клодронат и памидронат, могут снижать случаи поражения скелета, такие как литические повреждения кости и патологические переломы, и могут облегчать костную боль и улучшать качество жизни пациентов.

При создании изобретения неожиданно установлено, что некоторые бисфосфонаты оказывают эмболическое действие на вновь образованные капилляры кровеносных сосудов, которые формируются при ангиогенезе, связанном с ростом и инвазией опухоли и с определенными другими патологическими состояниями, такими как воспаление, ревматоидный артрит и остеоартрит. Кроме того, было установлено, что некоторые бисфосфонаты ингибируют индуцируемый фактором роста ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток при использовании в качестве моделей животных и в экспериментах на культуре ткани.

Объектом настоящего изобретения является способ лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, предусматривающий введение пациенту эффективного количества бисфосфоната.

Кроме того, объектом изобретения является применение бисфосфоната для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения ангиогенеза.

Изобретение также относится к применению бисфосфоната для лечения ангиогенеза, связанного с заболеваниями или патологическими состояниями у млекопитающих.

Ангиогенез, т.е. образование новых кровеносных сосудов, представляет собой основное явление при многих патологических процессах, таких как заживление ран, овуляция и эмбриогенез. Реваскуляризация также является ключевым компонентом многих патологических процессов, таких как воспаление, ишемия миокарда, ревматоидный артрит, остеоартрит и образование опухоли, например, рост, инвазия или метастаз опухоли. Многие твердые опухоли вызывают образование от исходного сосудистого ложа новых капиллярных кровеносных сосудов, предназначенных для снабжения питательными веществами и кислородом. Таким образом, изобретение в целом может применяться для лечения болезней и медицинских состояний, связанных с ангиогенезом, в процессе возникновения или развития болезни или состояния, включая указанные выше болезни или состояния. Дополнительные и более конкретные примеры связанных с ангиогенезом болезней и состояний, которые могут лечиться с помощью способа по изобретению, включают: ретинопатии, например, диабетическую ретинопатию, псориаз, гемангиобластому, гемангиому, боль, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна и, прежде всего, неопластические заболевания (твердые опухоли), прежде всего рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак легкого (прежде всего мелкоклеточный рак легкого) или рак предстательной железы.

Варианты применения и способы по настоящему изобретению позволяют усовершенствовать существующую терапию злокачественных заболеваний посредством применения бисфосфонатов для предупреждения или ингибирования метастаза в костную ткань или чрезмерной резорбции кости, а также терапию воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и остеоартрит. Было установлено, что применение бисфосфонатов для эмболизации вновь образовавшихся кровеносных сосудов приводит к подавлению опухолей, например, твердых опухолей, и метастазов, например, метастазов в костную ткань, и даже к уменьшению размера опухолей, например, твердых опухолей, и матастазов, например, метастазов в костную ткань, после соответствующих периодов лечения. С помощью ангиографии доказано, что вновь образовавшиеся кровеносные сосуды исчезают после лечения бисфосфонатами, но при этом нормальные кровеносные сосуды остаются неповрежденными. Кроме того, было установлено, что подвергнутые эмболизации кровеносные сосуды не восстанавливаются после прекращения лечения бисфосфонатами. Также было установлено, что у пациентов, страдающих метастазом в костную ткань, ревматоидным артритом и остеоартритом, наблюдается снижение боли после лечения бисфосфонатами.

Хотя механизм действия бисфосфонатов в качестве агентов, которые вызывают эмболизацию вновь образовавшихся кровеносных сосудов пока не выяснен, вероятно, при их воздействии вновь образовавшиеся кровеносные сосуды (капилляры) блокируются, происходит их частичная или полная облитерация или ангиогенез изменяется каким-либо иным образом, что приводит к частичному или полному исчезновению вновь образовавшихся кровеносных сосудов (капилляров), например, при оценке опухоли или места заболевания, например, места воспаления, с помощью ангиографии. В контексте настоящего описания понятия "эмболическое лечение ангиогенеза" или "эмболическое действие" относятся к таким обнаруженным явлениям.

Таким образом, другими объектами изобретения являются:

- способ эмболического лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, предусматривающий введение пациенту эффективного количества бисфосфоната;

- применение бисфосфоната для приготовления лекарственного средства, предназначенного для эмболического лечения ангиогенеза, и

- применение бисфосфоната в качестве агента, ингибирующего ангиогенез.

Кроме того, как это описано в приведенных ниже примерах, установлено, что определенные бисфосфонаты ингибируют индуцированный фактором роста ангиогенез при использовании в качестве моделей животных, а также ингибируют пролиферацию эндотелиальных клеток при использовании в качестве модели культуры ткани. Очевидно, что такое ингибирование ангиогенеза не зависит от истощения актированных макрофагов, более вероятно, что бисфосфонаты оказывают воздействие на уровень активации эндотелиальных клеток и/или пролиферации эндотелиальных клеток. Таким образом, бисфосфонаты целесообразно применять также для профилактического или превентивного лечения болезней и медицинских состояний, которые связаны с ангиогенезом, путем ингибирования возникновения или развитие ангиогеназа, включая указанные выше болезни и медицинские состояния.

Таким образом, другими объектами изобретения являются:

- способ профилактического или превентивного лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, предусматривающий введение пациенту эффективного количества бисфосфоната;

- применение бисфосфоната для приготовления лекарственного средства, предназначенного для профилактического или превентивного лечения ангиогенеза, и

- применение бисфосфоната в качестве агента, ингибирующего ангиогенез.

В частности, изобретение относится к указанным непосредственно выше способу и вариантам применения, которые не зависят или не включают истощение активированных макрофагов.

Таким образом, в контексте настоящего описания понятия "лечение" или "лечить" относятся как к профилактическому или превентивному лечению, так и к лечебной терапии или модифицирующему заболевание лечению, включая лечение пациентов, которые имеют риск заболевания болезнью или для которых ожидается, что они могут быть заражены болезнью, а также пациентов, которые уже больны или у которых диагностированы заболевание или медицинское состояние.

Применяемые согласно изобретению бисфосфонаты, как правило, представляют собой бисфосфонаты, которые могут вызывать описанные выше эмболическое или ингибирующее ангиогенез действие.

