Способ воздействия на нейродегенеративное нарушение или нарушение миелинизации

Изобретение относится к области медицины, а именно фармакотерапии. Применяют пептид, содержащий аминокислотную последовательность Thr-R₁-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, где R₁ является D-аланином (SEQ ID N:2) для воздействия на нейродегенеративные нарушения и нарушения миелинизации. Для этого субъекту вводят эффективное количество этого пептида. Указанными нарушениями, при которых полезен заявляемый препарат, являются: полиневропатия, мононевропатия, неврома, сдавливание нерва, травма нерва, контузия, опухоль или неполное пересечение спинного мозга, инфаркт или травма стволового мозга, таламуса или коры головного мозга, сдавливание, разрыв или воспаление дорсальных корней ганглиев, постполиосиндром, травматическое или ишемическое нарушение центральной или периферической нервной системы, рассеянный склероз. Способ расширяет арсенал лекарственных средств для лечения расстройств, связанных с нарушением миелинизации и пациентов с нейродегенеративными нарушениями. 5 з.п. ф.лы. 6 табл., 3 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение, главным образом, относится к области терапии болезненных состояний и, более конкретно, к применению пептидов, являющихся производными просапозина, для лечения нейропатической боли.

Уровень техники

Нейропатическая боль является результатом повреждения нерва. В отличие от немедленно развивающейся боли, вызванной повреждением тканей, нейропатическая боль может развиваться в течение дней или месяцев после травматического повреждения. Кроме того, тогда как продолжительность боли, вызванной повреждением тканей, обычно ограничивается периодом восстановления ткани, нейропатическая боль зачастую является длительной или хронической. Более того, нейропатическая боль способна возникать спонтанно или как результат воздействия стимула, который в норме боли не вызывает.

Клинические причины нейропатической боли многочисленны и включают в себя как травму, так и заболевание. Например, травматическое сдавливание или размозжение нерва и травматическое повреждение головного мозга или спинного мозга являются обычными причинами нейропатической боли. Кроме того, большинство травматических повреждений нервов вызывает также развитие невров, в которых боль возникает в результате нарушенной регенерации нерва. В дополнение к этому, связанная со злокачественными опухолями нейропатическая боль возникает, когда в результате опухолевого роста сдавливаются находящиеся поблизости нервы, головной или спинной мозг. Нейропатическая боль также связана с такими заболеваниями, как сахарный диабет или алкоголизм.

К несчастью, нейропатическая боль зачастую оказывается устойчивой к проводимым доступным курсам медикаментозного лечения. В дополнение к этому, проводимые в настоящее время курсы лечения обладают серьезными побочными эффектами, включая, например, нарушения внимания (cognitive changes), седативный эффект, тошноту и, в случае наркотических средств, пристрастие. Многие пациенты, страдающие от нейропатических болей, являются пожилыми или страдают от иных патологических состояний, которые особенно ограничивают их толерантность к побочным эффектам, связанным с проведением доступных курсов медикаментозного лечения. Неспособность проводимых в настоящее время курсов лечения обеспечить ослабление нейропатической боли без вызывания непереносимых побочных эффектов зачастую проявляется в развитии депрессии и суицидальных наклонностей пациентов, страдающих хроническими болями.

Способы ослабления нейропатической боли улучшили бы качество жизни многих людей, страдающих болями, вызванными травмой или заболеванием. Однако в настоящее время не существует эффективных лекарственных средств, которые ослабляли бы нейропатичекую боль без вызывания нежелательных побочных эффектов, таких как седативный эффект и пристрастие. Таким образом, существует потребность в способах воздействия на нейропатическую боль без вызывания нежелательных побочных эффектов. Настоящее изобретение как удовлетворяет данную потребность, так и обеспечивает связанные с этим преимущества.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу воздействия на нейропатическую боль, приводящему к облегчению этой боли или к ее предотвращению у субъекта путем введения этому субъекту эффективного количества активного фрагмента просапозина. Более конкретно данное изобретение относится к способу воздействия на нейродегенеративные нарушения и нарушения миелинизации у субъекта путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептида, содержащего аминокислотную последовательность Thr-R₁-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, где R₁ является D-аланином (SEQ ID N:2).

Указанными нарушениями, при которых полезен заявляемый способ, являются: полиневропатия, мононевропатия, неврома, сдавливание нерва, травма нерва, контузия, опухоль или неполное пересечение спинного мозга, инфаркт или травма стволового мозга, таламуса или коры головного мозга, сдавливание, разрыв или воспаление дорсальных корней ганглиев, постполиосиндром, травматическое или ишемическое нарушение центральной или периферической нервной системы, рассеянный склероз.

Примером полиневропатологии могут являться, в частности, диабетическая периферийная невропатология и периферийная невропатология, приобретенная в результате хемиотерапии.

Предпочтительно указанные выше нарушения являются ишемическими нарушениями в центральной или периферической нервной системе.

В качестве пути введения пептида может быть использовано внутривенное, внутримышечное, внутрикожный, подкожный, интракраниальный, в цереброспинальную жидкость, местный, пероральный, чрескожный трансмукозальный или интраназальный пути.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показан порог тактильной allodynia до (время 0) и по прошествии различных сроков после болюсного введения 22-мерного пептида, являющегося производным просапозина (ПОСЛ. ИД. №1), в модели Chung на крысах.

На Фигуре 2 показан порог тактильной allodynia до (время 0) и по прошествии различных сроков после болюсного введения 14-мерного пептида, являющегося производным просапозина (ПОСЛ. ИД. №2), в модели Chung на крысах.

На Фигуре 3 показаны суммарные реакции на 0,5% формалин после внутрибрюшинного введения 14-мерного пептида, являющегося производным просапозина (ПОСЛ. ИД. №2), или физиологического раствора крысам, страдающим сахарным диабетом.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу воздействия на нейропатическую боль у субъекта путем введения нуждающемуся субъекту эффективного количества активного фрагмента просапозина. Как описано здесь, способ по данному изобретению позволяет облегчать нейропатическую боль у субъекта в течение 30 минут после введения. Такой способ применим для облегчения нейропатической боли, являющейся следствием заболевания периферического нерва, спинно-мозговых ганглиев, спинного мозга, ствола мозга, талямуса или коры.

Пептид, применимый в данном изобретении, является производным просапозина, который представляет собой белок, состоящий из 517 аминокислот, первоначально идентифицированный как предшественник четырех сфинголипид-активирующих белков (Kishimoto et al., J. Lipid Res., 33:1255-1267 (1992)). В лизосомах четыре смежных тандемных домена просапозина подвергаются протеолитическому процессингу с образованием сапозинов А, В, С и D, которые активируют гидролиз гликосфинголипидов лизосомальными гидролазами (O'Brien and Kishimoto, FASEB J., 5:301-308 (1991)).

Непроцессированная форма просапозина обнаружена в высоких концентрациях в головном мозге человека и крысы, где она локализуется в поверхностных мембранах нейронов. В период эмбрионального развития мРНК, кодирующая просапозин, в больших количествах присутствует в головном мозге и спинно-мозговых ганглиях. Кроме того, просапозин с высоким сродством связывается с ганглиозидами, которые стимулируют рост нейритов, и облегчает транспорт ганглиозидов из мицелл в мембраны.

Нейротрофная активность просапозина согласуется с его локализацией в популяциях нейронов (O'Brien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9593-9596 (1994); Sano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204:994-1000 (1994)). Просапозин стимулирует рост двигательных нейритов in vitro и in vivo и увеличивает активность холин-ацетилтрансферазы, которая является маркером дифференцировки нейронов. В дополнение к этому, просапозин предотвращает клеточную гибель среди нейробластомных клеток (O'Brien et al., supra, 1994; O'Brien et al., FASEB J., 9:681-685 (1995)).

Нейротрофную активность просапозина приписывают сапозину С, домену из 80 аминокислот. 22-Мерный пептид, соответствующий аминокислотам (с 8 по 29) домена сапозина С (ПОСЛ. ИД. №1), стимулирует рост нейритов и активность холин-ацетилтрансферазы и предотвращает клеточную гибель среди нейробластомных клеток (O'Brien et al., supra, 1995).

Просапозин или производный от просапозина 22-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №1), например, способен влиять на функционирование нейрона посредством стимулирования роста нейронов. Однако до настоящего изобретения не было известно, способен ли просапозин или пептидный фрагмент просапозина влиять на функционирование сенсорных нейронов. Более того, нейротрофная активность просапозина или производного от просапозина пептида в стимулировании роста двигательных нейритов становится очевидной лишь по прошествии от 24 до 48 часов (см., например, O'Brien et al., supra, 1994). Нейротрофная активность просапозина или производного от просапозина пептида в течение предшествующего периода времени продемонстрирована не была.

Напротив, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения нейропатической боли, которая включает как сенсорный, так и двигательный нейрональный компоненты. Кроме того, способ по данному изобретению является эффективным для облегчения нейропатической боли через минуты, в отличие от часов или суток, которые, как было ранее продемонстрировано, требуются для проявления нейротнофной активности просапозина или производного от просапозина пептида. Эффективность способа по данному изобретению в облегчении нейропатической боли была продемонстрирована с применением хорошо известной модели Chung периферической невропатии на крысах. В модели Chung на крысах частичная перевязка левых спинно-мозговых нервов на уровне L-5 и L-6 приводит к стойкой гиперчувствительности к легкому давлению на затронутую левую заднюю конечность. Гиперчувствительность является сходной с болью, испытываемой людьми, страдающими невропатическим состоянием каузалгией, как описано в Kirn and Chung, Pain 50:355-36 3 (1992).

До введения активного фрагмента просапозина крысы в модели Chung имели порог от 3,0 до 4,0 г до того, как затронутая конечность была отдернута в ответ на давление (волоски Von Frey) (см. Фигуру 1). После введения активного фрагмента просапозина (производного от просапозина 22-мерного; ПОСЛ. ИД. №:1) нейропатическая боль облегчалась, что заметно по большей толерантности к давлению до того, как затронутая конечность была отдернута. Эффект активного фрагмента просапозина возникал в течение 15 минут и поддерживался в течение 3 часов после введения, как показано на Фигуре 1. Данное быстрое облегчение нейропатической боли сходится в полной противоположности с отсроченными нейротрофными эффектами, ранее описанными для просапозина и пептидов, являющихся производными просапозина.

