Способ диагностики туберкулеза животных

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики туберкулеза животных. Лабораторным животным вводят суспензию биоматериала полученного от убитых с диагностической целью животных. Осуществляют наблюдение в течение месяца за ними и инокуляции через 30-35 дней после введения суспензии ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 0,8-1 мл внутрибрюшинно. Гибель лабораторного животного свидетельствует о наличии туберкулеза. Способ позволяет повысить эффективность диагностики туберкулеза животных. 3 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технике диагностики туберкулеза, и может быть использовано в животноводстве, для диагностики заболеваемости туберкулезом крупного рогатого скота.

Известен метод биологической пробы для обнаружения микобактерий туберкулеза в используемом материале (см. Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных, М., 1992 г.). Биопробу проводят на животных, не реагирующих на введения туберкулина. Для постановки биопробы берут трех морских свинок массой 300-500 г. Взвесь материала использованного для посевов на питательные среды вводят морским свинкам в дозе 1-2 мл подкожно в области паха. За животными ведут наблюдение в течение трех месяцев. При гибели морских свинок в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов и паталогоанатомическое исследование. При отсутствии падежа свинок убивают через три месяца после заражения, также проводят паталогоанатомическое исследование. Заключение дают по результатам вскрытия животного и бактериоскопии мазков.

Однако общепринятый метод длительный (продолжительность его три месяца).

Задачей изобретения является повышение эффективности диагностики, которая решается путем разработки методики ускоренной биологической пробы, заключающейся в следующем: суспензию биоматериала от убитых с диагностической целью животных используют для посева на питательные среды и вводят подкожно двум морским свинкам в дозе 1-2 мл суспензии. Через 30 дней после инокуляции биоматериала подопытным морским свинкам внутрибрюшинно вводят 0.8-1 мл стандартного раствора ППД туберкулина для млекопитающих (50000 МЕ). Павших морских свинок в течение суток вскрывают и проводят паталогоанатомическое исследование. При обнаружении на вскрытии характерных для туберкулеза поражений на внутренних органах и лимфатических узлах хотя бы у одной свинки диагноз на туберкулез считают установленным.

Способ отличается тем, что через 30 дней после заражения лабораторным животным вводят ППД туберкулин в дозе 0.8-1 мл внутрибрюшинно.

Теоретическим обоснованием ускоренного метода постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулеза животных явилось уникальное свойство феномена Коха, обуславливающего повышенную чувствительность организма к повторному введению микобактерий туберкулеза или их продуктов. Р.Кох (1891) обнаружил, что «нормальным» морским свинкам можно вводить значительные дозы туберкулина, не вызывая у них заметных симптомов. Туберкулезные морские свинки, наоборот, очень характерным образом реагируют на сравнительно небольшие дозы». Этот вывод Коха явился основополагающим в трактовке явления инфекционной аллергии при туберкулезе.

Далее Кох нашел, что большие дозы туберкулина могут убить больных туберкулезом морских свинок. Это явление в дальнейшем стало трактоваться как анафилактическая чувствительность к туберкулину (Е. Baedvin, 1910; Н.Corperezae, 1945).

Пример №1. Постановка биологической пробы.

В параллельных биологических пробах использовали по две морские свинки массой 300-350 г. Всего проведено 40 биопроб (по 20 для каждого метода) на 80 морских свинках.

Для постановки биопробы готовили суспензию биоматериала от крупного рогатого скота из лимфатических узлов (подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные, предлопаточные, портальный, мезентерельные и др.) и кусочков паренхиматозных органов (легкие, печень, почки).

При постановке биологических проб предлагаемым методом регистрировали гибель лабораторных животных вследствие анафилактического туберкулинового шока (через 30 дней) внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих после заражения. Кроме того, учитывали гибель морских свинок в другие сроки - до, между и после введения разрешающей дозы туберкулина.

В параллельных контрольных биологических пробах, проводимых традиционным методом, учитывали сроки гибели лабораторных животных без воспроизведения анафилактического туберкулинового шока.

Результаты исследований выявили следующие сравнительные характеристики предлагаемого и традиционного методов постановки биологической пробы при туберкулезе животных на морских свинках.

При постановке биопробы предлагаемым нами методом анафилактический туберкулиновый шок с гибелью в течение суток через 30 дней после введения биоматериала (лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота). С учетом того что из 20 биологических проб, поставленных предлагаемым методом, был зарегистрирован падеж одновременно обеих морских свинок (3 случая), диагноз на туберкулез был установлен в 12 пробах биоматериала уже через 30 дней, что составляет 60%.