Так, например, бисфосфонаты, которые применяют согласно изобретению, могут включать следующие соединения или их фармацевтически приемлемые соли или их любые гидраты: 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту (памидроновая кислота), например, пимидронат (APD); 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, диметил-APD; 4-амино-1-гидроксибутан-1,1-дифосфоновую кислоту (алендроновая кислота), например, алендронат; 1-гидроксиэтиденбисфосфоновую кислоту, например, этидронат; 1-гидрокси-3-(метилпентиламино)пропилиденбисфосфоновую кислоту, т.е. ибандроновую кислоту, например, ибандронат; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, аминогексил-ВР; 3-(N-метил-N-н-пентиламино) -1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, метилпентил-APD (=ВМ 21.0955); 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, золедроновую кислоту; 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту (ризедроновая кислота), например, ризедронат, включая соли с N-метилпиридинием, например, йодиды N-метилпиридиния, такие как NE-10244 или NE-10446; 1-(4-хлорфенилтио)метан-1,1-дифосфоновую кислоту (тилудроновая кислота), например, тилудронат; 3-[N-(2-фенилтиоэтил)-N -метиламино]-1-гидроксипропан-1,1 -дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, ЕВ 1053 (фирма Leo); 1-(N-фениламинотиокарбонил)метан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, FR 78844 (фирма Fujisawa); тетраэтиловый эфир 5-бензоил-3,4-дигидро-2Н-пиразол-3,3-дифосфоновой кислоты, например, U-81581 (фирма Upjohn); 1-гидрокси-2-(имидазо [1,2-а] пиридин-3-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту, например, YM 529, и 1,1-дихлорметан-1,1 -дифосфоновую кислоту (клодроновая кислота), например, клодронат.

Фармацевтически приемлемые соли предпочтительно представляют собой соли с основаниями, обычно соли металлов из групп Ia, Ib, IIa IIb Периодической таблицы элементов, включая соли щелочных металлов, например, калия, и особенно предпочтительно соли натрия, или соли щелочноземельных металлов, предпочтительно соли кальция или магния, а также аммонийные соли с аммиаком или органическими аминами.

Особенно предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли, в которых 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2, кислотных водорода бисфосфоновой кислоты заменены фармацевтически приемлемым катионом, в частности натрием, калием или аммонием, в первую очередь натрием.

Наиболее предпочтительная группа фармацевтически приемлемых солей отличается наличием одного кислотного водорода и одного фармацевтически приемлемого катиона, прежде всего натрия, в каждой из групп фосфоновой кислоты.

Все отмеченные выше производные бисфосфоновых кислот хорошо известны из литературы. В том числе хорошо известно их получение (см. например, ЕР-А-513760, стр.13-48). Например, 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту получают согласно методу, описанному в патенте США 3962432, а ее динатриевую соль получают согласно методам, описанным в патентах США 4639338 и 4711880, а 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту получают согласно методу, описанному, например, в патенте США 4939130.

Конкретным вариантом осуществления является применение производного бисфосфоновой кислоты, выбранного из группы, включающей 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 4-амино-1-гидроксибутан-1,1-дифосфоновую кислоту; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновую кислоту; 3-(N-метил-N-н-пентиламино) -1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту и ее соли с N-метилпиридинием; 1-(4-хлорфенилтио) метан-1,1-дифосфоновую кислоту; 3-[N-(2-фенилтиоэтил)-N метиламино]-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-(N-фениламинотиокарбонил)метан-1,1-дифосфоновую кислоту; тетраэтиловый эфир 5-бензоил-3,4-дигидро-2N-пиразол-3,3-дифосфоновой кислоты; 1-гидрокси-2-(имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту; или их фармацевтически приемлемую соль и их любой гидрат.

Предпочтительным вариантом осуществления является применение производного бисфосфоновой кислоты, выбранного из группы, включающей 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 4-амино-1-гидроксибутан-1,1-дифосфоновую кислоту; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновую кислоту; (N-метил-N-н-пентиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-2-(3-пиридил) этан-1,1-дифосфоновую кислоту; 3-[N-(2-фенилтиоэтил)-N-метиламино]-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-дифосфоновую кислоту; 1-гидрокси-2-(имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту или их фармацевтически приемлемую соль и их любой гидрат.

Более предпочтительным вариантом осуществления является применение производного бисфосфоновой кислоты, выбранного из группы, включающей памидроновую кислоту, алендроновую кислоту, 3-(N-метил-N-н-пентиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту, 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту, ризедроновую кислоту и тилудроновую кислоту или их фармацевтически приемлемую соль и их любой гидрат.

Наиболее предпочтительным вариантом осуществления является применение производного бисфосфоновой кислоты, выбранного из группы, включающей 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту и 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту или их фармацевтически приемлемую соль и их любой гидрат.

Кроме того, изобретение относится к применению 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и ее любого гидрата, например, динатрийпамидроната или памидроната.

Кроме того, изобретение относится к применению 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и ее любого гидрата, например, золедроновой кислоты.

При создании изобретения на моделях с использованием животных было установлено, что золедроновая кислота (1-гидрокси-2-(имидазол-1 -ил) этан-1, 1-дифосфоновая кислота) в более значительной степени ингибирует ангиогенез, индуцируемый основным фактором роста фибробластов (bFGF) по сравнению с ее способностью ингибировать ангиогенез, индуцируемый сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), что описано ниже в примерах.

Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления изобретение относится к указанным выше способу или применению,

- которые отличаются тем, что бисфосфонат представляет собой золедроновую кислоту, или ее фармацевтически приемлемую соль, или ее любой гидрат, а ангиогенез представляет собой индуцируемый bFGF ангиогенез, или

- которые отличаются тем, что бисфосфонат представляет собой золедроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль или ее любой гидрат, а бисфосфонат применяют в сочетании с ингибитором VEGF.

Бисфосфонаты (обозначенные ниже как Агенты по изобретению) могут применяться в форме изомера или при необходимости смеси изомеров, как правило оптических изомеров, таких как энантиомеры, или диастереоизомеры, или геометрические изомеры, как правило, цис-транс-изомеры. Оптические изомеры получают в форме чистых антиподов и/или рацематов.

Агенты по изобретению также могут применяться в форме их гидратов или могут включать любые растворители, применяемые для их кристаллизации.

