Применение пористого носителя

Изобретение относится к медицине, а именно к пористому керамическому носителю, включающему состоящий из несущих слоев и поперечных элементов-распорок связный каркас, имеющий поры, размер большинства которых находится в диапазоне от около 20 до около 1000 микрон и обладающий плотностью менее чем 40% от теоретической. Объем указанных пор может быть заполнен лекарственным препаратом, при этом скорость высвобождения лекарственного препарата из носителя регулируется. Носитель по настоящему изобретению наиболее эффективным образом обеспечивает контролируемое высвобождение активного начала. 29 з. п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к применениям пористого носителя, главным образом, в медицине в качестве носителя лекарственных средств.

В своем патенте ЕР 0598783 В (Ссылочный номер в агентстве: Р 00914 РСТ(ЕР)) заявитель данного изобретения описал и заявил в формуле:

«способ изготовления пористого огнеупорного изделия, состоящего из огнеупорных частиц, где способ включает стадии:

a) образования дисперсии, содержащей частицы в жидком носителе;

b) введения газа в дисперсию;

c) удаления жидкого носителя для обеспечения твердого изделия, имеющего поры, полученные из пузырьков;

d) сушки; и

e) обжига,

отличающийся тем, что дисперсия содержит полимеризуемый мономерный материал».

В своей заявке на патент WO 98/15505 (Ссылочный номер в агентстве: Р 01885 РСТ) заявитель данного изобретения описал и заявил в формуле:

«способ изготовления пористого изделия, состоящего из связанных частиц (таких как частицы гидроксиапатита или подобные), где способ включает стадии:

a) образования дисперсии, содержащей жидкий носитель и частицы и полимеризуемый мономерный материал;

b) образования пены из дисперсии;

c) полимеризации вспененной структуры;

в) сушки структуры для удаления жидкого носителя и обеспечения твердого изделия, имеющего поры, полученные из пузырьков, и

е) обжига изделия для удаления органического связующего и обеспечения керамической связи, отличающийся тем, что в дисперсию при перемешивании вводят небольшие пузырьки газа для образования пены и вызова коалесценции перед полимеризацией мономерного материала».

Более конкретно, в WO 98/15505 заявитель данного изобретения описал и заявил в формуле:

«способ изготовления пористого изделия, состоящего из связанных частиц, способ включает стадии:

a) образования дисперсии, содержащей жидкий носитель и частицы и полимеризуемый мономерный материал;

b) образования пены из дисперсии;

c) полимеризации вспененной структуры;

d) сушки структуры для удаления жидкого носителя и обеспечения твердого изделия, имеющего поры, полученные из пузырьков, и

e) обжига изделия для удаления органического связующего и обеспечения керамической связи, отличающейся тем, что в дисперсию при перемешивании вводят небольшие пузырьки газа для образования пены и вызова коалесценции перед полимеризацией и тем, что обжиг осуществляют при температуре, подходящей для обеспечения роста костных клеток».

В своей заявке на патент GB 0009731.1 (ссылка заявителя: P 02810 GB) заявитель описал и заявил в формуле способ изготовления керамической пены экструзией при низком давлении. Вспененная керамика, изготовленная указанным способом, пригодна в настоящем изобретении.

Заявитель подразумевает, что полные описания указанных более ранних заявок включены в данное описание посредством только данных ссылок.

В настоящее время было неожиданно обнаружено, что структура пористого носителя, изготовленного способами в соответствии с ранними заявками, делает носитель в особенности подходящим для несения широкого диапазона материалов и обеспечивает контроль над тем, каким образом могут быть высвобождены несомые материалы.

В соответствии с одним аспектом изобретения предлагается предварительно формованный пористый керамический носитель, включающий связанный каркас, имеющий поры, размер большинства которых находится в диапазоне от около 20 до около 1000 микрон, при этом носитель имеет плотность менее 40% от теоретической, а поры содержат в себе второй материал, причем скорость высвобождения второго материала из носителя регулируется.

В соответствии с данным изобретением носитель включает предварительно сформованную пористую керамическую сетку, включающую связный каркас, имеющий поры, размер большинства которых находится в диапазоне от около 20 до около 1000 микрон, и плотность менее 40% от теоретической. Каркас состоит из несущих слоев и поперечных элементов-распорок. Распределение пор по размерам является регулируемым, при этом средний размер пор находится в диапазоне от 50 до 800, предпочтительно от 60 до 650 микрон. Размер пор оптимизируют для удовлетворения конкретным применениям. Так, например, при общей инфильтрации клеток и васкуляризации является подходящим носитель, имеющий поры в диапазоне от около 50 до около 1000 микрон, тогда как при прорастании костной клетки внутрь предпочтительны поры с размерами в диапазоне от около 100 до около 500 микрон. Поры, необходимые для оседания в них разлагаемых материалов, должны иметь больший размер, чтобы быть приспособленными к толщине или осаждению слоя. Такой носитель может быть изготовлен способом в соответствии с вышецитированными патентами и заявками на патент.