Введение активного фрагмента просапозина, такого как производный от просапозина пептид ПОСЛ. ИД. №:2, также облегчало боль в модели на крысах, страдающих болезненной диабетической невропатией. Как описано в Примере III, введение пептида ПОСЛ. ИД. №:2 снижало allodynia у крыс, страдающих кратковременным (преходящим) инсулинзависимым сахарным диабетом, вызванным избирательным токсином, тропным к β-клеткам, стрептозотоцином. Таким образом, активный фрагмент просапозина или производный от просапозина пептид по данному изобретению может быть применен для облегчения различных типов нейропатической боли, включая механическую боль, примером чего является модель Chung на крысах, и метаболическую боль, что проиллюстрировано с помощью применения данных пептидов для облегчения боли у крыс, страдающих диабетом.

Как здесь используется, термин "нейропатическая боль" означает боль, являющуюся результатом повреждения нерва. Нейропатическую боль отличают от ноцицептивной боли, которая представляет собой боль, вызванную острым повреждением тканей, включающих в себя небольшие кожные нервы или небольшие нервы, иннервирующие мышечную или соединительную ткань. Боль, задействующая ноцицептивный механизм, обычно ограничена по длительности периодом восстановления ткани и обычно облегчается с помощью применения доступных анальгетиков или опиоидов, как описано в Myers, Regional Anesthesia 20:173-184 (1995).

Нейропатическая боль обычно является длительной или хронической и зачастую развивается в течение дней или месяцев после исходного острого повреждения тканей. Нейропатическая боль способна включать персистирующую спонтанную боль, равно как и allodynia, которая представляет собой болезненную реакцию на воздействие стимула, который в норме боли не вызывает. Нейропатическая боль также может быть охарактеризована гиперальгезией, при которой существует выраженная реакция на болезненный стимул, который обычно является незначительным, такой как укол булавкой. В отличие от ноцицептивной боли нейропатическая боль обычно устойчива к терапии опиоидами (Myers, supra, 1995).

Способ по данному изобретению применим для облегчения нейропатической боли, являющейся следствием заболевания периферического нерва, спинно-мозговых ганглиев, спинного мозга, ствола мозга, талямуса или коры. Как здесь используется, термин "заболевание" означает любую травму, повреждение, болезнь или состояние, приводящее к возникновению нейропатической боли.

Способ по данному изобретению применим для облегчения нейропатической боли невзирая на этиологию боли. Например, способ по данному изобретению может быть применен для облегчения нейропатической боли, являющейся следствием заболевания периферического нерва, такого как неврома; сдавления нерва; размозжения нерва, растяжения нерва или неполного пересечения нерва; мононевропатии или полиневропатии. Способ по данному изобретению также может быть применен для облегчения нейропатической боли, являющейся следствием такого заболевания, как сдавление спинно-мозгового ганглия; воспаление спинного мозга; ушиб, опухоль или гемисекция спинного мозга; опухоли ствола головного мозга, талямуса или коры; или травмы ствола головного мозга, талямуса или коры (см., например, Таблицу 1).

Способ по данному изобретению может быть применим, например, для облегчения нейропатической боли, являющейся следствием невромы, которая вполне может развиться после травматического повреждения нерва, особенно когда целый нерв серьезно размозжен либо пересечен. В невроме рост нейритов, который в норме регенерирует периферический нерв, является нарушенным и неправильно направленным благодаря, например, наличию физического препятствия, такого как рубцовая ткань. Таким образом, регенерирующееся нервное волокно находится в окружении, в котором механические и физические факторы способствуют возникновению аномальной электрофизиологической активности и боли (Myers, supra, 1995). Ампутационная неврома, например, способна вызывать фантомные боли либо способна вызывать боль, запускаемую при применении протеза конечности. Как описано здесь, такая нейропатическая боль может быть облегчена путем введения активного фрагмента просапозина по методу данного изобретения.

Таблица 1.

Нерв Неврома (ампутация, пересечение нерва) Сдавление нерва (невропатии ущемления, опухоли) Размозжение, растяжение или неполное пересечение нерва (травма) Мононевропатия Сахарный диабет Облучение Ишемия Васкулит Полиневропатия Постполиомиелитический синдром Сахарный диабет Алкоголь Амилоид Токсины ВИЧ Гипотиреоидизм Уремия Витаминные недостаточности Химиотерапия (винкристин, цисплатин, паслитаксел) ddC (залцитабин) Болезнь Фабри

Спинномозговой ганглий Сдавление (диск, опухоль, рубцовая ткань) Авульсия корешка

Воспаление (постгерпетическая невралгия)

Спинной мозг Ушиб Опухоль Неполное пересечение

Ствол головного мозга, талямус, кора Инфаркт, опухоли, травма

Сдавление нерва также приводит к возникновению нейропатической боли, которую можно лечить, применяя способ по данному изобретению. Сдавление нерва может быть резким, как в случае с травматическим размозжением нерва, либо длительным и умеренно выраженным, вторичным по отношению к росту опухоли или образованию рубца вблизи от основного нервного пучка. Компрессионная невропатология может развиваться как следствие изменений кровоснабжения нерва, вызывая тяжелую ишемию и последующее повреждение (Myers, supra, 1995).

Введение активного фрагмента просапозина в соответствии со способом по данному изобретению также способно облегчить нейропатическую боль, являющуюся результатом мононевропатии или полиневропатии. Как здесь используется, невропатия представляет собой функциональное расстройство или патологическое изменение периферической нервной системы и клинически характеризуется дисфункцией сенсорного или двигательного нейрона. Термин "мононевропатия" указывает на то, что затронут единственный периферический нерв, тогда как термин "полиневропатия" указывает на то, что затронуто несколько периферических нервов.

Этиология невропатии может быть известна или неизвестна (см., например, Myers, supra, 1995; Galer, Neurology 45 (suppl 9):S17-S25 (1995); Stevens and Lowe, Pathology, Times Mirror International Publishers Limited, London (1995)). Известные этиологии включают осложнения заболевания или токсического состояния; например, наиболее распространенным метаболическим нарушением, вызывающим невропатию, является сахарный диабет. Применение способа по данному изобретению облегчает нейропатическую боль при мононевропатии, являющуюся результатом сахарного диабета, облучения, ишемии или васкулита. Применение способа по данному изобретению также облегчает нейропатическую боль при полиневропатии, являющейся результатом влияния постполиомиелоитического синдрома, сахарного диабета, алкоголя, амилоида, токсинов, ВИЧ, гипотиреоидизма, уремии, витаминных недостаточностей, химиотерапии, ddC или болезни Фабри (см. Таблицу 1). Способ по данному изобретению является особенно применимым для ослабления постполиомиелитической миалгии. Применение способа по данному изобретению также способно облегчить нейропатическую боль неизвестной этиологии.

Как описано здесь, активный фрагмент просапозина также может быть применен для облегчения нейропатической боли или для стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации или ингибирования демиелинизации или для ингибирования развития сенсорной (чувствительной) невропатии. Термин "активный фрагмент просапозина", как здесь используется, означает пептид, который обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности просапозина, и который обладает активностью облегчения нейропатической боли или с стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации или ингибирования демиелинизации или для ингибирования развития чувствительной или двигательной невропатии.

Как используется здесь, термин "облегчение нейропатической боли" означает уменьшение тяжести нейропатической боли. У субъекта-человека активный фрагмент просапозина уменьшает тяжесть нейропатической боли настолько, что страдания объекта уменьшаются и качество жизни улучшается. Применение активного фрагмента просапозина также может облегчить нейропатическую боль в любой из ряда хорошо известных животных моделей нейропатической боли, как описано здесь ниже (также см. Bennet, Muscle & Nerve, 16:1040-1048 (1993)). Как используется здесь, термин "активный фрагмент просапозина" является синонимом термина "производный от просапозина пептид".

Активный фрагмент просапозина предпочтительно содержит аминокислотную последовательность Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (ПОСЛ. ИД. №:3), которая соответствует аминокислотам (с 18 по 29) сапозина С. Более предпочтительно, активный фрагмент просапозина обладает аминокислотной последовательностью Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (ПОСЛ. ИД. №1), которая соответствует аминокислотам (с 8 по 29) сапозина С, или аминокислотной последовательностью Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr (ПОСЛ. ИД. №2), 17 которая соответствует аминокислотам (с 16 по 29) сапозина С, но которая модифицирована замещением лизина D-аланином в положении 2; замещением лизина аланином в положении 8; делецией лизина в положении 11 и добавлением С-концевого тирозинового остатка (см. Таблицу 2). Такие модификации могут быть применимы для повышения стойкости пептида или уровня проницаемости через гематоэнцефалический барьер, как описано ниже. Как здесь используется, D-аланин может быть представлен как D-Ala или X.

Активный фрагмент просапозина может содержать от приблизительно 12 аминокислот до приблизительно 80 аминокислот, что представляет собой полноцепочечный сапозин С. Предпочтительно активный фрагмент просапозина содержит от приблизительно 12 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот и более предпочтительно от приблизительно 14 аминокислот до приблизительно 22 аминокислот.

Таблица 2
Пептид	Последовательность	ПОСЛ. ид. №:
Производный от просапозина 22-мерный	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	1
Производный от просапозина 14-мерный	TXLIDNNATEEILY	2
Производный от просапозина 12-мерный	LIDNNKTEKEIL	3
где Х=D-аланин

Для применения в облегчении нейропатической боли у субъекта-человека предпочтительным является активный фрагмент человеческого просапозина, такой как ПОСЛ. ИД. №:1 и ПОСЛ. ИД. №:2. Однако активный фрагмент просапозина иного млекопитающего также является применимым для облегчения нейропатической боли в соответствии со способом по данному изобретению. Так, например, активный фрагмент мышиного просапозина, крысиного просапозина, просапозина морской свинки или бычьего просапозина, такой как ПОСЛ. ИД. №: с 4 по 7 включительно, также может быть применим для облегчения нейропатической боли у субъекта.