Среднее время гибели морских свинок по общепринятой методике составило 50,8±3,5 дня. С учетом первичного срока гибели лабораторных животных на всем протяжении постановки биологических проб разработанным нами методом средняя продолжительность постановки диагноза на туберкулез составила 35,3±2,0 дня (табл.1).

Таблица 1 Сравнительная характеристика ускоренного и традиционного методов постановки биологической пробы в диагностике туберкулеза на морских свинках
Хозяйство	Ускоренный метод	Традиционный метод	Сокращение срока постановки биопробы, дни
срок гибели морских свинок (дни)	сроки гибели морских свинок (дни)
Красный Октябрь	30	74	44
Пышкетское	42	69	27
Харламово	30	58	28
Харламово	40	45	5
Харламово	30	54	24
Первотаровское	46	70	24
Родина	30	55	25
Родина	49	72	23
Родина	30	77	47
Родина	46	61	25
Родина	30	75	45
Им. Мичурина	30	80	40
Им. Мичурина	30	42	12
Им. Мичурина	33	65/65*	32
Гигант	30	63	33
Еланское	30	52	22
Еланское	60	87	37
Крутогорское	30	64	34
Милоградовское	30	72	42
Россия	30	50	31
всего	706	1350	580
М±m	35,3±2,0	64,3±2,6	29,0±2,2

В параллельных (контрольных) биологических пробах срок гибели первой морской свинки колебался от 45 до 87 дней и составил в среднем 64,3±2,6 дня. При этом две свинки пали одновременно через 65 дней после заражения суспензией биоматериала. Срок гибели второй морской свинки наступал спустя 46-89 дней после заражения, или на 69,7±4,5 дни в среднем. На вскрытии всех павших свинок были обнаружены характерные для туберкулеза изменения. Продолжительность постановки диагноза при этом (традиционном) методе постановки биопробы определялся сроком гибели первой морской свинки.

Исходя из установленных показателей, разница в сроке постановки диагноза на туберкулез предлагаемым и традиционным официальным методами постановки биологических проб варьировала от 5 до 45 дней и составила в среднем 29,0±2,2 дня с высокой достоверностью (Р<0,05).

Таким образом, разработанный ускоренный метод постановки биологической пробы на морских свинках в 1,8 раза сокращает срок первичной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Пример №2.

Для определения оптимального срока внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих, при котором наступает анафилактический туберкулиновый шок и гибель морских свинок, зараженных возбудителем туберкулеза бычьего вида, провели специальный опыт, в котором использовали 21 морскую свинку, разделенных на семь групп (по 3 гол.) - пять опытных (15 гол.) и две контрольные (6 гол.).

Морских свинок всех опытных и первой контрольной групп заразили культурой возбудителя туберкулеза бычьего вида (полевой штамм 2, ВНИИБТЖ), интратестикулярно, в дозе 0,1 мг в 0,4 мл физиологического раствора.

Свинкам опытных групп ППД туберкулин для млекопитающих внутрибрюшинно в дозе 1 мл (летальная доза, установленная ранее в специальном опыте) вводили соответственно через 15, 20, 25, 30 и 35 дней после заражения. Животным первой контрольной группы (зараженные, 3 гол.) туберкулин внутрибрюшинно не вводили; второй контрольной (не зараженные) - инъецировали туберкулин в дозе 1 мл через 30 дней после заражения.

Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении туберкулина через 15 и 20 дней зараженные культурой возбудителя туберкулеза М. bovis морские свинки в течение суток не погибают (табл. 2).

Таблица 2 Оптимальный срок внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих зараженным М. bovis морским свинкам для воспроизведения анафилактического шока с летальным исходом
Группа	Кол-во свинок, голов	Заражение в дозе 1 мг (+, -)	Срок введения туберкулина после заражения, день	Гибель свинок в течение суток	Гибель свинок в последующие сроки, сутки
гол.	часы
1	3	+	15	-	-	35, 40, 42
2	3	+	20	-	-	38, 41, 44
3	3	+	25	1	21	33, 50
4	3	+	30	3	17-23	-
5	3	+	35	3	18-24	-
1к	3	+	-	-	-	37, 40, 41
2к	3	-	30	-	-	-

У лабораторных животных этих групп в дальнейшем гибель от туберкулеза наблюдали примерно в те же сроки, что и зараженных первой контрольной, туберкулин которым внутрибрюшинно не вводили, - через 45-58 дней.