Агенты по изобретению (бисфосфонаты) предпочтительно применяют в форме фармацевтических композиций, которые содержат терапевтически эффективное количество действующего вещества необязательно в сочетании или в смеси с неорганическими или органическими твердыми или жидкими фармацевтически приемлемыми носителями, которые являются пригодными для введения.

Фармацевтические композиции могут представлять собой, например, композиции для энтерального введения, такого как пероральное, ректальное введение, ингаляция с помощью аэрозоля или назальное введение, композиции для парентального ведения, такого как внутривенное или подкожное введение, или композиции для трансдермального введения (например для пассивного или ионофоретического введения).

Предпочтительно фармацевтические композиции адаптируют для перорального или парентерального (предпочтительно внутривенного, внутриартериального или трансдермального введения). Внутриартериальное и пероральное, прежде всего Внутриартериальное введение, являются особенно важными. Предпочтительно действующее вещество, представляющее собой бисфосфонат, имеет форму для парентерального, наиболее предпочтительно форму для внутриартериального введения.

Конкретный путь введения и доза могут быть выбраны лечащим врачом, принимая во внимание конкретные особенности пациента, прежде всего возраст, вес, образ жизни, уровень активности, гормональный статус (например, постклимактерический) и при необходимости плотность костного минерала. Однако более предпочтительно бисфосфонат вводят внутриартериально в артерию, которая подходит к месту, в котором происходит новообразование кровеносных сосудов.

Таким образом, предпочтительными вариантами осуществления являются:

- способ эмболического лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, предусматривающий внутриартериальное введение пациенту эффективного количества бисфосфоната;

- применение бисфосфоната для приготовления лекарственного средства, предназначенного для внутриартериального эмболического лечения ангиогенеза,

- внутриартеральное применение бисфосфоната для лечения или реверсии ангиогенеза, связанного с болезнями или патологическими состояниями у млекопитающих, и

- внутриартеральное применение бисфосфоната в качестве агента, ингибирующего ангиогенез.

Доза Агентов по изобретению может зависеть от различных факторов, таких как эффективность и продолжительность действия действующего вещества, путь введения, виды теплокровных животных и/или пол, возраст, вес и индивидуальное состояние теплокровного животного.

Как правило, доза является такой, что теплокровному животному весом примерно 75 кг вводят однократную дозу действующего вещества, представляющего собой бисфосфонат, включающую от 0,002 до 3,4 мг/кг, предпочтительно 0,01-2,40 мг/кг. При необходимости эта доза может быть разделена на несколько необязательно одинаковых частичных доз.

Понятие "мг/кг" обозначает количество лекарственного средства в мг на кг веса млекопитающего, подлежащего лечению, включая человека.

Применение указанной выше дозы, вводимой либо в виде однократной дозы (что является предпочтительным), либо в виде нескольких частичных доз, может повторяться, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, каждые три месяца, каждые 6 месяцев или каждый год. Другими словами, фармацевтические композиции могут вводиться в диапазоне режимов от непрерывной суточной терапии до прерывистой периодической терапии.

Предпочтительно бисфосфонаты вводят в дозах, которые по величине соответствуют дозам, применяемым для лечения болезней, которые обычно лечат с использованием производных бисфосфоновых кислот, таких как болезнь Педжета, вызванная опухолью гиперкальцемия или остеопороз. Другими словами, предпочтительно производные бисфосфоновых кислот вводят в дозах, которые аналогичны терапевтически эффективным дозам, применяемым для лечения болезни Педжета, вызванной опухолью гиперкальцемии или остеопороза, т.е. предпочтительно их вводят в дозах, которые также могут эффективно ингибировать резорбцию кости.

Композиции в виде однократных стандартных доз предпочтительно содержат от примерно 1% до примерно 90%, а композиции, которые не представляют собой однократную стандартную дозу, предпочтительно содержат от примерно 0,1% до примерно 20% действующего вещества. Формы однократных стандартных доз, такие как капсулы, таблетки или драже, содержат от примерно 1 мг до примерно 500 мг действующего вещества.

Фармацевтические композиции для энтерального и парентерального введения представляют собой, например, композиции в виде стандартных дозируемых форм, таких как драже, таблетки или капсулы, а также ампулы. Их приготавливают хорошо известным методом, например, с помощью общепринятых процессов смешения, грануляции, конфекции, растворения или лиофилизации. Например, фармацевтические композиции для перорального введения могут быть получены объединением действующего вещества с твердыми носителями, при необходимости грануляции образовавшейся смеси и обработки смеси или гранулята, при желании или при необходимости после добавления приемлемых адъювантов, с получением таблеток или ядер драже.

Пригодными носителями являются прежде всего наполнители, такие как сахара, например, лактоза, сахароза, маннит или сорбит, препараты на основе целлюлозы и/или фосфаты кальция, например, трикальцийфосфат или вторичный кислый фосфат кальция, а также связующие вещества, такие как крахмальные пасты, полученные с использованием, например, кукурузного, пшеничного, рисового или картофельного крахмала, желатин, трагакант, метилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон, и при необходимости разрыхлители, такие как указанные выше крахмалы, а также карбоксиметиловый крахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Адъюванты предпочтительно представляют собой вещества, улучшающие текучесть, и замасливатели, например, кремниевую кислоту, тальк, стеариновую кислоту или ее соли, такие как стеарат магния или кальция, и/или полиэтиленгликоль. На ядра драже наносят пригодные покрытия, которые могут обладать устойчивостью к действию желудочных соков, при этом среди прочего применяют концентрированные сахарные растворы, которые необязательно могут включать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, или покрытия, наносимые из раствора, в пригодных органических растворителях или смесях растворителей, или для получения покрытий, устойчивых к действию желудочных соков, растворы приемлемых композиций на основе целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. В покрытия таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты, например, для целей идентификации или для обозначения различных доз действующего вещества.

Другими фармацевтическими композициями для перорального введения являются капсулы с сухим наполнителем, сделанные из желатина, а также запечатанные капсулы с мягким покрытием, состоящим из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Капсулы с сухим наполнителем могут включать действующее вещество в форме гранул, например, в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или веществами, улучшающими скольжение, такими как тальк или стеарат магния, и при необходимости со стабилизаторами. В капсулах с мягким покрытием действующее вещество предпочтительно растворяют или суспендируют в пригодных жидкостях, таких как жирные масла, парафиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли, при этом также могут быть добавлены стабилизаторы.