Как показано в Таблице 3, аминокислотная последовательность активного фрагмента человеческого просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1), которая соответствует аминокислотам (с 8 по 29) сапозина С, является высококонсервативной среди других видов. В частности, соседние аспарагиновые (N) остатки являются консервативными в просапозинах человека, мыши, крысы, морской свинки и быка. В дополнение к этому, лейциновый (L) остаток консервативно располагается в 3 или 4 остатках от N-конца из двух аспарагиновых остатков, а один или несколько заряженных остатков (аспарагиновой кислоты (D), лизина (К), глютаминовой кислоты (Е) или аргинина (R)) консервативно располагаются в от 2 до 8 остатках от С-конца из двух аспарагиновых остатков. Каждый из данных высококонсервативных остатков подчеркнут в Таблице 3.

Высококонсервативные соседние аспарагиновые остатки, лейциновый остаток и заряженные остатки, описанные выше, могут представлять важность для активности активного фрагмента просапозина в облегчении нейропатической боли или в стимулировании роста нейритов ингибировании гибели нейронов, стимулировании миелинизации, или ингибировании демиелинизации, или в ингибировании развития двигательной невропатии. Например, производный от просапозина 22-мерный (ПОСЛ. ИД. №:1) или производный от просапозина 14-мерный (ПОСЛ. ИД. №:2) пептиды являются активными фрагментами просапозина, которые уменьшают болезненную allodynia, наблюдаемую в модели Chung периферической невропатии на крысах, как описано в примере 1 (см. Фигуры 1 и 2). Напротив, мутантный 22-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:8), который отличается от ПОСЛ. ИД. №:1 наличием остатка аспарагиновой кислоты (D) вместо первого консервативного аспарагина (см. Таблицу 4), не обладает активностью в облегчении нейропатической боли, что было определено с применением модели Chung на крысах (см. пример 1).

Активность пептида в облегчении нейропатической боли также может коррелировать с нейротрофной активностью. Например, производный от просапозина 22-мерный (ПОСЛ. ИД. №:1) и производный от просапозина 14-мерный (ПОСЛ. ИД. №:2) пептиды облегчают нейропатическую боль и обладают нейротрофной активностью. В дополнение к этому, мутантный 22-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:8) не обладает активностью в облегчении нейропатической боли, как описано выше, и не обладает нейротрофной активностью, далее указывая на то, что активность в облегчении нейропатической боли может коррелировать с нейротрофной активностью. Мутантный 14-мерный пептид М-1 (ПОСЛ. ИД. №:9), в котором имеется замена второго консервативного аспарагинового остатка, не обладает нейротрофной активностью, что указывает на то, что ПОСЛ. ИД. №:9 также не обладает активностью в облегчении нейропатической боли. Мутантный 14-мерный пептид М-2 (10), в котором имеется замена консервативного лейцинового остатка, не обладает нейротрофной активностью, что указывает на то, что ПОСЛ. ИД. №:10 также не обладает активностью в облегчении нейропатической боли. Напротив, производный от просапозина 12-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:3), который содержит консервативные соседние аспарагины, лейцин и заряженные остатки, описанные выше, обладают активностью нейротрофного фактора. Таким образом, производный от просапозина 12-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:3) также способен облегчать нейропатическую боль в соответствии со способом по данному изобретению.

Производные от просапозина пептиды и их нейротрофные аналоги имеют значительные терапевтические приложения в ускорении функционального восстановления после токсических, травматических, ишемических, дегенеративных или наследственных поражений периферической или центральной нервной системы. В дополнение к этому, данные пептиды способны стимулировать миелинизацию или ингибировать демиелинизацию, противодействуя таким образом воздействию демиелинизирующих заболеваний. Кроме того, такие пептиды стимулируют рост нейритов и ингибируют запрограммированную клеточную гибель в нервной ткани. Активные нейротрофные и миелинотрофные пептиды по данному изобретению содержат от приблизительно 12 или 14 до приблизительно 50 аминокислот и, предпочтительно, включают не встречающуюся в природе (искусственную) последовательность просапозина, показанную в ПОСЛ. ИД. №:2. Например, активные нейротрофные и миелинотрофные пептиды по данному изобретению содержат от 14 до приблизительно 50 аминокислот и включают искусственную последовательность просапозина, показанную в ПОСЛ. ИД. №:2.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации или ингибирования демиелинизации среди дифференцированных и недифференцированных нервных клеток путем введения в нервные клетки эффективного количества пептида, способствующего росту нейритов и образованию миелина, содержащего от приблизительно 12 до приблизительно 50 аминокислот и, предпочтительно, включающего пептид, показанный в ПОСЛ. ИД. №:2. В способах по данному изобретению для стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации или ингибирования демиелинизации может быть применено эффективное количество пептида, содержащего, например, от 14 до приблизительно 50 аминокислот и включающего пептид, показанный в ПОСЛ. ИД. №:2.

Способность любого такого пептида стимулировать рост нейритов, ингибировать гибель нейронов, стимулировать миелинизацию или ингибировать демиелинизацию может быть легко определена специалистом в данной области с применением методик, описанных в примерах с IV по VII. Способы анализа способностей данных пептидов стимулировать миелинизацию или ингибировать демиелинизацию изложены далее в примерах VI и VII.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования чувствительной невропатии путем воздействия на нервные клетки композиции, содержащей эффективное ингибирующее количество активного фрагмента просапозина, изобретение относится, например, к методу ингибирования сенсорной нейропатии путем взаимодействия нейронов с композицией, содержащей эффективное ингибирующее количество пептида, обладающего последовательностью, показанной как ПОСЛ. ИД. №:1 или ПОСЛ. ИД. №:2.

Как описывается здесь в примере X, производный от просапозина пептид может быть применим для ингибирования чувствительной невропатии. В модели на мышах, у которых чувствительную невропатию вызывают путем введения таксола, обычно наблюдается потеря термической чувствительности. Однако у обработанных таксолом мышей, получавших 100 мкг/кг пептида ПОСЛ. ИД. №:1, потеря термической чувствительности ингибировалась. Данные результаты указывают на то, что производные от просапозина пептиды могут являться нейротрофным фактором как для чувствительных, так и для двигательных нейронов.

Пептид, применимый в способах по данному изобретению, также может представлять собой, например, ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно (см. Таблицу 5). Например, выравнивание последовательности производного от просапозина 22-мерного пептида ПОСЛ. ИД. №:1 с последовательностями цитокинов и факторов роста указывает на гомологичность последовательности с рядом человеческих (h) цитокинов, включая hCNTF, hIL-6, hIL-2, hIL-3, Hill-γ эритропоэтин (hEPO), человеческий лимфоцит-ингибирующий фактор (hLIF), β-цепь hIL-1 и онкостатин-М (hONC-M). ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно, как и активный фрагмент просапозина ПОСЛ. ИД. №:1, содержат два аспарагиновых остатка, которые являются смежными либо разделены одной аминокислотой. В дополнение к этому, производные от цитокинов пептидные последовательности могут содержать лейциновый (L) или изолейциновый (I) остаток в 3 или 4 остатках от N-конца из двух аспарагиновых остатков, а один или несколько заряженных остатков (аспарагиновой кислоты (D), лизина (К), глютаминовой кислоты (Е) или аргинина (R)) располагаются в от двух до восьми остатках от С-конца из двух аспарагиновых остатков, что наблюдается в активном фрагменте просапозина (22-мерный; ПОСЛ. ИД. №:1). Каждый из данных остатков подчеркнут в Таблице 5.

Модели цитокин-рецепторного связывания (Sprang and Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:816 (1993)) выявили эволюционный консерватизм в четырехцепочечной структуре, характерной для многих цитокинов. Все последовательности цитокинов и факторов роста, родственные производной от просапозина последовательности ПОСЛ. ИД. №:1, локализованы между цепями А и В (в АВ-петле) или в цепи С цитокина.

Структурно родственные производные от цитокинов и факторов роста пептиды ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно также могут быть применимы в способах для облегчения нейропатической боли. Пептиды ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно могут быть проанализированы на предмет активности в облегчении нейропатической боли с применением, например, модели Chung на крысах, описанной в примере 1; модели диабетической невропатии, как описано в анализах из примера III, описанных Wall et al., Pain 7:103-113 (1979); Bennet and Xie, Pain, 33:87-107 (1988); Lekan et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992) или Palacek et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992); или других исследований нейропатической боли.

Производные цитокинов и факторов роста пептиды ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно также могут быть применимы в способах стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации или ингибирования демиелинизации или в способах ингибирования чувствительной или двигательной невропатии. Пептид, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 50 аминокислот и включающий фрагмент, обладающий нейротрофной активностью, содержащийся в одной из ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно, может быть проанализирован на предмет способности стимулировать рост нейритов, как описано в примере IV; или может быть проанализирован на предмет способности ингибировать гибель нейронов, как описано в примере V; или на предмет способности стимулировать миелинизацию, как описано в примере VI; или на предмет способности ингибировать демиелинизацию, как описано в примере VII; или на предмет способности ингибировать чувствительную невропатию, как описано в примере Х.

Активный фрагмент просапозина или пептид, применимый для облегчения нейропатической боли, может быть идентифицирован с помощью скрининга большой коллекции или банка, случайных пептидов или интересующих пептидов с применением, например, одной из ряда моделей нейропатической боли на животных. Такие интересующие пептиды могут представлять собой, например, производные от цитокинов и факторов роста пептиды ПОСЛ. ИД. №№: с 11 по 19 включительно, которые обладают аминокислотными последовательностями, гомологичными последовательности активного фрагмента просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1). Интересующие пептиды могут также представлять собой, например, популяцию пептидов, гомологичных по аминокислотной последовательности ПОСЛ. ИД. №:1 в том, что они содержат консервативные аспарагиновые остатки, остаток лейцина/изолейцина и один или несколько заряженных остатков в положениях, соответствующих таковым, в которых данные остатки находятся в ПОСЛ. ИД. №:1, но также содержат и одну или несколько аминокислот, которые отличаются от аминокислот из ПОСЛ. ИД. №:1.