Из трех свинок третьей опытной группы, туберкулин которым введен внутрибрюшинно через 25 дней после заражения культурой М. bovis, пала одна (33,3%) спустя 21 час.

Животные четвертой и пятой групп при введении туберкулина соответственно через 30 и 35 дней после заражения пали все (100%) через 17-24 часа.

Все морские свинки первой контрольной группы, туберкулин которым не вводили, пали при естественном развитии туберкулезного процесса соответственно через 49, 52 и 61 день после заражения.

Морские свинки второй контрольной группы (не зараженные), которым также внутрибрюшинно введен туберкулин в дозе 1 мл (50000 ME), остались живы во все сроки наблюдения.

Таким образом, исходя из результатов экспериментальных исследований, оптимальный срок внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих, при котором наступает анафилактический шок и гибель всех морских свинок, зараженных культурой возбудителя туберкулеза бычьего вида, составляет 30 дней.

Пример №3. Подбор дозы ППД туберкулина.

В опытах использовали 21 морскую свинку живой массой 300-350 г. Опыты ставили последовательно (по 3 гол.) до наступления гибели животных на введение нарастающих доз ППД туберкулина для млекопитающих.

Внутрибрюшинно туберкулин морским свинкам вводили следующим образом. Помощник держал животное головой вниз для смещения кишечника с целью предупреждения его травмы при введении иглы. Укол делали в нижней трети живота справа или слева от средней линии. При этом кожу брюшка зажимали двумя пальцами левой руки, оттягивали ее и приподнимали кверху. Иглу вводили ниже этого места в горизонтальном положении.

Результаты клинических наблюдений за опытными морскими свинками характеризовались следующими показателями. При дозе введения внутрибрюшинно 1 и 2 мл стандартного раствора ППД туберкулина для млекопитающих (соответственно 50000 и 100000 ME) в течение первого часа наблюдений состояние организма опытных животных было удовлетворительным, аппетит сохранялся, температура тела была в пределах нормы - 37-37,5°С. Аналогичную клиническую картину наблюдали и в последующие сроки - через восемь часов и через сутки.

На введение туберкулина в дозе 10 мл (500000 ME) через 10-25 минут наблюдали резкое угнетение морских свинок, отсутствие аппетита, тремор мышц в течение 20-30 минут и повышение температуры тела до 38,6-39°С. Аналогичные клинические признаки наблюдали в течение 3-4,5 часов. Через 5-6 часов после введения туберкулина состояние лабораторных животных приходило в норму, появлялся аппетит.

При введении туберкулина в дозе 20 мл (1000000 ME) с нарастающими признаками асфиксии пали все три опытные морские свинки соответственно через 5, 7 и 8 часов.

Трем свинкам седьмой контрольной группы вместо ППД туберкулина для млекопитающих внутрибрюшинно ввели по 20 мл физиологического раствора. При этом каких-либо отклонений в общем состоянии и температурной реакции не наблюдали.

Таким образом, результаты опыта свидетельствуют, что организм здоровых морских свинок (не зараженных М.bovis) обладает индифферентностью к ППД туберкулину для млекопитающих при внутрибрюшинном введении в дозах стандартного разведения до 5 мл (250000 ME). Летальная доза аллергена для них составляет 15-20 мл (750000-1000000 ME). Лабораторные животные при этом погибают от асфиксии. Все это позволило сделать заключение о возможности проведения дальнейших исследований по отработке регламента применения туберкулина ускоренной постановке биологической пробы при туберкулезе животных.

Для отработки оптимальной оттитрованной летальной дозы внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих, способной вызвать гибель зараженных возбудителем туберкулеза лабораторных животных, провели опыт на 30 морских свинках живой массой 300-350 г.

В предварительных исследованиях все морские свинки не реагировали на внутрикожное введение туберкулина в дозе 25 международных туберкулиновых единиц (ME) в объеме 0,1 мл.

Из животных сформировали шесть групп по пять голов. Свинки первых четырех групп (20 гол.) являлись опытными и двух (10 гол.) - контрольными.

Свинок четырех опытных и пятой контрольной групп заразили интратестикулярно культурой возбудителя туберкулеза бычьего вида (полевой штамм 14, ВНИИБТЖ) - в дозе 0,1 мг бактериальной массы в 0,4 мл физиологического раствора. Животных шестой группы не заражали (чистый контроль).

Через 30 дней все зараженные лабораторные животные 1-4-й групп и пятой контрольной на 24-м и 48-м часу дали реакцию на внутрикожное введение ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 25 ME в объеме 0,1 мл.