Носитель имеет по существу полностью связную пористость при плотностях менее 30% от теоретической плотности. Плотность может находиться в диапазоне от около 10% до около 40%, предпочтительно около 30%. Когда плотность составляет менее 10% от теоретической, тогда наблюдается потеря прочности и носитель становится хрупким. Если теоретическая плотность превышает 40%, связность не может быть полной и не могут быть достигнуты размеры пор. Плотность определяется физическим измерением массы и объема. Теоретическое значение взято из литературы.

Керамический носитель может быть изготовлен из частиц, таких как частицы оксидов и не оксидных частиц. Указанные материалы являются водостойкими по своей природе или имеют поверхностное покрытие, которое является стойким к условиям процесса. Используемые материалы включают оксид алюминия, циркон, шпинель, карбид кремния, оксид олова, NZP, гидроксиапатит или другие производные фосфата кальция, оксид циркония, кианит, кордиерит и подобные материалы. Когда носитель используется для медицинских целей, керамика может быть полностью или частично рассасываемой. Процесс резорбции включает устранение материалов первоначального имплантата через действие общей воды (жидких сред) в организме, ферментов или клеток. Резорбированный фосфат кальция может быть, например, осажден повторно в виде костного минерала, или иным образом повторно использован в организме, или выделен.

Предварительно сформованный пористый керамический носитель имеет регулируемую степень сетчатости. Сетчатость должна быть высокой, чтобы уменьшить градиент давления, создаваемый при инфильтрации, и свести к минимуму уровень дефектов, связанных с дифференциальным тепловым сжатием при охлаждении.

Плотность вспененной керамики предпочтительно составляет менее 30%, что обеспечивает по существу полностью связную пористость. Более высокие значения могут быть пригодны в таких обстоятельствах, при которых по причине прочности или проницаемости необходим более плотный материал.

Указанные более плотные материалы, т.е. плотность которых выше 30% от теоретической плотности, а в случае метода пенообразования, основанного на перемешивании, она ограничена максимальным значением 60%, могут быть нанесены на менее плотные материалы в необоженном или обоженном состоянии для создания в пористом изделии градиентов плотности. Перед использованием изделие необходимо подвергнуть обжигу. Для соответствия применению толщина слоев может варьироваться.

Слои в диапазоне от слоев с повышенной плотностью до полностью плотных слоев могут быть нанесены на вспененную керамику в необожженном состоянии технологическими методами, такими как отливка из геля, литье коагуляцией. Формованное изделие перед использованием необходимо подвергнуть обжигу.

Соотношения двух фаз можно легко отрегулировать таким образом, чтобы вспененная керамика по объему составляла основной компонент от объема сформованного тела или второй фазы, например металлической фазы.

Полностью связная пористая структура делает возможным глубокое проникновение в поры носителя. Проникающий материал может образовать отдельную непрерывную матрицу или он может быть просто осажден на внутренних стенках.

Подлежащий введению в поры материал может быть выбран из широкого множества материалов. Они включают факторы роста, такие как гормон фактора роста или морфогенетические белки; макрофаги; антибиотики, такие как пенициллин, тетрациклин, нистатин; витамины, такие как витамин D; белки, такие как полипептиды, протеины; гормоны и т.д. Специфические материалы включают:

- материал для роста кости

- FGF (фактор роста фибробласта)

- IGF-I (инсулиноподобный фактор роста I)

- IGF-II (инсулиноподобный фактор роста II)

- PDGF (фактор роста, полученный из тромбоцитов)

- TGF-B (трансформирующий фактор роста)

- BMP-Z (морфогенетический белок кости)

- HGH (человеческий гормон роста)

- концентрации факторов роста, полученных от человека.

Другие примеры включают, по меньшей мере, одну клетку, которая является костеобразующей или костеразрушающей клеткой. В особенности пригодные типы клеток включают хондроциты, остеоциты, остеобласты, остеокласты, мезенхиальные эмбриональные клетки, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты, паренхимальные клетки, клетки кишечника, нервные клетки и кожные клетки и они могут быть предусмотрены в виде первичных тканевых эксплантатов, препаратов первичных тканевых эксплантатов, выделенных клеток, клеточных линий, трансформированных клеточных линий и клеток «хозяина». Материал может быть также химиотерапевтическим средством или непроницаемым для рентгеновских лучей средством. Создан ряд систем доставки противоракового лекарственного средства пролонгированного действия, в которых в качестве носителя применяется биоматериал, такой как углеродные частицы, сложный этиловый эфир иодированных жирных кислот масла макового семени и фибриновый сгусток, предназначенных для доставки химиотерапевтических средств при высоких концентрациях в течение длительных периодов времени и уменьшения системных побочных эффектов, и данные средства могут быть также включены.