Банки пептидов включают, например, снабженные химическим описанием пептидов банки, содержащие пептиды и пептидомиметики. Банки пептидов также содержат пептиды, полученный с применением методов экспрессии с помощью фагов. Методы экспрессии с помощью фагов включают в себя экспрессию пептидных молекул на поверхности фага, равно как и другие методы, с помощью которых белковый лиганд ассоциируется или может ассоциироваться с нуклеиновой кислотой, которая его кодирует. Способы создания банков с применением методов экспрессии с помощью фагов, включая векторы и способы клонирования популяции пептидов, которые были экспрессированы, хорошо известны в данной области (см., например. Smith and Scott, Methods Enzymol. 217:228-257 (1993); Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); и Huse, WO 91/07141 и WO 91/07149). Данные или иные хорошо известные способы могут быть применены для создания банков с применением методов экспрессии с помощью фагов, пептиды экспрессированные в которых могут быть выделены и проанализированы на предмет активности в облегчении нейропатической боли или другой нейротрофной или миелинотрофной активности, как здесь описано. При желании, популяция пептидов может быть исследована на предмет активности, и активная популяция может быть подразделена, а анализ повторен в целях выделения из популяции активного пептида. Другие методики получения пептидов, применимые по данному изобретению, включают, например, рациональное конструирование и мутагенез, основанные на аминокислотных последовательностях активных фрагментов просапозина, таких как, например, ПОСЛ. ИД. №:1 и ПОСЛ. ИД. №:2.

Как здесь описано, активный фрагмент просапозина или пептид, применимый для облегчения нейропатической боли, может быть идентифицирован по его активности в облегчении нейропатической боли в любой из ряда прочно устоявшихся моделей нейропатической боли на животных (Bennett, supra, 1993). Например, активный фрагмент просапозина может быть идентифицирован с применением экспериментальной модели периферической невропатии, вызванной перевязкой сегментарного спинно-мозгового нерва, у крысы. Модель Chung на крысах имитирует симптомы пациентов - людей, страдающих каузалгией, или жгучую боль при повреждении периферического нерва (Kim and Chung, supra, 1992). Хирургическая операция по Kim и Chung позволяет получить стойкую гиперальгезию к высокой температуре и механическую allodynia затронутой конечности. Как описано в примере 1, крысы со спинно-мозговым нервом, перевязанным в соответствии с методикой, разработанной Chung и Kim, применимы для идентификации активного фрагмента просапозина для применения в облегчении нейропатической боли.

Активный фрагмент просапозина или пептид, применимый для облегчения нейропатической боли, также может быть идентифицирован по его активности в облегчении нейропатической боли в модели болезненной диабетической невропатии на крысах. Также сообщалось о гиперальгезии в ответ на термические, механические и химические отрицательный стимулы у крыс-диабетиков, страдающих преходящим инсулин-зависимым сахарным диабетом, вызванным избирательными токсинами, тропными к β-клеткам, такими как стрептозотоцин (Calcutt et al., Pain 68:293-299 (1996)). Такая модель на крысах представляет боль, наблюдаемую у людей, страдающих сахарным диабетом, у которых может проявляться множество искаженных ощущений, включая спонтанную боль, боль, вызванную легким прикосновением, и гиперальгезию. Крысы, обработанные стрептозотоцином или иным избирательным токсином, тропным к β-клеткам, могут быть обработаны интересующим фрагментом или пептидом; в дальнейшем, измеряют ответ на негативный стимул, такой как 0,5% формалин. Сниженная реакция может быть использована для определения активного фрагмента просапозина или пептида, применимого для облегчения нейропатической боли.

Активный фрагмент просапозина или пептид, применимый для облегчения нейропатической боли, также может быть идентифицирован с применением нейромной модели по Wall et al. Данная широко известная модель нейропатической боли воспроизводит симптомы, наблюдаемые у человека после ампутации или пересечения нерва в интактной конечности (Wall et al., supra, 1979). Как обсуждалось выше, неврома зачастую образуется после пересечения нерва из-за нарушенного роста отростков нервных клеток.

Для идентификации активного фрагмента просапозина или пептида, применимого для облегчения нейропатической боли, также может быть применена модель повреждения в результате хронического сдавливания. Модель повреждения в результате хронического сдавливания по Bennett and Xie, supra, 1988, представляет собой модель периферической невропатии на крысах, которая приводит к развитию болезненных состояний, сходных с таковыми, наблюдаемыми у человека. В модели Bennett повреждение нерва производят путем свободного наложения давящих лигатур вокруг седалищного нерва крысы, приводящего к дегенерации нерва дистальнее места сдавления. Помимо спонтанной боли повреждением с помощью сдавливания также вызываются allodynia и гиперальгеэия.

Модели нейропатической боли на приматах также являются применимыми для идентификации активного фрагмента просапозина или пептида, применимого для облегчения нейропатической боли (см., например, Lekan et al., supra, 1992; Palacek et al., supra, 1992).

Как здесь используется, термин "пептид" применяется по отношению к активному фрагменту просапозина, производному от просапозина пептиду или пептиду, применимому в способах по данному изобретению, означает соединение, содержащее природные аминокислоты, неприродные аминокислоты или химически модифицированные аминокислоты при условии, что соединение сохраняет активность в облегчении нейропатической боли или иную нейротрофную или миелинотрофную активность, как описано выше. Производный от просапозина пептид также может представлять собой пептидомиметик, который представляет собой неаминокислотную химическую структуру, которая имитирует строение пептида, производного просапозина, и сохраняет активность. Такой миметик, как правило, характеризуется проявлением сходных физических характеристик, таких как размер, заряд или гидрофобность, при той же пространственной организации, что и у его пептидного аналога, производного от просапозина. Особым примером пептидомиметика является соединение, в котором амидная связь между одной или несколькими аминокислотами заменена, например, углерод-углеродной связью или иной связью, хорошо известной в данной области (см., например, Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington (1995)).

Как здесь используется, термин "аминокислота" относится к одной из двадцати природных аминокислот, включающих, если не указано особо, L-аминокислоты и D-аминокислоты. Термин "аминокислота" также относится к таким соединениям, как химически модифицированные аминокислоты, включая аналоги аминокислот, природные аминокислоты, которые обычно не входят в состав белков, такие как норлейцин, и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, известными в данной области как характерные для аминокислот при условии, что соединение может быть замещено в пептиде так, что он сохранит свою биологическую активность. Например, глютамин может являться аминокислотным аналогом аспарагина при условии, что он может быть замещен в активном фрагменте просапозина так, что он сохранит свою активность в облегчении нейропатической боли или иную нейротрофную или миелинотрофную активность, как здесь описано. Другие примеры аминокислот и аминокислотных аналогов приведены в Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983). Термин "аминокислота" также может относиться к миметику аминокислоты, который представляет собой структуру, которая обладает, по существу, той же пространственной организацией функциональных групп, что и аминокислота, но не обязательно содержит как α-амино-, так и α-карбоксигруппы, характерные для аминокислот.

Активный фрагмент просапозина или пептид, применимый по данному изобретению, может быть выделен или синтезирован с применением методик, хорошо известных в данной области. Такие методики включают методы рекомбинантных ДНК и методы химического синтеза для получения пептида. Рекомбинантные методики получения пептида посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, в подходящей клетке-хозяине хорошо известны в данной области и описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).

Активный фрагмент просапозина или пептид, применимый по данному изобретению, также может быть получен путем химического синтеза, например, по методу твердофазного пептидного синтеза по Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964). Стандартные жидкофазные методики, хорошо известные в данной области, также могут быть применены для синтеза пептида, применимого по данному изобретению (см., например, Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin. (1984) и Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Вновь синтезированный пептид сможет быть подвергнут очистке, например, по методу жидкостной хроматографии высокого разрешения (ВЖЭХ), и может быть охарактеризован с применением, например, масс-спектрометрии или анализа аминокислотной последовательности.

Понятно, что могут быть произведены ограниченные модификации активного фрагмента просапозина без нарушения его биологической функции. Таким образом, модификация активного фрагмента просапозина, которая не нарушает его способность облегчать нейропатическую боль, подпадает под определение активного фрагмента просапозина. Модификация может включать в себя, например, вставку, делецию или замещение аминокислотных остатков; замещение соединения, которое имитирует структуру и функцию аминокислоты; и вставку химических радикалов, таких как амино- и ацетильные группы. Активность модифицированного пептида в облегчении нейропатической боли может быть проанализирована с применением модели нейропатической боли на животном, как, например такой, что описана выше, или анализа, проиллюстрированного в примере I.

Особенно полезной модификацией активного фрагмента просапозина является модификация, позволяющая получить, например, повышенную устойчивость. Например, включение одной или нескольких D-аминокислот или замещение или делеция лизина может увеличить устойчивость активного фрагмента просапозина посредством зашиты от деградации пептида. Например, как здесь описано, производный от просапозина 14-мерный пептид ПОСЛ. ИД. №:2 обладает аминокислотной последовательностью, производной от аминокислот с 16 по 29 сапозина С, но которая была модифицирована посредством замещения или делеции всех трех природных лизинов и вставки С-концевого тирозинового остатка. В частности, в производном от просапозина 14-мерном пептиде ПОСЛ. ИД. №:2 имеется замещение лизина на D-аланин в положении 2; замещение лизина на аланин в положении 8 и делеция лизина в положении 11. Замещение на D-аланин в положении 2 способствует повышенной устойчивости путем защиты пептида от деградации эндопротеазами, что является хорошо известным в данной области (см., например, страницу 247 в Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York (1991)). Замещение или делеция лизинового остатка способствует повышенной стойкости к трипсиноподобным протеазам, что является хорошо известным в данной области (Partridge, supra, 1991). Данные замещения увеличивают устойчивость и, таким образом, биологическую доступность пептида ПОСЛ. ИД. №:2, но не влияет на активность в облегчении нейропатической боли.