У зараженных морских свинок в месте введения аллергена (область брюшка) отмечали гиперемию кожи с образованием уплотненной припухлости диаметром 8-14 мм. У семи свинок (28%) наблюдали некротизированные участки в центре припухлости.

Всем животным 1-4-й опытных и шестой контрольной групп через 30 дней после заражения ввели внутрибрюшинно стандартный раствор ППД туберкулина для млекопитающих соответственно в дозах 0,2; 0,5; 0,8 и 1 мл, или 10000; 25000; 40000 и 500000 ME соответственно. Зараженным культурой возбудителя туберкулеза пяти свинкам пятой контрольной группы вместо туберкулина внутрибрюшинно ввели по 1 мл физиологического раствора.

Результаты эксперимента показали следующее. Все лабораторные животные при внутрибрюшинном введении 0,2 мл (10000 ME) ППД туберкулина для млекопитающих через 30 дней после заражения культурой М.bovis остались живы (табл. 3). Из второй опытной группы пала одна морская свинка (20%) через 46 часов после внутрибрюшинного введения туберкулина в дозе 0,5 мл (25000 ME), из третьей - три (60%) соответственно через 20; 23 и 25 часов.

Таблица 3 Летальные дозы внутрибрюшинного введения ППД туберкулина для млекопитающих морским свинкам, зараженным М. bovis
Группа	Кол-во, гол.	Результат туб. пробы после заражения	Доза Туберкулина	Пало через 30 дней	Туберкулез при убое, гол.
мл	ME	гол.	%
1	5	+	0,2	10000	-	0	5
2	5	+	0,5	25000	1	20	4
3	5	+	0,8	40000	3	60	2
4	5	+	1,0	50000	5	100	-
5к	5	+	-	-	1	20	4
6к	5	-	1,0	50000	-	-	-

Животные четвертой опытной группы, туберкулин которым ввели в дозе 1 мл (50000 ME), пали все (100%) в сроки от 18 до 26 часов (в среднем через 22,6±0,9 часа).

Из пяти зараженных М. bovis свинок пятой контрольной группы, туберкулин которым внутрибрюшинно не вводили, через 29 суток пала одна (20%), при вскрытии которой во внутренних органах (печень, легкие, почки) и лимфатических узлах наблюдали характерные для туберкулеза поражения миллиарного характера.

Из незараженных возбудителем туберкулеза свинок шестой контрольной группы, туберкулин которым ввели внутрибрюшинно в дозе 1 мл (50000 ME), гибели через 30 дней и в последующие сроки не отмечали.

При патологоанатомическом исследовании у всех убитых свинок во внутренних органах и лимфатических узлах отмечали различной степени поражения, характерные для туберкулеза. Следовательно, характер и тяжесть этих поражений были недостаточным для летального исхода лабораторных животных в указанный срок (без введения ППД туберкулина для млекопитающих в разрешающей дозе).

У свинок шестой контрольной группы (не зараженные культурой М. bovis) при убое видимых характерных для туберкулеза поражений внутренних органов и лимфатических узлов мы не нашли.

Клиническое наблюдение за лабораторными животными после внутрибрюшинного введения разрешающей дозы стандартного разведения ППД туберкулина для млекопитающих (1 мл, 50000 ME) доказывает, что уже через 15-20 минут морская свинка начинает проявлять признаки общего недомогания. Шерсть на голове и затылочной части шеи взъерошивается, свинка забивается в угол. В дальнейшем животное становится беспокойным, у него наблюдается одышка. Через 6-8 часов свинка начинает кашлять и потягиваться, передними конечностями трет мордочку. Дыхание, вначале учащенное, становится замедленным и затрудненным, свинка жадно ртом «ловит воздух», при этом вдох требует больших усилий, чем выдох. Слизистые оболочки становятся синюшными, наблюдается непроизвольное мочеиспускание и дефекация.

Таким образом, исходя из результатов опытов, оптимальной (разрешающей) дозой ППД туберкулина для млекопитающих, введенного внутрибрюшинно через 30 дней после заражения культурой возбудителя туберкулеза бычьего вида, вызывающего гибель всех морских свинок (100%), является доза 1 мл стандартного разведения аллергена, что составляет 50000 ME.

Способ диагностики туберкулеза животных, включающий введение лабораторным животным суспензии биоматериала, полученного от убитых с диагностической целью животных, наблюдение в течение месяца за ними, инокуляции через 30-35 дней после введения суспензии ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 0,8-1 мл внутрибрюшинно, при этом гибель лабораторного животного свидетельствует о наличии туберкулеза.