Таким образом, изобретение может обеспечить средства для введения биосовместимой керамики в тело человека или животного, чтобы обеспечить локализованный источник лекарственных средств с регулируемой скоростью высвобождения и обеспечить более эффективное лечение различных болезней. Изобретение в особенности дает возможность осуществить эффективное лечение разновидностей рака и опухолей и сводит к минимуму побочные эффекты за счет локализации лечения специфических участков в организме химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин, или рентгенографического лечения радиоактивными средствами, такими как стронций-67 или самарий-153. В некоторых случаях указанные средства предпочтительно фиксированы в порах.

Остеосаркома представляет злокачественную опухоль кости, при которой нормальная костная ткань разрушена и за счет аномального разрастания стромы веретенообразной клетки образуется опухолевая остеоидная ткань. Она является обычной первичной злокачественной опухолью кости. Вспомогательная химиотерапия, т.е. хирургия с последующей химиотерапией, такой как антиметаболиты, помогает предотвратить микрометастатические опухоли и локальное повторное появление, в то время как обеспечивается возможность непрерывного роста кости, в результате их селективности в отношении опухолевых клеток. Антиметаболиты представляют средства, которые вмешиваются в нормальный метаболизм, вследствие их структурной схожести с обычными промежуточными соединениями синтеза предшественников РНК и ДНК. Они или служат в качестве субстратов для ферментов, или ингибируют ферменты, или осуществляют обе функции. Вследствие разницы в метаболизме нормальных и раковых клеток, несколько антиметаболитов обладают возможностью действовать с определенной степенью специфичности на раковые клетки.

Метотрексат (МТХ), или 4-амино 10-метиловый аналог фолиевой кислоты, остается наиболее широко используемым антифолатом в химиотерапии рака, имеющим подтвержденную документами активность против лейкемии, рака молочной железы, рака головного мозга и шеи, лимфомы, уротелиального рака, хориокарциномы и остеосаркомы. Данный класс средств представляют наиболее хорошо охарактеризованные и наиболее многосторонние средства из всех химиотерапевтических средств, применяемых в клинической практике. МТХ является прочносвязывающим ингибитором дигидрофолатредуктазы (DHFR), являющейся важным ферментом для сохранения внутриклеточного фолатного пула в его полностью восстановленной форме в виде тетрагидрофолатов.

МТХ наиболее активен против быстро разрастающихся клеток, поскольку цитотоксические действия происходят в основном в течение S-фазы клеточного цикла. Во время более продолжительного действия лекарственного средства большему количеству клеток дается возможность вступать в фазу синтеза ДНК в клеточном цикле, что приводит к большей гибели клеток. К тому же, при более длительных периодах действия лекарственного средства образование полиглутамата МТХ в значительной степени усиливается, вследствие чего цитотоксичность возрастает. С повышением концентраций лекарственного средства цитотоксические эффекты МТХ также усиливаются. Следовательно, цитотоксичность МТХ в значительной степени зависит от абсолютной концентрации лекарственного средства и от продолжительности его действия. Поэтому с начала 70-х годов введение для лечения остеосаркомы осуществляют при высоких дозах (1-33 г/м²).

Носитель является таким, который обладает биосовместимостью, т.е. «способностью материала осуществлять специфическую биологическую активность или вызывать подходящую реакцию для достижения полномасштабного и эффективного функционирования для конкретного применения».

Биоматериал должен быть приемлемым, биологически признанным и скорее биоактивным, чем абсолютно инертным. Выполнение указанных требований приведет к созданию биоматериалов «второго поколения», которые предназначены для выполнения конкретной цели, состоящей в том, что биоматериал должен вызывать положительную специфическую реакцию определенных клеток и тканей в местоположении имплантата, находящегося в теле. Таким образом, они могут усилить стимуляцию остеобластов для быстрого отложения минерализованной матрицы кости на поверхность вновь имплантированного протеза или вблизи аппозиции и обеспечить лучшую оссеоинтеграцию. Один такой биоматериал, обладающий данными свойствами, представляет собой гидроксилированную кальцийфосфатную керамику или гидроксиапатит (ГА) (НА).

ГА является биосовместимым, биоактивным материалом, который вызывает незначительную иммуногенную реакцию. ГА также обладает оссеопроводимостью, т.е. способностью стимулировать рост кости непосредственно по его поверхности или по направлению к ней, когда он помещен вблизи жизнеспособной кости или клеток, формирующих дифференцированную кость. Кроме того, можно обеспечить рост смещенного края заживляющей костной мозоли обеспечением механически поддерживающей решетки, на которой может расти новая кость. Давно было установлено, что кристаллические структуры синтетического ГА и неорганического компонента кости - костного минерала, удивительно подобны, и было показано, что между ГА и костью образуется механическая связь, обладающая значительной прочностью. Данное свойство вызывало большой интерес при его потенциальном применении в качестве биоматериала для устранения костных дефектов, поскольку он обеспечивает возможность непосредственного химического связывания кости, т.е. ускоряет оседание костной ткани на поверхность.