Полезной модификацией также может являться модификация, которая способствовала бы прохождению пептида через гематоэнцефалический барьер, такая как модификация, которая повышает липофильность или снижает образование водородных связей. Например, тирозиновый остаток, внесенный в С-конец производного от просапозина пептида (ПОСЛ. ИД. №:2), повышает гидрофобность и проницаемость через гематоэнцефалический барьер (см., например. Banks et al., Peptides 13:1289-1294 (1992) и Partridge, supra, 1991). Химера пептид-фармпрепарат, которая обладает повышенной биологической устойчивостью и повышенной проницаемостью через гематоэнцефалический барьер, например, также может быть применима в способе по данному изобретению.

Специалист в данной области способен легко проанализировать способность активного фрагмента просапозина проникать через гематоэнцефалический барьер In vivo, например, как описано в примере II. В дополнение к этому, активный фрагмент просапозина может быть протестирован на предмет его способности проникать через гематоэнцефалический барьер с применением модели in vitro гематоэнцефалического барьера, основанной на культуральной системе эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, например, как описано в Bowman et al., Ann. Neurol. 14:396-402 (1983) или Takahura et al., Adv. Pharmacol. 22:137-165 (1992).

Как здесь используется, термин "эффективное количество" означает количество активного фрагмента просапозина, применяемое для облегчения нейропатической боли или для предотвращения возникновения нейропатической боли. Эффективное количество, подлежащее системному ежесуточному введению, зависит от массы тела субъекта. Предпочтительно, эффективное количество, подлежащее системному ежесуточному введению, составляет от приблизительно 0,1 мкг/кг до приблизительно 1000 мкг/кг. Более предпочтительно, эффективное количество, подлежащее системному ежесуточному введению, составляет от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг. Эффективное количество пептида для облегчения или предотвращения возникновения боли может быть определено эмпирически с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области, включая, например, анализ, описанный в примере I, или методики, описанные выше, включая анализы на приматах (Lekan et al., supra, 1992; Palacek et al., supra, 1992).

Обычно минимальное количество пептидов по данному изобретению для наличия нейротрофной или миелинотрофной активности в клеточной культуральной среде составляет, по крайней мере, приблизительно 5 нг/мл. Это или большее количество пептида по данному изобретению может быть использовано для применения in vitro. Обычно могут быть применены концентрации пептида по данному изобретению, находящиеся в интервале от 0,1 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл. Эффективное количество для лечения конкретной ткани может быть определено, как изложено в примерах IV и VI.

Нейроны могут быть обработаны in vitro или ex vivo путем непосредственного введения пептида по данному изобретению в клетки. Данная процедура может быть выполнена, например, путем культивирования клеток в культуральной среде, подходящей для конкретного типа клеток, с последующим добавлением в среду пептида. Когда подлежащие обработке нейроны находятся in vivo, обычно в позвоночном животном, предпочтительно в млекопитающем, пептид по данному изобретению может быть введен посредством одной из ряда методик, как описано ниже.

Как здесь используется, термин "субъект" означает позвоночное, предпочтительно млекопитающее, и, в частности, человек.

Настоящее изобретение обеспечивает способы облегчения нейропатической боли, стимулирования роста нейритов, ингибирования гибели нейронов, стимулирования миелинизации и ингибирования демиелинизации нейронов и способы ингибирования развития чувствительной (сенсорной) или двигательной невропатии путем введения эффективного количества активного фрагмента просапозина внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, интракраниально, в цереброспинальную жидкость, местно, перорально, чрескожно, трансмукозально или интраназально. С активным фрагментом просапозина может быть введен фармацевтически приемлемый носитель широко распространенного типа. Такие носители включают, например, фосфатно-буферный раствор (PBS).

Предпочтительно эффективное количество активного фрагмента просапозина вводят непосредственно в кровоток субъекта. Например, внутривенное введение активного фрагмента просапозина может быть применено для введения активного фрагмента в периферическую или центральную нервную систему, поскольку йодированный производный от просапозина 18-мерный пептид Tyr-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (ПОСЛ. ИД. №:20), состоящий из аминокислот производного (с 12 по 29) от просапозина 22-мерного пептида ПОСЛ. ИД. №:1 с замещением валина на тирозин в положении 12, (М=2000 Да) проникал через гематоэнцефалический барьер и попадал в центральную нервную систему, как описано в примере II. Поглощение головным мозгом составляло приблизительно 0,03%, что находится в середине интервала значений для пептидов приблизительно такого же размера, которые проникают через гематоэнцефалический барьер (Banks et al., supra, 1992).

Часто желаемым оказывается пероральное введение при условии, что активный фрагмент просапозина модифицирован таким образом, что он является устойчивым к деградации в желудочно-кишечном тракте и легко всасываемым. Например, замещение одной или несколькими D-аминокислотами может способствовать повышенной устойчивости пептида производного просапозина, применимого по данному изобретению.

Прямая интракраниальная инъекция или инъекция в цереброспинальную жидкость также может быть применена для введения эффективного количества активного фрагмента просапозина в центральную нервную систему субъекта. В дополнение к этому, активный фрагмент просапозина может быть введен в периферическую нервную ткань путем прямой инъекции или местного применения или путем системного введения. Также рассматриваются различные традиционные способы введения, включая внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, подкожное, интракраниальное, эпидуральное, местное, пероральное, чрескожное, трансмукозальное и интраназальное введение.

Активный фрагмент просапозина также может быть введен в форме длительного высвобождения. Длительное высвобождение активного фрагмента просапозина обладает преимуществом облегчения нейропатической боли в течение продолжительного периода времени без необходимости повторных введений активного фрагмента.

Длительное высвобождение может быть достигнуто, например, с помощью применения длительно высвобождающего устройства, такого как капсула, иммунологические сферы, микронасос или другое устройство, которое обеспечивает контролируемое медленное высвобождение активного фрагмента просапозина. Такие устройства контролируемого высвобождения хорошо известны в данной области и доступны из коммерческих источников (Alza Corp., Palo Alto CA; Depotech, La Jolla CA; см. также Pardoll, Ann. Rev. Immunol. 13:399-415 (1995)). В дополнение к этому, может быть произведена имплантация разрушающегося и разлагающегося в биологических условиях материала, такого как полимер молочной кислоты, полимер галактоновой кислоты, регенерированный коллаген, многослойные липосомы или другие традиционные депонирующие составы, который может быть включен в состав с активным фрагментом просапозина в целях медленного высвобождения активного фрагмента просапозина. В настоящем изобретении также рассматриваются инфузионные насосы, системы включения в носитель и устройства для чрескожного введения.

Также может быть предпочтительно, чтобы активный фрагмент просапозина был заключен в мицеллы или липосомы. Методика заключения в липосомы является хорошо известной. Липосомы могут быть нацелены на конкретную ткань, такую как нервная ткань, посредством использования рецепторов, лигандов или антител, способных связываться с тканью-мишенью. Методика приготовления таких составов является хорошо известной в данной области (см., например, partridge, supra, 1991, и Radin and Metz, Meth. Enzymol. 98:613-618 (1983)).

Пептидная композиция по данному изобретению может помещаться и вводиться в разовой дозированной форме, такой как композиция для инъекций или препарат для местного применения с дозой в объеме, эквивалентном суточной дозе, вводимой пациенту, и, при желании, может быть получена в составе с контролируемым высвобождением. Разовая дозированная форма может представлять собой, например, герметично закрытый объем, содержащий суточную дозу активной композиции по данному изобретению в PBS или в лиофилизованной форме. В лечении нервных болезней адекватные суточные системные дозы пептида по данному изобретению устанавливаются на основании массы тела позвоночного животного и находятся в интервале от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг, хотя дозировки от приблизительно 0,1 мкг/кг до приблизительно 1000 мкг/кг также применимы. Так, для среднего человека массой 70 кг системная доза может составлять от приблизительно 7 до приблизительно 70000 мкг в сутки и, предпочтительно, от приблизительно 700 до приблизительно 7000 мкг в сутки. Суточная доза местно применяемого препарата будет приблизительно на порядок меньше, чем системная доза. Также применимо пероральное введение.

Данное изобретение также относится к способу облегчения нейропатической боли у субъекта путем трансплантации субъекту клетки, генетически модифицированной для экспрессии и секреции активного фрагмента просапозина. Трансплантация способна обеспечить непрерывный источник активного фрагмента просапозина и, таким образом, длительное облегчение нейропатической боли. Для субъекта, страдающего длительными и хроническими нейропатическими болями, такой способ обладает преимуществом избегания или сокращения потребности повторного введения активного фрагмента просапозина.

Применяя методы, хорошо известные в данной области, клетка может быть легко трансфицирована экспрессируюиим вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую активный фрагмент просапозина (Chang, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boca Raton (1995)). Например, после трансплантации в головной мозг трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует активный фрагмент просапозина и, таким образом, облегчает нейропатическую боль. Такой способ может быть применим для облегчения нейропатической боли, как описано для трансплантации клеток, которые секретируют вещества, обладающие анальгезирующими свойствами (см., например, Czech and Sagen, Prog. Neurobiol. 46:507-529 (1995)).

Клетка может представлять собой любую клетку, которая способна перенести трансплантацию и которая может быть модифицирована так, чтобы экспрессировать и секретировать активный фрагмент просапозина. На практике, клетка должна быть иммунологически совместима с субъектом. Например, особенно применимой клеткой является клетка, выделенная из субъекта, подлежащего лечению, поскольку такая клетка является иммунологически совместимой с субъектом.

Клетка, полученная из источника, отличного от субъекта, подлежащего лечению, также может быть применимой, будучи защищенной от реакции иммунного отторжения с применением, например, микроинкапсулирования или иммуносупрессии. Пригодные для микроинкапсулирования мембранные материалы включают альгинат-поли-L-лизинальгинат и агарозу (см., например, Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boca Raton (1983); Tai and Sun, FASEB J. 7:1061 (1993); Liu et al., Hum. Gene Ther. 4:291 (1993); и Taniguchi et al., Transplant. Proc. 24:2977 (1992)). Например, облегчение боли было достигнуто с применением инкапсулированных в полимер клеток, трансплантированных в спинальное субарахноидальное пространство крысы (Wang et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17:235 (1991)).