Композиции для парентерального введения предпочтительно представляют собой инъецируемые жидкости, которые эффективны при различных путях введения, например, при введении внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, интраназально, интрадермально, подкожно или предпочтительно внутриартериально. Такие жидкости предпочтительно представляют собой изотонические водные растворы или суспензии, которые могут быть приготовлены перед применением, например, из подвергнутых лиофилизации препаратов, которые содержат действующее вещество индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции могут быть стерильными и/или могут содержать адъюванты, например, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты и/или эмульгаторы, солюбилизирующие агенты, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы.

Приемлемые композиции для трансдермального введения включают эффективное количество действующего вещества в сочетании с носителем. Предпочтительные носители включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители, которые способствуют проникновению через кожу хозяина. Как правило, трансдермальные устройства имеют форму повязки, включающей поддерживающий элемент, резервуар, содержащий соединение необязательно с носителями, необязательно контролирующий скорость барьер для введения действующего вещества через кожу хозяина с контролируемой и предварительно рассчитанной скоростью в течение продолжительного периода времени, и элементы для прикрепления устройства к коже.

Далее описанное выше изобретение проиллюстрировано на примерах, при этом пример 5 сопровождается следующими чертежами:

на фиг.1 представлены ангиограммы левых бронхиальных артерий пациента, страдающего раком молочной железы, до (а) и после (б) лечения динатрийпамидронатом;

на фиг.2 представлены ангиограммы правых бронхиальных артерий этого же пациента, страдающего раком молочной железы, до (а) и после (б) лечения динатрийпамидронатом и

на фиг.3 представлены ангиограммы правого коленного сустава пациента, страдающего остеоартритом, до (а) и после (б) лечения динатрийпамидронатом.

В следующих примерах понятие "действующее вещество" относится к любому из указанных выше производных бисфосфорных кислот, которые могут применяться согласно настоящему изобретению.

Примеры

Пример 1: Капсулы, содержащие гранулы с покрытием, которые включают действующее вещество, например, пентагидрат динатрийпамидроната:

Смесь динатрийпамидроната с Avicel® PH 105 увлажняют водой и перемешивают, экструдируют и получают сферы. На высушенные гранулы затем последовательно в псевдоожиженном слое наносят внутреннее покрытие, включающее целлюлозу НР-М 603, полиэтиленгликоль (ПЭГ) 8000 и тальк, и водное устойчивое к действию желудочных соков покрытие, включающее Eudragit® L 30 D, триэтилцитрат и Antifoam® AF. Гранулы с нанесенным покрытием опыляют тальком и заполняют ими капсулы (капсулы размера 0) с помощью имеющегося в продаже устройства для заполнения капсул, например, поставляемого фирмой and Karg.

Пример 2: Монолитная адгезивная трансдермальная система, содержащая в качестве действующего вещества, например, 1-гидрокси-2-(имидазол-1-20 ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту:

Состав, г:

полиизобутилен (ПИБ) 300
(Oppanol B1, фирма BASF)	5,0
ПИБ 35000
(Oppanol B10, фирма BASF)	3,0
ПИБ 1200000
(Oppanol B100, фирма BASF)	9,0
гидрогенизированная углеводородная смола
(Escorez 5320, фирма Еххоп)	43,0
1-додецилазациклогептан-2-он
(Azon, фирма Nelson Res., Ирвин/
штат Калифорния)	20,0
действующее вещество	20,0
Всего:	100,0

Приготовление:

Все вышеперечисленные компоненты растворяют в 150 г петролейной фракции 100-125 с определенной температурой кипения путем вращения в устройстве с роликовым настилом. Раствор наносят на полиэфирную пленку (фирма Hostaphan, Калле) с помощью устройства для размазывания с использованием 300-миллиметрового ракельного ножа, обеспечивающего нанесение покрытия с массой единицы поверхности примерно 75 г/м. После сушки (15 мин при 60°С) наносят обработанную силиконом полиэфирную пленку (толщиной 75 мм, фирма Laufenberg) в виде клейкой пленки с предохранительным слоем. Из полученных в результате систем вырезают с помощью пуансона образцы требуемой формы размером от 5 до 30 см. Готовые к применению системы запечатывают по отдельности в пакеты из алюминизированной бумаги.

Пример 3: Пузырек, содержащий 1,0 мг безводной лиофилизированной 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновой кислоты (ее смешанные натриевые соли). После растворения с помощью 1 мл воды получают раствор (концентрации 1 мг/мл) для внутривенной инфузии.

Состав:

действующее вещество (свободная дифосфоновая кислота)	1,0 мг
маннит	46,0 мг
тринатрийпитрат ·2Н2О	примерно 3,0 мг
вода	1 мл
вода для инъекций	1 мл

Действующее вещество в 1 мл воды титруют с помощью тринатрийцитрата ·2Н₂О до значения рН 6,0. Затем добавляют маннит и раствор подвергают лиофилизации и заполняют лиофилизатом пузырек.

Пример 4: Ампула, содержащая действующее вещество, например, пентагидрат динатрийпамидроната, растворенное в воде. После разбавления получают раствор (концентрация 3 мг/мл) для внутривенной инфузии.

Состав:

действующее вещество (≅5 мг безводного действующего вещества)	19,73 мг
маннит	250 мг
вода для инъекций	5 мл

Пример 5: Лечение пациентов

Несколько пациентов, страдающих раком и связанными с ним метастазами, и одного пациента, страдающего остеоартритом, лечат с помощью инфузий бисфосфоната внутриартериально через артерии, которые подходят в местам, пораженным раком, метастазами или остеоартритом. Места, пораженные раком, метастазами или остеоартритом, оценивают с помощью стандартных ангиографических методов как до, так и после инфузий бисфосфоната. Во всех случаях обнаружено выраженное эмболическое действие на вновь образованные капилляры и другие кровеносные сосуды в области, пораженной болезнью. Режимы лечения более подробно описаны ниже.

I) Пациент ID: 1676 15

Пол: женский

Возраст: 68 лет 6 мес.

Диагноз: рак молочной железы, множественные метастазы в легкое

Пути введения терапевтического агента: билатеральные бронхиальные артерии.