Несмотря на указанные интересные и полезные свойства, вследствие плохой способности ГА нести нагрузку, биомеханическое несовпадение и низкая механическая эффективность данных материалов остаются проблемой. Поэтому клиническое применение ограничено применениями, в которых кальцийфосфатная керамика проявляет биоактивность на почти инертных имплантатах (например, покрытия на металлических протезах) или в дефектах, которые встречаются на участках, несущих небольшую массу, например на челюстно-лицевых областях.

Кроме способности укреплять кость, ГА также способен легко адсорбировать на свою поверхность биологические факторы и возможные химические соединения. В зависимости от структуры молекулы и химии поверхности конкретного ГА, такая адсорбция может происходить в виде физической адсорбции и химической адсорбции. Количество адсорбированного химического соединения может соответствовать нескольким монослоям на поверхности.

При использовании ГА можно достигнуть превосходных биоактивных свойств при его присутствии в отдельности и в комбинации со средствами, влияющими на ткань, адсорбированными на его поверхности и подлежащими высвобождению в организме при терапевтических концентрациях, например такими, как антибиотики и противораковые средства. Его целевые применения будут стимулировать укрепление и восстановление функции ткани (например, костной ткани) и создавать биоактивное взаимодействие в устойчивом равновесном состоянии (например, усиленную оссеоинтеграцию) при сохранении природной активности окружающих клеток и тканей в их среде (например, костных клеток) и разрушении в то же время нежелательных тканей, таких как опухолевая, или бактериальных клеток.

Отличительная особенность данного изобретения состоит в том, что когда ГА присутствует в виде определенного выше носителя, достигаются требуемые преимущества.

Цель применения системы доставки лекарственного средства состоит в достижении оптимальной местной дозы в специфическом желательном участке. Обычно введение лекарственного средства (или перорально или внутривенно) осуществляют в зоны, удаленные от целевой ткани, и поэтому уровень лекарственного средства и длительность биодоступности невозможно контролировать независимо, и лекарственное средство свободно диффундирует по организму, что может привести к системным проблемам и осложнениям. Указанные системы нацелены на увеличение биодоступности лекарственных средств и факторов и, следовательно, обеспечивают возможность более эффективного и регулируемого действия на определенных участках в течение некоторого времени. Регулируемое высвобождение часто приравнивается к модели с двухфазным высвобождением, где быстрое высвобождение достигается во время ранней фазы, а затем во время более поздней фазы происходит замедленное пролонгированное высвобождение.

Эксперименты, составляющие часть данного изобретения, показали эффективность ГА для доставки антибиотиков и лечения кости после выскабливания инфицированной кости. Блоки ГА, нагруженные химиотерапевтическим средством, могут быть также полезными для заполнения трансплантатов после выскабливания костных опухолей. Такая система обеспечит достижение оптимальных химиотерапевтических эффектов за счет подвержения опухоли воздействию высокой концентрации противоракового средства в течение продолжительных периодов времени для уменьшения разрастания всех локальных раковых клеток и их гибели. В соответствии с данным изобретением постулируется, что локализованное и пролонгированное высвобождение может быть достигнуто более легко за счет использования связанной пористой структуры ГА, имеющей способность адсорбировать вещества на ее поверхности. Пористая структура обеспечивает большую удельную поверхность для адсорбции лекарственного средства и, таким образом, высвобождения в организме при десорбции. Лекарственные средства могут быть любыми из вышеперечисленных и иными, например сополимерами молочной и гликолевой кислоты, PEMfTHEMA, желатином и фибриновым клеем.

Местное введение через ГА является выполнимым и эффективным для локального контроля кости и опухолей мягкой ткани по причине безопасного введения лекарственного средства, более легкой оценки химиотерапевтического эффекта, предотвращения местного повторного появления и низкой частоты системных побочных эффектов.

Кроме того, ГА носитель в соответствии с изобретением показывает превосходную биосовместимость и механические и химические свойства, подобные свойствам кости, что обеспечивает возможность включения ткани и васкуляризации. Он проявляет оссеопроводящие и оссеоиндуктивные свойства, действуя в качестве костного трансплантата или имплантатного покрытия, помогающего избежать необходимости использования донорских участков, которые часто вызывают заболевание пациента. Указанные свойства дают возможность остеобластам мигрировать и прорастать в пористое покрытие имплантата, создавать сцепляющую связь, которая ограничивает движение между имплантатом и костью и поэтому повышает устойчивость протеза, в то время как высвобожденное лекарственное средство осуществляет свое химиотерапевтическое действие.