Для применения в лечении субъекта-человека клетка может являться человеческой, хотя также могут быть применены и клетки млекопитающих, отличных от человека. В частности, человеческий фибробласт, мышечная клетка, глиоцит, клетка-предшественник нейрона или нейрон могут быть трансфицированы экспрессирующим вектором так, чтобы экспрессировать и секретировать активный фрагмент просапозина, такой как ПОСЛ. ИД. №:1. Исходный фибробласт может быть получен, например, с помощью биопсии кожи субъекта, подлежащего лечению, и поддерживаться в стандартных условиях культивирования ткани. Исходная мышечная клетка также может являться применимой для трансплантации. Обсуждения трансплантации нейронов приводятся, например, в Chang, supra, 1995.

Клетка, полученная из центральной нервной системы, может являться особенно применимой для трансплантации в центральную нервную систему, поскольку выживаемость такой клетки увеличивается благодаря ее естественному окружению. Клетка-предшественник нейрона является особенно применимой в способе по данному изобретению, поскольку клетка-предшественник нейрона может быть выращена в культуре, трансфицированной экспрессирующим вектором, и введена индивидууму, в организм которого она интегрируется. Выделение клеток-предшественников нейрона, которые способны к пролиферации и дифференцировке в нейроны и глиоциты, описано в Renfranz et al., Cell 66:713-729 (1991).

Методики трансфицирования клеток ex vivo являются хорошо известными в данной области (Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H.Freeman & Co., New York (1990)). Для трансфицирования клетки, которая продолжает делиться, такой как фибробласт, мышечная клетка, глиоцит или клетка-предшественник нейрона, предпочтительным является ретровирусный вектор. Для трансфицирования экспрессирующим вектором постмитотической клетки, такой как нейрон, применимым является вектор вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) с нарушенной репликацией (During et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17:140 (1991); Sable et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17:570 (1991)).

Нуклеиновая кислота, кодирующая активный фрагмент просапозина, может экспрессироваться под контролем одного из множества промоторов, хорошо известных в данной области, включая конститутивный промотор или индуцибельный промотор. См., например, Chang, supra, 1995. Особенно применимым конститутивным промотором для высокопродуктивной экспрессии является длинный концевой повтор вируса мышиного лейкоза Moloney (MLV-LTR), immediate-early цитомегаловируса (CMV-IE) или early фрагмент обезьяньего вакуолизирующего вируса (SV40).

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей активный фрагмент просапозина, описана здесь. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей ПОСЛ. ИД. №:1, представляет собой 5'-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3' (ПОСЛ. ИД. №:21) (Dewji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8652-8656 (1987)). В целях направления секреция пептида ПОСЛ. ИД. №:1, например, нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальную последовательность, такую как сигнальную последовательность гена β-лактамазы, может быть оперативно присоединена к ПОСЛ. ИД. №:21, как описано в Simon et al., J.Cell Biol. 104:1165 (1987).

Данное изобретение далее относится к способу предотвращения возникновения нейропатической боли у субъекта путем введения субъекту эффективного количества активного фрагмента просапозина. Способ предотвращения возникновения нейропатической боли применим, будучи использован до болезненного состояния, например, до химиотерапевтического или хирургического вмешательства, которые, как известно, приводят к возникновению нейропатической боли.

Следующие примеры предназначены для иллюстрирования, но не для ограничения настоящего изобретения.

Пример I

Облегчение нейропатической боли в модели Chung на крысах

В данном примере описаны эффекты болюсной интратекальной инъекции активного фрагмента просапозина в экспериментальной модели периферической нейропатической боли по Chung.

Все три пептида получали в чистом виде путем химического синтеза, растворяли в стерильном PBS и забуферивали до нейтрального значения рН.

На самцах крыс Sprague-Dawley массой от 120 до 150 грамм выполняли хирургическую операцию, описанную ранее в Kim and Chung, supra, 1992, для вызывания allodynic состояния. Схема операции: крысам проводили анестезию галотаном; далее, левые спинно-мозговые нервы L-5 и L-6 выделяли вблизи позвоночного столба и перевязывали шелковой нитью 6,0 дистальнее спинно-мозгового ганглия. По прошествии от десяти до четырнадцати суток послеоперационного периода восстановления вводили спинальный катетер. Через пять суток после второго хирургического вмешательства проводили интратекальное введение лекарственного средства, применяя управляемый шприц для микроинъекций, присоединенный к спинальному катетеру, введенному в foramen magnum. До тестирования крыс помещали в чистые клетки из пластикового шнура и позволяли акклиматизироваться.

Для оценки 50% механического порога отдергивания конечности волоски Von Frey прикрепляли к задней конечности, не затрагивая подушечку лапы. Все волоски Von Frey, которые прокалиброваны так, чтобы сгибать (конечность) с увеличивающейся log силой, прижимали перпендикулярно к конечности с достаточной силой с тем, чтобы вызвать легкий изгиб в течение приблизительно от шести до восьми секунд. О положительной реакции говорили, если конечность резко отдергивалась. Для каждой точки регистрировали шесть точек (данных), отмечая для каждого момента времени максимальный и минимальный стимулы. Полученную картину реакций сводили в Таблицу и рассчитывали 50% порог реакции. График дает представление о реакции на указанную дозу пептида, введенного в виде единой интратекальной болюсной инъекции. По оси Х отложено время после инъекции, по прошествии которого была зарегистрирована гиперчувствительность на давление на подушечку лапы.

Все хирургически поврежденные крысы проявляли тактильную allodynia до инъекции активным фрагментом просапозина. Как показано при нулевом времени на Фигуре 1, измеренный порог был менее чем от 3,0 до 4,0 г в отсутствие пептида. Интратекальная инъекция 0,7 или 0,07 мкг 22-мерного пептида производного просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1) подавляла allodynia в зависимости от дозы. Снижение allodynia проявляется в увеличении пороговой силы, когда крысы выдерживают воздействие возрастающей силы до того, как отдернуть затронутую конечность.

Значительный эффект наблюдался через 15 минут после инъекции. Максимальный эффект наблюдался через 120 минут после инъекции. Крысы, инъецированные наивысшей дозой производного просапозина 22-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:1), продолжали проявлять в значительной степени сниженную allodynia в заключительной временной точке исследования (180 минут). Крысы, которым было введено 0,007 мкг производного просапозина 22-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:1), не проявляли значительного сокращения allodynia. Ни при какой из применявшихся концентраций каких-либо побочных эффектов отмечено не было.

Также изучали способность производного просапозина 14-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:2; см. Таблицу 1) сокращать allodynia в модели Chung на крысах. Как показано на Фигуре 2, активный фрагмент просапозина (ПОСЛ. ИД. №:2) оказался эффективным в сокращении allodynia. Пиковый эффект производного просапозина 14-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:2) наблюдался между 15 и 30 минутами после инъекции и возвращался к "доинъекционному" значению к 60 минуте (Фигура 2). Ни при какой из протестированных концентраций производного просапозина 14-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:2) каких-либо побочных эффектов отмечено не было.

Мутантный 22-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:8), который отличается от производного просапозина 22-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:1) содержанием остатка аспарагиновой кислоты вместо аспарагина (см. Таблицу 4), также был протестирован на предмет активности в сокращении allodynia в модели Chung на крысах. После инъекции 17,5 мкг мутантного 22-мерного пептида (ПОСЛ. ИД. №:8) каких-либо изменений в allodynic реакции не наблюдалось.

Нормальным крысам, которые не испытывают боль в результате хирургического повреждения, нанесенного в соответствии с моделью Chung, также вводили активный фрагмент просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1) и тестировали их реакции на тепловой стимул в соответствии с методикой, разработанной Bennett and Xie, supra, 1988. Определяли временной промежуток до того, как крыса отдернула затронутую конечность от источника тепла, как период отсутствия реакции на горячую пластину, и он представляет собой меру толерантности к боли, вызванной тепловым стимулом.

Нормальным самцам крыс Sprague-Dawley вводили интратекальный катетер. Через пять суток после данного хирургического вмешательства крысам интратекально вводили активный фрагмент просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1). Крыс обследовали на горячей пластине (52,5°С); периоды отсутствия реакции на горячую пластину определяли до инъекции и в различные моменты времени вплоть до 180 минут после инъекции. Какого-либо значительного увеличения периода отсутствия реакции на горячую пластину не наблюдалось. Таким образом, активный фрагмент просапозина (ПОСЛ. ИД. №:1) не влияет на восприятие боли нормальными животными.

Пример 11

Поглощение пептидов производных просапозина In vivo центральной нервной системой

Результаты, описанные в данном примере, указывают на то, что пептиды производные просапозина проникают через гематоэнцефалический барьер.

С помощью синтезатора пептидов модели 430 Applied Biosystems химически синтезировали 18-мерный пептид (ПОСЛ. ИД. №:20), состоящий из аминокислот 12-29 сапозина С с валином в положении 12, замещенным на тирозин. Пептид затем метили по лактопероксидазному методу радиоактивным йодом; в ушные раковины крыс вводили 20×10⁶ Бк пептида, помеченного радиоактивной меткой. Животных забивали через один час и через 24 часа и сердца перфузировали изотоническим солевым раствором в целях удаления крови из головного мозга.

В целях определения процентного поглощения пептидов активность головного мозга затем определяли с помощью гамма-счетчика. В дополнение к этому, головной мозг гомогенизировали и разделяли на богатую капиллярами фракцию (осадок) и паренхиматозную фракцию головного мозга (супернатант) после центрифугирования в декстране (Triguero et al., J. Neurochem. 54:1882-1888 (1990)). Данный метод позволяет определить разность содержания пептида, помеченного радиоактивной меткой, в кровеносных сосудах и в (паренхиме) головного мозга. Через 24 часа во всем головном мозге было зарегистрировано 0,017% введенного пептида (ПОСЛ. ИД. №:20); 75% метки содержалось в паренхиматозной фракции, а 25% содержалось в капиллярной фракции. Через 1 час во всем головном мозге присутствовало 0,03% введенной дозы.