Всего 75 мг динатрийпамидроната (Aredia®) вводят путем инфузий в билатеральные бронхиальные артерии с целью облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли. На фиг.1 и 2 приведены ангиограммы левой (фиг.1) и правой (фиг.2) легочных артерий до (а) и после 25 (б) лечения.

II) Пациент ID: 2022

Пол: женский

Возраст: 57 лет 1 мес.

Диагноз: рак молочной железы, метастазы в костную ткань, множественные метастазы в легкое

Пути введения терапевтического агента:

1. билатеральные наиболее высоко расположенные межреберные артерии вплоть до 12-ой межреберной артерии

2. билатеральные межреберные артерии

3. латеральная внутренняя грудная артерия

4. vr. латеральная грудная артерия.

Всего 75 мг динатрийпамидроната (Aredia®), 100 мг этопозида, 10 мг BLM и 500 мг импра в виде липродола используют для облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли, которые расположены вдоль указанных путей введения (для метастазов в костную ткань используют только памидронат).

III) Пациент ID: 1441

Пол: женский

Возраст: 63 года 11 мес.

Диагноз: рак молочной железы, множественные метастазы в костную ткань, множественные метастазы в печень

Пути введения терапевтического агента:

1. билатеральные запирательные артерии

2. билатеральные поясничные артерии от L 4/5 до L1

3. правые печеночные s 6, 7, 8 субергеменальные печеночные артерии.

Всего 45 мг динатрийпамидроната (Aredia®), 100 мг ADM (для печени) и 25 500 мг импра в виде эмульсии липродола используют для облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли, которые расположены вдоль указанных путей введения (для метастазов в костную ткань используют только 45 мг памидроната, а для метастазов в печень дополнительно применяют 10 мг ADM с 500 мг импра в виде липродола).

IV) Пациент ID: 1840

Пол: мужской

Возраст: 43 года 11 мес.

Диагноз рак языка, coloteral vibo, метастазы в диафрагму

Пути введения терапевтического агента: 1. 7, 8, 9, 10 межреберные артерии

2. латеральная (It) ing. диафрагмальная артерия

3. It наиболее высоко расположенная межреберная артерия

4. It. подлопаточная артерия.

Всего 60 мг динатрийпамидроната (Aredia®) вводят путем инфузии в указанные выше артерии для облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли, которые расположены вдоль указанных путей введения

V) Пациент ID: 1835

Пол: женский

Возраст 34 года 8 мес.

Диагноз рак молочной железы, множественные метастазы в легкое, множественные метастазы в костную ткань, множественные метастазы в печень

Пути введения терапевтического агента: It. подвздошно-поясничная артерия, подвздошно-крестцовая артерия, латеральная крестцовая артерия, правая подвздошно-поясничная артерия, глубокие подвздошные orumgles артерии, билатеральная L4, латеральная L3, билатеральная L2 латеральные грудные артерии, правые грудные межреберные артерии, бронхиальная артерия, правая печеночная артерия.

Всего 90 мг динатрийпамидроната (Aredia®), 100 мг этопозида, 10 мг ADM, 6,0 СЕ ОК-432 и 500 мг импра в виде эмульсии липродола используют для облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли, которые расположены вдоль указанных путей введения.

VI) Пациент ID: 2013

Пол: женский

Возраст: 73 года 7 мес.

Диагноз: остеоартрит правого коленного сустава (причиной которого является ишемическое ангиогенное заболевание кости)

Пути введения терапевтического агента:

1. правая нисходящая коленная артерия

2. правая икроножная артерия.

Всего 30 мг динатрийпамидроната (Aredia®) используют для облитерации сосудов, обеспечивающих ангиогенное кровоснабжение, которые расположены вдоль указанных путей введения. Ангиограммы области правого коленного сустава приведены на фиг.3 до (а) и (б) после лечения.

VII) Пациент ID: 2026

Пол: женский

Возраст: 49 лет

Диагноз: рак молочной железы, грудного отдела костного мозга, метастазы в костную ткань

Пути введения терапевтического агента:

1. билатеральные наиболее высоко расположенные межреберные артерии

2. билатеральные 1-4 поясничные артерии

3. срединная крестцовая артерия.

Всего 30 мг динатрийпамидроната (Aredia®) вводят путем инфузии в сосуды, обеспечивающие кровоснабжение опухоли, с целью их облитерации.

VIII) Пациент ID: 1985

Пол: женский

Возраст: 49 лет 8 мес.

Диагноз: рак молочной железы, множественные метастазы в костную ткань после ВСТ

Пути введения терапевтического агента:

1. билатеральные наиболее высоко расположенные межреберные артерии вплоть до 12-ой межреберной артерии

2. билатеральные поясничные артерии (L1-L4)

3. срединная крестцовая артерия.

Всего 90 мг динатрийпамидроната (Aredia®) используют для облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли, которые расположены вдоль указанных путей введения.

IX) Пациент ID: 1063

Пол: мужской

Возраст: 80 лет 10 мес.

Диагноз: рак легкого, рак чешуйчатых клеток

Пути введения терапевтического агента:

1. правая наиболее высоко расположенная межреберная артерия

2. общий ствол билатеральных бронхиальных артерий.

Всего 45 мг динатрийпамидроната (Aredia®) вводят путем однократной инфузии в опухоль с целью облитерации сосудов, обеспечивающих кровоснабжение опухоли.

Пример 6: Воздействие золедроновой кислоты на ангиогенез, индуцируемый насыщением фактором роста, который вводят мышам с помощью подкожных имплантатов

Методы

Животные

Используют самок мышей (линии Tiflbm:MAG) весом 17-20 г. Их метят с помощью ушного клейма и разделяют на группы (6 животных на клетку), которые содержат в нормальных условиях и ежедневно обследуют. В каждом эксперименте для каждой обработки используют по 6 мышей. Все эксперименты осуществляют по меньшей мере дважды.

Подготовка камеры

Применяют перфорированные камеры из пористой ткани типа перфторалкокси-тефлон (Teflon®-PFA) 21 мм (высота) × 8 мм (диаметр), объемом 550 мкл, на которых находятся 80 правильно расположенных отверстий диаметром 0,88 мм. Оба конца закрывают крышками из этого же материала, которые могут быть сняты. 4-6 камер вносят в силиконовую трубку (диаметром 12 мм). Затем оба конца трубки запечатывают силоксановым каучуком и через 24 ч содержащую камеры трубку стерилизуют автоклавированием (121°С, 15 мин).