Следовательно, в соответствии с изобретением ГА, пропитанный химиотерапевтическими средствами, может быть использован после удаления опухоли для заполнения повреждений на участках, не несущих массу, таких как участки в передней, затылочной долях головного мозга, верхней и нижней челюсти лица, или участках, несущих массу, при включении в протез в терапии для спасения конечностей.

МТХ может быть использован в качестве противоракового средства в блоках ГА, вследствие его доказанной эффективности против остеосаркомы, легкости обнаружения по сравнению с другими противораковыми средствами и его относительной селективности в отношении опухолевых клеток. Кроме того, при изучении кинетики элюирования комплекса ГА-МТХ заявитель также оценил цитотоксические эффекты повышенной концентрации и время действия лекарственного средства (выше продолжительности действия при системном введении, составляющей от 24 до 42 часов) на остеобласты и два вида клеток остеосаркомы, чтобы оценить будут ли повышенное время действия и повышенная концентрация МТХ более эффективными при лечении остеосаркомы, но не будут ли они влиять на разрастание остеобластов. Его изучали потому, что МТХ является одним из нескольких химиотерапевтических средств, исследования которого показали селективность в отношении опухолевых клеток, по соотношению концентрация - эффект и время эффекта. Идея системы МТХ-ГА предусматривает повышенную концентрацию и время действия при минимальном воздействии на другую ткань; данные свойства МТХ должны быть показаны с целью утверждения системы ГА-МТХ для потенциального использования в клинической практике.

Носитель может содержать в своих порах иные материалы, чем вышеперечисленные лекарственные средства. Такие другие материалы включают координационные комплексы типа комплексов Вернера (например, гексаминовые соли кобальта (III), трис(фенантролиновые) соли железа (II), цисплатин, карбоплатин и оксалиплатен, комплексы EDTA), макроциклические комплексы (например, металлопорфирины), металлоцены и сэндвичевые комплексы (например, ферроцен и титаноцен) и металлоорганические комплексы (например, метилкобаламин).

Регулирование предпочтительно осуществляют таким образом, чтобы замедлить скорость высвобождения.

Контроль может быть осуществлен широким множеством способов. Один предпочтительный способ состоит в модификации поверхностных свойств стенок пор. Поверхностные свойства стенок могут также модифицироваться некоторыми из агентов. Модификацию можно осуществить:

i) пропиткой поверхности растворами, содержащими металлоорганические или неорганические соли. Могут быть использованы различные методы пропитки, такие как начальное смачивание, простая пропитка, вакуумная пропитка, пропитка/осаждение и т.д., для того, чтобы установить требуемую концентрацию неорганических/металлоорганических солей на поверхности. Могут присутствовать промоторы, т.е. материал или обработка, которые ускоряют отвердение гидратированного предшественника для улучшения превращения фосфата кальция. Поверхностная концентрация ионов кальция в пористом гидроксиапатитовом изделии, в случае необходимости, может быть повышена пропиткой пористого изделия раствором, содержащим ионы кальция, сушкой и нагревом до повышенной температуры или включением кальциевой соли в исходный состав пористого изделия. Такая модификация обеспечивает повышенную адсорбцию материала, такого как сложные эфиры фосфоновой кислоты. Модификация может быть осуществлена для предварительно сформованного носителя в виде последующей обработки или для частиц, подлежащих связыванию вместе в форме изделия; или

ii) обжигом носителя до температуры ниже той, которая необходима для полного спекания керамики. Значение температуры будет зависеть от природы материала, из которого изготовлен носитель;

iii) обработкой поверхности кислотой или щелочью, например, азотной кислотой, фосфорной кислотой, каустиком, выбранными в соответствии с материалом носителя, или обработкой плазмой или действием химического осаждения из паровой фазы;

iv) помещением второго материала на разлагаемую подложку, например биоразлагаемую подложку, такую как коллаген или полимер, или подобную подложку. Специфические разлагаемые полимеры включают в контексте PCPP.SA (поли(карбоксифенокси)пропансебациновую кислоту), РСС, CPP.SA, FAD-SAPTMC, PAA и подобные. В общем смысле являются подходящими полиангидриды, сложные полиортоэфиры, полилактиды и полигликолиды и их сополимеры.

Использование разлагаемой промежуточной подложки является привлекательным, поскольку она настолько универсальна, что осадок может быть наслоен разными способами, например:

- чередованием слоев смолы или полимера, не содержащих средство, или слоев, содержащих средство;

- изменением концентрации средства в различных слоях смолы или полимера.