Пептид производный просапозина ПОСЛ. ИД. №:2 также анализировали на предмет его способности проникать через гематоэнцефалический барьер следующим образом. Самке крысы Sprague-Dawley проводили анестезию метоксифлюраном и в хвостовую вену вводили приблизительно 20 мкг пептида ПОСЛ. ИД. №:2 (3,2×10⁸ Бк). Через 40 минут крысу забивали с помощью эфирной анестезии и перфузировали сердце приблизительно 250 мл PBS. Общее количество пептида в головном мозге, печени и крови рассчитывали в процентах от количества введенного препарата, как показано в Таблице 6. В целях определения локализации в головном мозге применяли методику отделения капилляров по Triguero, J. Neurochem. 54:1882-1888 (1990) для разделения тканей головного мозга на паренхиматозную фракцию и фракцию капилляров головного мозга. Результаты фракционирования показали, что 87% пептида ПОСЛ. ИД. №:2, присутствовавшего в головном мозге, было локализовано в паренхиме головного мозга, тогда как 13% было обнаружено в капиллярах головного мозга.

Таблица 6
Ткань	Масса	Общая радиоактивность в ткани, Бк	Процент от исходной радиоактивности
Головной мозг	1,3 г	161000	0,050
Печень	8,8 г	5,2×106	1,625
Кровь	около 22 мкл	1,01×108	31,6

В сходном эксперименте, в котором крыс забивали через три часа после обработки ПОСЛ. ИД. №:2, в головным мозге обнаруживали 0,06% пептида, из которых 85% содержалось в паренхиме. Данные результаты показывают, что, по крайней мере, часть производного просапозина пептида ПОСЛ. ИД. №:2 проникала через гематоэнцефалический барьер и концентрировалась преимущественно в паренхиме головного мозга, нежели в сосудистом эндотелии (кровеносных сосудов). Процентное количество пептида, которое проникало через гематоэнцефалический барьер, лежит в середине интервала аналогичных значений для пептидов, которые проникают через барьер, как изложено в Banks, supra, 1992.

В целях определения процента интактного вещества в головном мозге, печени и крови помеченное радиоактивной меткой вещество (ПОСЛ. ИД. №:2), выделенное из тканей, анализировали по методу жидкостной хроматографии высокого давления. Для уравнивания процесса разрушения во время обработки гомогенатов ткани к гомогенатам ткани добавляли пептид ПОСЛ. ИД. №:2. Наблюдаемую степень разрушения добавленного пептидного вещества применяли для уравнивания процесса разрушения во время обработки ткани. После уравнивания результаты были следующими: приблизительно 60% ПОСЛ. ИД. №:2 было интактным в головном мозге; приблизительно 80% было интактным в печени; и приблизительно 40% было интактным в крови. Во втором эксперименте приблизительно 68% пептида ПОСЛ. ИД. №:2 было интактным в головном мозге. Данные результаты указывают на то, что пептид ПОСЛ. ИД. №:2 проникает через гематоэнцефалический барьер и в значительной степени присутствует в головном мозге в интактном виде.

Пример III

Облегчение нейропатической боли у крыс, страдающих сахарным диабетом

Данный пример описывает эффекты интраперитонеального введения пептида, имеющего последовательность ПОСЛ. ИД. №:2, в модели диабетической невропатии у крыс.

У крыс индуцировали сахарный диабет однократной интраперитонеальной инъекцией стрептозотоцина (50 мг/кг массы тела, свежий раствор в 0,9% стерильного солевого раствора) для нарушения функции β-клеток поджелудочной железы и вызывания инсулиновой недостаточности, как описано в Calcutt et al.. Pain 68:293-299 (1996). Через двое суток у крыс, инъецированных стрептозотоцином, сформировывался сахарный диабет, судя по измерению уровней содержания глюкозы в крови. Инъецированные стрептозотоцином животные с уровнем содержания глюкозы в крови менее чем 15 ммоль/л, исключались из дальнейших исследований в соответствии с общепринятым в исследованиях сахарного диабета на крысах определением non-fasting гипергликемии.

Как страдающих диабетом, так и контрольных крыс исследовали в течение 8 недель путем анализа поведенческой реакции на вредное соединение формалин как индикатор allodynia (Calcutt et al., supra, 1996). Схема анализа: крысам проводили инъекцию свежеприготовленного формалина (50 мкл 0,5% раствора в стерильном солевом растворе) в заднюю поверхность правой задней конечности. Данная концентрация формалина вызывает субмаксимальные поведенческие реакции у контрольных крыс и позволяет определять гиперальгезию у крыс, страдающих сахарным диабетом, во время фаз Q и 2 (Caicutt et al., Eur. J. Pharmacol. 285:189-197 (1995)). Животных переносили в обсервационную камеру, сконструированную таким образом, чтобы обеспечить постоянную визуализацию конечностей. Наблюдатель, который не знал, к какой группе обработки относится каждое животное, подсчитывал число вздрагиваний в течение одноминутных периодов с 5-минутными интервалами в течение последующих 60 минут. Фазу 1 определяли как первоначальный подсчет числа вздрагиваний (1-2 и 5-6 минуты после инъекции); фазу Q (покоя) как измерения, сделанные на 10-11, 15-16 и 20-21 минутах; и Фазу 2 как все последующие после инъекции измерения, как ранее было определено для исследований на крысах, страдающих сахарным диабетом, (см., например, Malmberg et al., Neurosci. Lett. 161:45-48 (1993)). Сравнения активности в течение каждой фазы проводили путем суммирования вздрагиваний в точках измерения в течение фазы. Крысы, страдающие сахарным диабетом, проявляли аномальную реакцию вздрагивания, как сообщалось ранее.

Пептид ПОСЛ. ИД. №:2 получали в чистом виде путем химического синтеза, растворяли в стерильном PBS и забуферивали до нейтрального значения рН. Крыс, страдающих сахарным диабетом, подразделяли на три группы по четыре животных в каждой, которым вводили солевой раствор или пептид ПОСЛ. ИД. №:2 соответственно. За два часа до обработки 0,5% формалином крыс, страдающих сахарным диабетом, обрабатывали солевым раствором или 200 мкг/кг пептида ПОСЛ. ИД. №:2, применяя внутрибрюшинное введение. Как показано на Фигуре 3, введение пептида ПОСЛ. ИД. №:2 полностью предотвращало аномальную реакцию вздрагивания в Фазе 1 и улучшало реакцию в Фазе 2 на 70%. Таким образом, парентеральное введение пептида ПОСЛ. ИД. №:2 облегчало боль, вызванную инъекцией формалина, в модели болезненной диабетической невропатии на крысах.

Пример IV

Стимулирование роста нейритов In vitro

Данный пример описывает применение пептида, обладающего последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, в стимулировании роста нейритов In vitro.

Клетки нейробластомы NS20Y выращивают в DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Клетки выделяют трипсином и высевают в 30 мм чашках Петри на стеклянные покровные стекла. По прошествии от 20 до 24 часов среду заменяют 2 мл DMEM, содержащей 0,5% фетальной телячьей сыворотки с 0, 0,5, 1, 2, 4 или 8 нг/мл пептида, обладающего последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, или scrambled контрольного пептида. Клетки культивируют еще в течение 24 часов, промывают PBS и фиксируют раствором Bouin (насыщенная водная пикриновая кислота/формалин/уксусная кислота 15:5:1) в течение 30 минут. После того как фиксирующий раствор удаляют PBS, рост нейритов оценивают с помощью фазово-контрастного микроскопа. Клетки, демонстрирующие один или несколько ясно определенных нейронов, равных по длине или более длинных, чем один диаметр клетки, расцениваются как давшие положительный результат по росту нейритов. Для определения процента нейрит-несущих клеток оценивают, по крайней мере, 200 клеток в различных положениях каждой чашки, причем анализ по каждому пептиду выполняют дважды.

Пептид, показанный в ПОСЛ. ИД. №:2, значительно усиливает рост нейритов в клетках NS20Y по сравнению с scrambled контрольным пептидом, содержащим те же аминокислоты в том же порядке. Усиление роста нейритов становится очевидным при применении уже 0,5 нг/мл пептида.

Пример V

Ингибирование гибели нейронов in vitro

Данный пример описывает применение пептида, обладающего последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, в ингибировании гибели нейронов in vitro.

Клетки NS20Y высевают, как описано в примере IV, и культивируют на стеклянных покровных стеклах в 0,5% фетальной телячьей сыворотке в течение 2 суток в присутствии или в отсутствие 8 нг/мл пептида, обладающего последовательностью ПОСЛ. ИД. №: 2, или scrambled контрольного пептида. Среду удаляют и в каждую лунку добавляют 0,2% трипановый синий в PBS. Погибшие клетки окрашиваются в синий цвет красителем трипановым синим и оцениваются как процент от общего с помощью инвертированного микроскопа, учитывая 400 клеток в четырех областях каждой лунки. Ошибка средней повторов составляет±5%. Пептид, показанный в ПОСЛ. ИД. №:2, значительно сокращает количество положительно окрашивающихся трипановым синим (погибших) клеток. Это указывает на то, что пептид, обладающий последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, способен ингибировать запрограммированную гибель клеток.

Пример VI

Анализ миелинизации ex vivo

Данный пример описывает применение пептида, обладающего последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, в стимулировании роста нейритов ex vivo и в стимулировании миелинизации.

Эксплантаты мозжечка новорожденных мышей получают в соответствии с Satomi, Zool. Sci. 9:127-137 (1992). В культуре в течение 22 суток наблюдают за процессами роста нейритов и миелинизации - периода, когда мозжечок новорожденных мышей обычно претерпевает дифференцировку нейронов, и начинается миелинизация. На вторые сутки после приготовления эксплантатов к трем эксплантатам добавляют пептид, обладающий последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, в концентрации 10 мкг/мл, и эксплантатов к трем эксплантатам добавляют scrambled контрольный пептид в концентрации 10 мкг/мл. Процессы роста нейритов и миелинизации в трех контрольных и трех обработанных эксплантатах оценивают под светлопольным микроскопом, оснащенным видеокамерой. На восьмые сутки культуры, содержащие пептиды, выглядят более тонкими и более разбросанными, чем контрольные культуры. На 15 сутки культуры, обработанные пептидом ПОСЛ. ИД. №:2, содержат множество клеток с длинными выростами на периферии эксплантата. Такие выросты отсутствуют или выступают в меньшей степени в контрольных культурах. Культуры, обработанные пептидом ПОСЛ. ИД. №:2, к 22 суткам содержат значительно большее количество миелинизированных нейритов в подкорковом белом веществе по сравнению с контрольными эксплантатами. Таким образом, пептид по данному изобретению индуцирует миелинизацию в претерпевающем дифференцировку мозжечке ex vivo.