Факторы роста

Камеры, все еще находящиеся внутри силиконовой трубки, заполняют (общий объем 0,5 мл) в стерильных условиях 0,8%-ным (мас./об.) агаром (BRL® №11849, фирма Becton Dickinson, Meylan, Франция), который содержит 20 ед./мл гепарина (Novo Nordisk, A/S, 28800, Bagsvaerd, Дания) с добавлением фактора роста (человеческий VEGF (2 мкг/мл) или человеческий bFGF (0,3 15 мкг/мл) или без фактора роста. Перед процедурой заполнения раствор агара выдерживают при 42°С.

Имплантация камер

Мышей анестезируют путем ингаляции 3%-ным изофлураном (Forene®, фирма Abbott AG, Хам, Щвейцария) в кислороде. Камеру имплантируют в 20 асептических условиях через небольшой разрез на спине животного. Разрез на спине закрывают зажимами для ран (Autoclip, 9 мм, фирма Clay Adams).

Удаление камер

Через 5 дней после имплантации животных анестезируют (3%-ным изофлураном) и умерщвляют с помощью высокой дозы пентобарбитона (210 25 мг/кг, внутрибрюшинно, Vetanarcol, фирма Veterinaria AG, Цюрих, Швейцария). После этого камеры вынимают из животного, васкуляризованную фиброзную ткань, которая образовалась вокруг каждого имплантата, осторожно удаляют, взвешивают и общее количество крови оценивают количественно путем колориметрического определения концентрации гемаглобина.

Количественная оценка ангиогенной реакции

После добавления 2 мл дистиллированной воды образцы ткани гомогенизируют в течение 1 мин при 24000 об/мин (Ultra Turrax T25). Затем образцы центрифугируют в течение 1 ч при 7000 об/мин. Супернатант фильтруют через GHP-фильтрующий шприц с размером пор 0,45 мкм (Acrodisc® GF, фирма Gelman Sciencec, Анн Арбор, штат Мичиген, США) для того, чтобы избежать загрязнения жиром. Количество гемаглобина, присутствующего в фильтрате, определяют путем спектрофотометрического анализа при длине волны 540 нм с помощью набора реагентов Драбкина (Drabkin) (Sigma haemoglobin №525, фирма Sigma Chemical Co. Ltd., Пул, Дорсет, Великобритания). Аликвоту фильтрата (100 мкл) добавляют к 1 мл раствора реагентов Драбкина и смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Абсорбция при 540 нм (Uvikon 810 Р) пропорциональна концентрации гемаглобина. Затем на основе результатов, полученных для гемаглобина, определяют объем крови (мкл) с помощью калибровочной кривой, предварительно полученной с использованием образцов разных объемов цельной крови, взятых у мыши-донора.

Обработка лекарственным средством

Введение золедроновой кислоты начинают за 1 день до имплантации камер и камеры удаляют через 24 ч после введения последней дозы через 5 дней после имплантации. Животных содержат отдельными группами на протяжение всего эксперимента. Золедроновую кислоту вводят в дозах 1, 10 и 100 мкг/кг/день подкожно (объем дозы 25 мл/кг) с помощью инъекции поочередно в различные места. Соединение сначала растворяют в дистиллированной воде и затем разводят дистиллированной водой, содержащей маннит (конечная концентрация маннита 5%). Контрольным животным вводят только носитель. Каждый эксперимент осуществляют по меньшей мере дважды и затем данные объединяют для конечной оценки.

Обработка результатов и статистический анализ

Процент ингибирования ангиогенной реакции (возрастание массы ткани или общей крови) рассчитывают для каждого животного следующим образом:

(А-Б)/(В-Г) × 100, где

А обозначает массу ткани (или объем крови), полученной из обработанной лекарственным средством мыши, которой была имплантирована камера, содержащая фактор роста.

Б обозначает среднюю массу ткани (или объем крови), полученной из группы обработанных лекарственным средством мышей, которым были имплантированы камеры, не содержащие фактор роста.

В обозначает среднюю массу ткани (или объем крови), полученной из группы обработанных носителем мышей, которым были имплантированы камеры, содержащие фактор роста.

Г обозначает среднюю исходную массу ткани (или объем крови), полученной из группы обработанных носителем мышей, которым были имплантированы камеры, не содержащие фактор роста.

Статистический сравнительный анализ групп (обработанных соединением по сравнению с необработанными животными) осуществляют для абсолютных значений массы ткани и объема крови с помощью критерия Манна-Уитни упорядоченных сумм (программное обеспечение SigmaStat 2.0, фирма Jandel Scientific, Германия). Уровень значимости р<0,05.

Результаты

Золедроновая кислота в зависимости от дозы ингибирует ангиогенную реакцию, индуцированную bFGF, при оценке по массе и содержанию крови, при этом примерные значения IC₅₀ составляют 2,5 и 3,1 мкг/кг соответственно. При использовании наиболее высокой из изученных доз (100 мкг/кг/день) выявлено 20 выраженное ингибирование индуцированного VEGF повышения содержания крови, но не выявлено ингибирование массы ткани.

Эти исследования демонстрируют, что золедроновая кислота ингибирует индуцированный bFGF ангиогенез, но не индуцированный VEGF ангиогенез, в диапазоне доз, которые обладают терапевтическим действием на обновление кости, при некоторых болезнях, смоделированных с помощью животных. Также установлено, что более высокие дозы частично ингибируют реакцию на VEGF. Таким образом, золедроновая кислота, вероятно, обладает определенной селективностью в отношении ингибирования опосредуемой bFGF реакции.

Пример 7: Воздействие золедроната на пролиферацию и миграцию клеток in vitro

Методы

Тестируемые соединения и растворы

Описанные в этом разделе эксперименты проводят с использованием гидратированной динатриевой соли золедроната. Маточные растворы золедроната (10 мМ) и ЭДТК (5 мМ) готовят в ЗФР. Затем маточные растворы разбавляют средой, оптимальной для каждой линии клеток. Клетки и условия культивирования клеток.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) получают из Promo Cell (фирма BioConcept AG, Аллшвил, Щвейцария). Применяемую в этом эксперименте линию клеток опухоли человека А431 (эпителиальная карционама) получают из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Роквилл, штат Мэриленд, США). Все линии клеток культивируют in vitro согласно рекомендациям поставщика.