Носитель может быть заполнен множеством способов с использованием вакуума или давления или того и другого. Указанные слои могут быть созданы обычной последовательной пропиткой, начальным смачиванием или другими методами, известными специалистам в данной области, если требуется однородное распределение в организме. Если необходимо гетерогенное распределение, могут быть использованы другие методы. Так например, при использовании метода центробежной пропитки определенный слой может быть сконцентрирован на наружных участках вспененной керамики. Слои могут быть созданы механически внедрением кусков пены со специфическим агентом или лекарственным средством в пену, содержащую другой агент или лекарственное средство. Предпочтительна также сушка вымораживанием.

Лекарственные средства могут быть высвобождены в организме с точными дозами. Для пропитки пористого изделия будет использован любой биоразлагаемый мономер, включающий известные концентрации лекарственных средств, и затем полимеризован, или для пропитки пористого изделия будет использован полимер, включающий лекарственные средства.

Внешняя геометрическая поверхность и/или поверхность внутренних пор может быть покрыта биоразлагаемыми полимерами, включающими лекарственные средства, или более конкретно, противораковые средства. Данные полимеры могут заполнять пустоты в пористом изделии и действовать в качестве резервуара для средств замедленного высвобождения. Как уже указывалось, слои могут быть созданы таким образом, чтобы отдельные слои имели различные функции. Так, например, первый слой может содержать факторы роста, второй слой представлять чистый полимер, третий слой может включать противоопухолевые факторы, такие как цисплатин. Каждый слой может иметь различные скорости биоразлагаемости при изменении природы полимера для того, чтобы скорости высвобождения различных средств можно было регулировать и предсказывать.

Хотя изделие данного изобретения может быть сформовано для любого применения, предпочтительно, чтобы оно было сформовано для такой замены, как, например:

ортопедическая,

челюстно-лицевая или

черепно-лицевая,

или подобных.

Такие трансплантаты могут быть использованы, например, для:

- замещения сегментов кости после операции,

- заполнения больших потерь кости после травмы или инфекции,

- восстановления или реконструкции поврежденных суставов.

Кроме того, изделие изобретения может быть размещено в различных участках тела, например во внутримышечных участках, внутрибрюшинных участках, подкожных участках, областях центральной нервной системы и зрительной зоне.

Нет необходимости в том, чтобы материал был лекарственным средством, а вместо этого он может быть выбран из широкого множества материалов, таких как обычные химические вещества, продукты переработки нефти, взрывчатые вещества и т.д. Сетка вспененной керамики удерживает указанные материалы в жесткой матрице и таким образом защищает их от механического напряжения или подобных воздействий. Проникающий материал может быть также смолой. Так, например, матрица вспененной керамики может быть пропитана смолами, полимерами или смазывающими веществами до тех пор, пока пустоты заполнятся сплошной матрицей смолы, полимером или смазывающими веществами в непосредственном контакте с керамической матрицей. Выбор проникающего материала и керамики может быть оптимизирован для соответствия конечному применению в широком диапазоне отраслей промышленности, такому как легковесные структуры, абразивные формы, самосмазывающиеся керамические подшипники.

Пористая керамика может быть формована таким образом, что вставки из плотной керамики, такой как оксид алюминия или, возможно, металлов, могли быть помещены в место, в котором, возможно, необходима повышенная механическая прочность имплантата в ситуациях, требующих выдерживания предельных нагрузок. Керамическая или металлическая вставка могут быть размещены на одной или нескольких внешних поверхностях вспененной керамики или заключены в оболочку из вспененной керамики. Толщина такой оболочки может обычно находится в диапазоне от 1 мм до 10 мм, но она не ограничена только указанным диапазоном. Альтернативно, вспененная керамика может быть вставкой, содержащейся в плотной керамике или металле.

Для лучшего понимания изобретения далее оно будет описано с целью иллюстрации со ссылкой на следующие примеры.

Пример 1

Пористые ГА материалы изготавливали способом в соответствии с изобретением, который давал связную пористую керамику с максимальной механической прочностью за счет введения макропор в уплотненную матрицу в соответствии с вышеуказанными патентами Dytech. Указанные материалы доступны под фабричной маркой HI POR®. Во время процесса образования примеси не вводились. Хотя химический состав конечного продукта является таким же, как и состав ГА-продуктов, уже имеющихся на рынке, он получен методом, который обеспечивает уникальную физическую структуру. Образцы пористого ГА изготавливали в виде цилиндров (длиной примерно 13 мм и диаметром 6 мм). При исследовании использовали один тип ГА, имеющего плотность пор 18% и средний размер пор 300 мкм. Образцы пористого ГА, взятые в отдельности, указаны в описании как диски, а когда они нагружены лекарственными средствами для доставки, такими как МТХ, они указаны как «системы».

МТХ (David Bull Laboratories, Onco-Tain 25 мг/мл) был получен из клинического препарата, содержащего метотрексат В.Р. 0,25 мг, хлорид натрия В.Р. 0,49 мас./об.% гидроксид натрия. МТХ хранили при 4°С.