Пример VII

Ингибирование демиелинизации

Снижение частоты гибели шванновских клеток коррелирует с ингибированием демиелинизации. Шванновские клетки содержат протяженное миелиновое покрытие. Добавление пептида, показанного в ПОСЛ. ИД. №:2, к шванновским клеткам в культуре снижает частоту гибели шванновских клеток в зависимости от дозы, что не наблюдается при добавлении контрольного scrambled пептида. Таким образом, пептид, обладающий последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, способен ингибировать демиелинизацию.

Пример VIII

Лечение травматических ишемических поражений ЦНС

Люди с травматическими повреждениями спинного мозга получали инъекцию в цереброспинальную жидкость или прямую инъекцию приблизительно 100 мкг/мл пептида, показанного в ПОСЛ. ИД. №:2, в стерильном солевом растворе или в депонированной форме для обеспечения медленного непрерывного высвобождения пептида в очаге повреждения. Улучшение состояния оценивают по улучшению функционирования двигательного нерва, такому как повышенная подвижность конечности. Обработки продолжают до тех пор, пока улучшение не заканчивается.

Пример IX

Лечение демиелинизирующих заболеваний

Пациенты с диагностированной ранней стадией MS получают пептид, обладающий последовательностью ПОСЛ. ИД. №:2, путем прямой внутривенной инъекции в цереброспинальную жидкость с применением того же интервала дозировок, что и в примере VIII. Дозы вводят ежесуточно или еженедельно, и наблюдается улучшение в мышечной силе, мышечно-скелетной координации и процессе миелинизации (что определяется по методу MRI).

Пример Х

Лечение чувствительной (сенсорной) невропатии

Мышам вводили таксол в целях вызывания чувствительной невропатии. Обработанным таксолом мышам вводили 100 мкг/кг, 200 мкг/кг или 1 мг/кг пептида производного просапозина ПОСЛ. ИД. №:2. Потерю температурной чувствительности измеряли, применяя в качестве индикатора чувствительной невропатии аппарат тестирования чувствительности Hargreaves. Каждая из трех введенных дозировок пептида ПОСЛ. ИД. №:2 была эффективна в ингибировании потери температурной чувствительности у обработанных таксолом мышей. Производный просапозина 22-мерный пептид ПОСЛ. ИД. №:1 был подвергнут сходному анализу и обнаружил эффективность в ингибировании потери температурной чувствительности у обработанных таксолом мышей. Данные результаты показывают, что пептиды производные просапозина, такие как ПОСЛ. ИД. №:1 и ПОСЛ. ИД. №:2, могут быть применены для эффективного ингибирования чувствительной невропатии.

Хотя данное изобретение было описано со ссылкой на приведенные выше примеры, следует понимать, что могут быть произведены различные модификации без выхода за рамки сущности изобретения. Соответственно данное изобретение ограничивается лишь следующей ниже формулой изобретения.

Список последовательностей.

(1) Общая информация:

(I) Заявитель: Администрация Университета Калифорнии (Regents of the University of California).

(II) Название изобретения: Способы облегчения нейропатической боли с применением пептидов, являющихся производными просапозина.

(III) Количество последовательностей: 21

(IV) Адрес для корреспонденции:

(A) Адресат: Campbell and Flores

(B) Улица: 4370 La Jolla Village Drive, Suite 700

(C) Город: San Diego

(D) Штат: California

(E) Государство: USA

(F) Индекс: 92122

(V) Форма, пригодная для прочтения компьютером:

(A) Тип носителя: Флоппи-диск

(B) Компьютер: IBM PC-совместимый

(C) Операционная система: PC-DOS/MS-DOS

(D) Программное обеспечение: Patent In выпуск 1.0, версия 1.25

(VI) Данные по настоящей заявке:

(А) Номер заявки:

(B) Дата регистрации: 05 марта 1997 года

(C) Классификация:

(VIII) Информация о поверенном/агенте:

(A) Имя: Campbell, Cathryn A.

(B) Регистрационный номер: 31815

(C) Номер reference/docket: FP-UD 2474

(IX) Информация о телекоммуникациях:

(A) Телефон: [phone]

(B) Телефакс: [phone]

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:1:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 аминокислоты

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:1:

Cys

Glu

Phe

Leu

Val

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

1

5

10

15

Thr

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:2:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(IX) Свойство:

(A) Имя/ключ: Пептид

(B) Положение: 2

(D) Другая информация: /примечание = "Хаа представляет собой D-аланин"

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:2:

Thr

Хаа

Leu

Ile

Asp

Asn

Asn

Ala

Thr

Glu

Glu

Ile

Leu

Tyr

1

5

10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №: 3:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 12 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №: 3;

Leu	Ile	Asp	Asn	Asn	Lys	Thr	Glu	Lys	Glu	Ile	Leu
1				5					10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:4:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 аминокислоты

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:4

Cys

Gln

Phe

Val

Met

Asn

Lys

Phe

Ser

Glu

Leu

Ile

Val

Asn

Asn

Ala

1

5

10

15

Thr

Glu

Glu

Leu

Leu

Tyr

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:5:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 21 аминокислота

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:5:

Cys

Gln

Leu

Val

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

Glu

Leu

Ile

Ile

Asn

Asn

Ala

1

5

10

15

Thr

Glu

Glu

Leu

Leu

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:6:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 аминокислоты

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:6;

Cys

Glu

Туг

Val

Val

Lys

Lys

Val

Met

Leu

Leu

Ile

Asp

Asn

Asn

Arg

1

5

10

15

Thr

Glu

Glu

Lys

He

He

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:7:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 аминокислоты

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:7:

Суз

Glu

Phe

Val

Val

Lys

Glu

Val

Ala

Lys

Leu

Ile

Asp

Asn

Asn

Arg

1

5

10

15

Thr

Glu

Glu

Glu

Ile

Leu

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:8:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 22 аминокислоты

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:8

Cys

Glu

Phe

Leu

Val

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Asp

Asp

Asn

Lys

1

5

10

15

Thr

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:9:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:9

Thr

Lys

Leu

Ile

Asp

Asn

Asp

Lys

Thr

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

1

5

10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:10:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 14 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:10

Thr

Lys

Ser

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Thr

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

1

5

10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:11:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 20 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:11

Tyr

Val

Lys

His

Gln

Gly

Leu

Asn

Lys

Asn

Ile

Asn

Leu

Asp

Ser

Val

1

5

10

15

Asp

Gly

Val

Pro

20

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:12:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 15 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:12

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Asn

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Met

Ala

Gly

1

5

10

15

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:13:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 17 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:13

Leu

Gln

Met

Ile

Leu

Asn

Gly

Ile

Asn

Asn

Tyr

Lys

Asn

Pro

Lys

Leu

1

5

10

15

Thr

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:14:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 12 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:14

Ile	Leu	Met	Glu	Asn	Asn	Leu	Arg	Arg	Pro	Asn	Leu
1				5					10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:15:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 13 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:15

Phe

Tyr

Leu

Arg

Asn

Asn

Gln

Leu

Val

Ala

Gly

Thr

Leu

1

5

10

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:16:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 17 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:16

Ala

Glu

His

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

1

5

10

15

Val

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:17:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 18 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:17

Tyr

Thr

Ala

Gln

Gly

Glu

Pro

Phe

Pro

Asn

Asn

Val

Glu

Lys

Leu

Cys

1

5

10

15

Ala

Pro

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:18:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 15 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:18

Phe

Asn

Lys

Ile

Glu

Ile

Asn

Asn

Lys

Leu

Glu

Phe

Glu

Ser

Ala

1

5

10

15

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №: 19:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 18 аминокислот

(B) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:19:

Arg

Pro

Asn

Ile

Leu

Gly

Leu

Arg

Asn

Asn

Ile

Tyr

Cys

Met

Ala

Gln

1

5

10

15

Leu

Leu

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:20:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 18 аминокислот

(В) Тип: аминокислотная

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:20:

Tyr

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Thr

Glu

Lys

Glu

1

5

10

15

Не

Leu

(2) Информация о ПОСЛ. ИД. №:21:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 66 пар оснований

(B) Тип: нуклеиновая кислота

(C) Количество цепей: две

(D) Топология: линейная

(XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. №:21:

TGTGAATTCC	TGGTGAAGGA	GGTGACCAAG	CTGATTGACA	ACAACAAGAC	TGAGAAAGAA	60
АТАСТС						66

1. Способ воздействия на нейродегенеративные нарушения и нарушения миелинизации у субъекта путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептида, содержащего аминокислотную последовательность Thr-R₁-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, где R₁ является D-аланином (SEQ ID N:2).

2. Способ по п.1, в котором указанные нарушения выбирают из группы, содержащей полиневропатию, мононевропатию, неврому, сдавливание нерва, травмах нерва, контузию, опухоль или неполное пересечение спинного мозга, инфаркт или травму стволового мозга, таламуса или коры головного мозга, сдавливание, разрыв или воспаление дорсальных корней ганглиев, постполиосиндром, травматическое или ишемическое нарушение центральной или периферической нервной системы, рассеянный склероз.

3. Способ по п.2, в котором полиневропатия представляет собой диабетическую периферийную невропатологию.

4. Способ по п.2, в котором полиневропатия представляет собой периферийную невропатологию, приобретенную в результате химиотерапии.

5. Способ по п.1, в котором указанными нарушениями являются ишемические нарушения в центральной или периферической нервной системе.

6. Способ по п.1, в котором указанный пептид находится в форме, приемлемой для введения путем, выбранным из группы, включающей внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, подкожное, интракраниальное, в цереброспинальную жидкость, местное, пероральное, чрескожное трансмукозальное или интраназальное введение.