Анализ пролиферации эндотелиальных клеток

Для оценки способности золедроната ингибировать функциональный ответ на VEGF используют анализ пролиферации эндотелиальных клеток, основанный на включении BrdU (бромдезоксиуридин) (Biotrac Cell Proliferation Elisa System V.2, фирма Amersham, Великобритания). Для оценки специфичности ответа также оценивают воздействия золедроната и ЭДТК (в качестве контроля для оценки ион-хелатирующих воздействий золедроната) на пролиферацию HUVEC, вызванную bPGF и сывороткой. Клетки HUVEC до достижения ими конфяюэнтности высевают с плотностью 5×10³ клеток на лунку в 96-луночные планшеты, покрытые 1,5%-ным желатином, и затем инкубируют при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО₂ в среде для выращивая [среда для выращивания эндотелиальных клеток (Endothelial Cell Growth medium, PromoCell №C-22110, фирма BioConcept AG, Аллшвил, Щвейцария]. Через 24 ч среду для выращивания заменяют основной средой [основная среда для эндотелиальных клеток (Endothelial Cell Basal medium, PromoCell №C-22110, фирма BioConcept AG, Аллшвил, Щвейцария], которая содержит человеческий VEGF (10 нг/мл), bFGF (0,5 нг/мл) или 5% ФТС, в присутствии тестируемого соединения или без него. В качестве контроля в эксперименте также используют лунки, в которые не добавляют фактор роста. После инкубации в течение 24 ч добавляют раствор для мечения, содержащий BrdU, и клетки инкубируют в течение еще 24 ч перед фиксацией, блокадой и добавлением меченного с помощью пероксидазы антитела к BrdU. Затем связанное антитело выявляют с использованием в качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, что позволяет получить окрашенный реакционный продукт, содержание которого количественно определяют спектрофометрически при длине волны 450 нм.

Анализ пролиферации опухолевых клеток

Для дополнительной оценки специфичности золедроната и ЭДТК тестируют их воздействия на пролиферацию линии клеток опухоли человека (А431, эпителиальная карционама). Клетки высевают с плотностью 1,5×10³ клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубируют в течение ночи. Затем добавляют серийные разведения тестируемого соединения и планшеты инкубируют в течение 3 дней, после чего клетки фиксируют с помощью 3,3 об.%-ного глутарового альдегида, промывают водой и окрашивают 0,05%-ным (мас./об.) метиленовым синим. После промывки краситель элюируют с помощью 3 об.%-ного раствора HCl и оптическую плотность оценивают при 66515 нм с помощью спектрофотометра типа Dynatech 7000. Процент снижения роста клеток, обработанных соединением, по сравнению с контролем определяют с помощью компьютерной системы из уравнения: (ОП_тест. -О_исход.)/ОП_контр. -ОП_исход)×100. Значения IC₅₀ определяют как концентрацию лекарства, обеспечивающую 50%-ное снижение количества клеток на лунку по сравнению с контрольными культурами (100%) в конце периода инкубации.

Анализ миграции эндотелиальных клеток

Для оценки способности золедроната ингибировать функциональный ответ на VEGF используют анализ миграции эндотелиальных клеток. Планшеты (24-луночные) покрывают 1,5%-ным желатином и устанавливают кольцевые ограждения в качестве барьера, препятствующего выращиванию клеток в центре лунки. Клетки HUVEC до достижения ими конфлюэнтности высевают во внешнюю область с плотностью 1×10⁵ клеток на лунку и затем инкубируют при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО₂ в среде для выращивая [среда для выращивания эндотелиальных клеток (Endothelial Cell Growth medium, PromoCell №C-22110, фирма BioConcept AG, Аллшвил, Щвейцария]. Через 24 ч ограждения удаляют и среду для выращивания заменяют основной средой [основная среда для эндотелиальных клеток (Endothelial Cell Basal medium, PromoCell №С-22110, фирма BioConcept AG, Аллшвил, Швейцария], которая содержит человеческий VEGF₁₆₅ (10 нг/мл) или 5% ФТС, в присутствии тестируемого соединения или без него. Для ингибирования пролиферации клеток добавляют 50 мкг/мл фторурацил (фирма Roche, Базель, Швейцария). В качестве контроля также инкубируют лунки без фактора роста. После инкубации в течение 60-70 ч клетки фиксируют и окрашивают с использованием Diif-Quik (фирма Dade Behring AG, №130832, Дюдинген, Швейцария). 24-луночные планшеты помещают под бинокулярный микроскоп и подсчитывают количество мигрировавших клеток с помощью программы KS-400 (фирма Carl Zeiss Jena Йена, Германия) и специально разработанного макроса (migration.mcr).

Статистическая обработка

Данные анализируют с помощью однонаправленного анализа среднего отклонения с использованием критерия Дуннетта с целью определения достоверности различий между группами, обработанными золедронатом или ЭДТК, и контрольной группой. Критерий Бонферрони используют для оценки достоверности различий между каждой парой групп, обработанных определенной концентрацией золедроната и ЭДТК. Все анализы проводят с помощью программного обеспечения Instat® (фирма GraphPad Inc., Сан-Диего, США).

Результаты

Золедронат ингибирует в зависимости от дозы вызванную сывороткой пролиферацию HUVEC, при этом значение IC₅₀ составляет 4,1±0,6 мкМ. Он также оказывает аналогичное действие на пролиферацию, вызванную VEGF (IC₅₀ - 6,9±0,4 мкМ) и bFGF (IC₅₀ - 4,2±0,4 мкМ). При более высоких концентрациях ингибирующее действие золедроната на пролиферацию существенно отличается от контроля. При использовании всех стимулирующих агентов изменения морфологии клеток было обнаружено только при применении наиболее высокой из изученных концентраций золедроната (30 мкМ).