Затем 4 мл МТХ с концентрацией 25 мг/мл смешивали с 46 мл фосфатного буферного солевого раствора по Дульбекко (Sigma-D8537) и тщательно перемешивали с получением однородной смеси. Необходимо было следить за тем, чтобы МТХ не подвергался действию прямого света, так как он может изменить его химический состав.

48 ГА-дисков, каждый с размером пор 300 Дж. Im и плотностью 18%, помещали в 7 мл емкости Bijou (Sterilin cat. №1298), в каждую добавляли 1 мл смеси MTX/PBS и накрывали. Затем полностью погруженные образцы нагружали четырьмя разными способами.

Обычная абсорбция

Первый способ включал загрузку раствора МТХ обычной абсорбцией, которая давала пассивное внедрение в связывающие поры. Его осуществляли помещением 18 дисков в раствор МТХ в инкубаторе с температурой 37°С. Через 1 час нахождения в МТХ 6 дисков удаляли, следующие 6 дисков удаляли через 3 часа и последние 6 удаляли через 6 часов.

Вакуумная пропитка

Загрузку вакуумной пропиткой осуществляли помещением 18 дисков в вакуумную камеру (Angil Scientific, Cambridge England, №1506) при этом крышки емкостей Bijou открывали. Затем создавали вакуум при давлении 150 мбар, при этом в емкости создавалось отрицательное давление и обеспечивалась возможность экструзии МТХ через макро- и микропоры дисков. Через 1 час нахождения в вакууме 6 образцов удаляли из МТХ, через 2 часа удаляли еще 6 образцов и через 4 часа удаляли оставшиеся 6 образцов.

Центрифугирование

Оно включало помещение 6 дисков в емкости Bijou с плотно закрытыми крышками. Каждую емкость Bijou помещали в 50 мл полипропиленовую коническую трубку Blue Max (Becton Dickinson, 30×115 мм). Каждую коническую трубку плотно накрывали крышкой и помещали на 1 час в центрифугу (Centra-3, Damon/IEC, Bedfordshire, England, № 23670102), вращающуюся со скоростью 1000 оборотов в минуту. Каждую коническую трубку уравновешивали другим образцом, содержащимся в конической трубке.

Сушка вымораживанием

Она включала удаление крышек из емкостей Bijou с 6-ти образцами и помещение их в сушилку для сушки вымораживанием (Modulyo, Edwards, модель № 165005) при -60°С и давлении 8 мбар.

Все образцы помещали примерно на 24 часа и затем извлекали. Все системы удаляли из емкостей Bijou и давали возможность сушиться на воздухе в течение ночи в асептических условиях.

После высыхания всех образцов можно было проводить исследование на элюирование. Такой процесс включал добавление элюата, 5 мл среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM) и 5 мл фосфатного буферного солевого раствора по Дульбекко (PBS). Затем каждую систему с использованием пинцета осторожно помещали в универсальную трубку для сохранения образцов стерильными и предотвращения внезапного движения, которое может встряхнуть загруженный МТХ. Половину систем в каждом методе загрузки добавляли к 5 мл среды, а другие 14 и другие 24 к PBS.

Все 48 систем затем помещали на валики, которые затем наклоняли для полного окунания всех систем в элюент. Затем системы извлекали под стерильным вытяжным колпаком и с использованием стерильного пинцета помещали в новую универсальную трубку, содержащую 5 мл свежего элюента, и выдерживали в течение 5-ти различных периодов времени: 2 часов, 4 часов, 24 часов, 48 часов и 168 часов. Затем 240 образцов, содержащих высвобожденный МТХ, анализировали с использованием методов УФ-спектрометрии.

Определение количества МТХ в пробах элюата УФ-спектрометрией

Анализ МТХ в пробах элюата УФ-спектрометрией осуществляли при 303 нм с использованием спектрометра Unicam UV4 (Cambridge, UK). Сначала проводили последовательное разбавление МТХ от концентрации 1000 мкм/мл в PBS и DMEM для получения ряда известных концентраций МТХ в пробах высвобождаемого лекарственного средства. Из полученных значений выбирали самую низкую концентрацию, которая может быть обнаружена УФ-спектрометром, и полученные значения использовали для построения графика, при этом нанесенные значения находились в линейном диапазоне калибровочных данных.

Полученные калибровочные уравнения были следующими:

где _у = показание спектральной поглощательной способности (нм) и

_х = концентрация МТХ (мкг/мл).

1 мл раствора, содержащего среду или PBS и не содержащего МТХ, помещали в качестве фонового значения в кварцевую кювету и УФ-спектрофотометр. Затем в другую кварцевую кювету помещали 1 мл элюента и измеряли показания поглощательной способности в сравнении с фоновым значением. После этого значения поглощательной способности подставляли в уравнения 1 или 2 для получения концентраций МТХ.