В качестве контроля для хелатирующих двухвалентных катионов бисфосфонатов в параллельных экспериментах используют ЭДТК. ЭДТК в концентрации 30 мкМ ингибирует пролиферацию HUVEC, вызванную ФТС, VEGF и bFGF на 23,7, 55,6 и 49,5% соответственно. При использовании всех стимулирующих агентов воздействие ЭДТК оказалось ниже, чем золедроната, оно не достигало статистической значимости в отношении вызванной сывороткой пролиферации в изученном диапазоне концентраций, однако оказалось статистически значимым при стимуляции с помощью VEGF и bFGF при использовании концентрации ЭДТК 3 мкМ и выше. Для стимуляции с использованием сыворотки или bFGF ингибирующее действие золедроната оказалось значительно выше, чем ингибирующее действие ЭДТК в концентрации 3 мкМ и выше, однако при стимуляции с помощью VEGF достоверное различие обнаружено только при концентрации 30 мкМ.

Золедронат ингибирует пролиферацию линии клеток опухоли человека А431, при этом значение IC₅₀ составляет 1,35 мкМ. ЭДТК не оказывает заметного воздействия на пролиферацию клеток линии А432 в изученном диапазоне концентраций, хотя при концентрации 30 мкМ обнаружено небольшое ингибирование (8,8%).

Золедронат в концентрациях до 10 мкМ стимулирует миграцию HUVEC в основной среде, а также в среде, содержащей сыворотку или VEGF. При концентрации 30 мкМ миграция полностью ингибируется и наблюдается изменение морфологии клеток. ЭДТК не оказывает существенного воздействия на миграцию.

Эти результаты свидетельствуют о том, что золедронат ингибирует пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток, вызванную сывороткой, VEGF и bFGF.

1. Способ эмболического лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят эффективное количество бисфосфоната.

2. Способ по п.1, заключающийся в том, что проводят эмболическое лечение ангиогенеза у пациента, страдающего от воспаления, ишемии миокарда, ревматоидного артрита, остеоартрита и роста, инвазии или метастазов опухоли.

3. Способ по п.1, в котором бисфосфонат выбирают из следующих соединений, или их фармацевтически приемлемых солей, или их любых гидратов: 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота (памидроновая кислота), например пимидронат (APD); 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота, например диметил-APD; 4-амино-1-гироксибутан-1,1-дифосфоновая кислота (алендроновая кислота), например алендронат; 1-гидроксиэтилиденбисфосфоновая кислота, например этидронат; 1-гидрокси-3-(метилпентиламино)пропиленбисфосфоновая кислота, ибандроновая кислота, например ибандронат; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновая кислота, например аминогексил-ВР; 3-(N-метил-N-н-пентиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота, например метилпентил-APD(=ВМ 21.0955); 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1- дифосфоновая кислота; 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этан-1,1-дифосфоновая кислота (ризедроновая кислота), например резидронат, включая соли с N-метилпиридинием, например йодиды N-метилпиридиния, такие, как NE-10244 или NE-10446; 1-(4-хлорфенилтио)метан-1,1-дифосфоновая кислота (тилудроновая кислота), например тилудронат; 3-[N-(2-фенилтиоэтил)-N-метиламино]-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-дифосфоновая кислота, например ЕВ 1053 (фирма Leo); 1-(N-фениламинотиокарбонил)метан-1,1-дифосфоновая кислота, например FR 78844 (фирма Fujisawa); тетраэтиловый эфир 5-бензоил-3,4-дигидро-2Н-пиразол-3,3-дифосфоновой кислоты, например U-81581 (фирма Upjohn); 1-гидокси-2-(имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил)этан-1,1-дифосфоновая кислота, например YM 529, и 1,1-дихлорметан-1,1-дифосфоновая кислота (клодроновая кислота), например клодронат.

4. Способ по п.1, в котором бисфосфонат представляет собой памидроновую кислоту, или золедроновую кислоту, или ее фармацевтически приемлемую соль, или ее любой гидрат.

5. Способ по п.1, заключающийся в том, что эффективное количество бисфосфоната пациенту вводят внутриартериально.

6. Применение бисфосфоната для эмболического лечения ангиогенеза.

7. Применение по п.6 для эмболического лечения ангиогенеза у пациента, страдающего от воспаления, ишемии миокарда, ревматоидного артрита, остеоартрита и роста, инвазии или метастазов опухоли.

8. Применение по п.6, в котором бисфосфонат выбирают из следующих соединений, или их фармацевтически приемлемых солей, или их любых гидратов: 3-амино-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота (памидроновая кислота), например пимидронат (APD); 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота, например диметил-APD; 4-амино-1-гироксибутан-1,1-дифосфоновая кислота (алендроновая кислота), например алендронат; 1- гидроксиэтилиденбисфосфоновая кислота, например этидронат; 1 -гидрокси-3-(метилпентиламино)пропиленбисфосфоновая кислота, ибандроновая кислота, например ибандронат; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновая кислота, например аминогексил-ВР; 3-(N-метил-N-н-пентиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота, например метилпентил-APD (=ВМ 21.0955); 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислота; 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этан-1,1-дифосфоновая кислота (ризедроновая кислота), например ризедронат, включая соли с N-метилпиридинием, например йодиды N-метилпиридиния, такие, как NE-10244 или NE-10446; 1-(4-хлорфенилтио)метан-1,1-дифосфоновая кислота (тилудроновая кислота), например тилудронат; 3-[Н-(2-фенилтиоэтил)-N-метиламино]-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновая кислота; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-дифосфоновая кислота, например ЕВ 1053 (фирма Leo); 1-(N-фениламинотиокарбонил)метан-1,1-дифосфоновая кислота, например FR 78844 (фирма Fujisawa); тетраэтиловый эфир 5-бензоил-3,4-дигидро-2Н-пиразол-3,3-дифосфоновой кислоты, например U-81581 (фирма Upjohn); 1-гидрокси-2-(имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил)этан-1,1-дифосфоновая кислота, например YM 529, и 1,1-дихлорметан-1,1-дифосфоновая кислота (клодроновая кислота), например клодронат.

9. Применение по п.6, где бисфосфонат представляет собой памидроновую кислоту, или золедроновую кислоту, или ее фармацевтически приемлемую соль, или ее любой гидрат.

10. Способ профилактического или превентивного эмболического лечения ангиогенеза у пациента, который нуждается в таком лечении, заключающийся в том, что пациенту вводят эффективное количество бисфосфоната.