Некоторые показания спектральной поглощательной способности были выше линейных участков на калибровочной кривой, т.е. более 2,079 нм для PBS и более 1,040 нм для среды. Поэтому для получения показаний на калибровочной кривой для этих образцов осуществляли разбавление 1 к 5-ти. Указанные пробы представляли в основном пробы, которые брали через 2 часа. Значения концентраций при высвобождении в системах с использованием 4 различных методик затем сводили в таблицы и проводили испытание Tukey Kramer Honestly Significant Difference Test (TKHSDT) для определения значимой разницы между имеющимися количествами.

Культура клеток in vitro

Две клеточные линии остеосаркомы и первичные человеческие остеобласты использовали при изучении в культуре клеток влияния повышенной концентрации МТХ и увеличенного периода времени. Клетки MG63 получали от 14-летнего кавказского мужчины (АТСС-CRL-1427). Человеческие остеосаркомоподобные клетки (HOS) получали от 13-летней кавказской девушки. Человеческие клетки, подобные остеобластам (НОВ), выделяли у пациентов, подвергнутых полной замене колена. Каждую из клеточных линий культивировали при 37°С в модифицированной по Дольбекко среде Игла (DMEM) (Gibco, UK), дополненной 10% плодной телячьей сывороткой (FCS) (Gibco, UK), несущественными аминокислотами (1%), аскорбиновой кислотой (˜150 г/мл), L-глутамином (0,02 М), HEPES (0,01 М), пенициллином (100 единиц/мл) и стрептомицином (˜100 г/мл) в 99% увлажненной стерильной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для предотвращения истощения питательной среды и накопления отходов среду меняли, по меньшей мере, дважды в неделю.

Сразу же как, только клетки образовывали сплошной слой, их удаляли выливанием среды, промыванием 10 мл PBS и добавлением 5 мл 0,25% трипсина и инкубированием при 37°С. Через 5 минут клеточный слой извлекали из тонкого слоя культуры ткани сбором из колбы на твердую поверхность. Затем содержимое собирали в универсальную трубку и колбу промывали 10 мл среды, которую также помещали в универсальную трубку. Затем емкость подвергали центрифугированию при 18°С в течение 5 минут при скорости вращения 2000 оборотов в минуту, после чего удаляли трипсинсодержащий супернатант, при этом следили за тем, чтобы гранула клеток на дне емкости не удалялась. Затем клетки подсчитывали под оптическим микроскопом и установили концентрацию 13,2×10⁴ клетки/мл. После этого их засевали в 96-луночные планшеты. Для целей измерения пролиферации клеток засевали всего 6 планшетов, причем по 2 планшета содержали одну из трех клеточных линий. Каждый планшет инкубировали в течение 2 дней и затем на каждый планшет добавляли 12 различных концентраций МТХ. Хотя дозы МТХ даны в мг/м² BSA, было невозможно использовать такой показатель для вычисления подходящей дозы в данном исследовании. Поэтому необходимо было установить такую концентрацию, чтобы в плазме среднего человека присутствовали нужные дозы МТХ. Для этого необходимо найти долю массы тела, которую представляет жидкая среда. Внутрисосудистый объем представляет примерно 60% массы тела. Поэтому, так как 1 кг равен примерно 1 л, больной весом 70 кг имеет внутрисосудистый объем 42 л. Следовательно, объем 1 м² жидкой среды BSA: 42 л 1,73 м²=24,3 литра.

Рекомендованная BNF (Британский национальный реестр лекарственных средств) доза для терапии одним лекарственным средством в отсутствие других средств МТХ (мг/мл) равна 600. Следовательно, в данной терапии получают следующую концентрацию плазмы:

600 мг/24300 мл = 0,0247 мг/мл = 24,7 мкг/мл

Исходная концентрация снижается, т.к. вещество удаляется из организма, однако, в некоторых проведенных исследованиях использовали дозы в 2, 3 раза больше данного значения. Таким образом, используемые концентрации были выше и ниже 24,7 мкг/мл и находились в диапазоне от 0,1 мкг/мл до 1000 мкг/мл. На три планшета, по одному с каждой из клеточных линий, подавали МТХ с экспозицией в течение 24 часов (один день) и на другие 2 пластины подавали с экспозицией в течение 72 часов (3 дня), чтобы увидеть разницу в пролиферации клеток при различных концентрациях и увеличении времени экспозиции.

Тест МТТ

Действие МТХ на пролиферацию клеток остеосаркомы определяли с помощью теста МТТ. Реагенты, необходимые для этого анализа, представляли порошок МТТ (сигма М2128 или М5655), диметилсульфоксид ДМСО (сигма D2650) и фосфатный буферный солевой раствор (PBS). Среду удаляли из лунок. Раствор МТТ получали добавлением 50 мг МТТ к 10 мл PBS в универсальной трубке, которую нагревали при 37°С в течение 15 минут. Затем раствор фильтровали, в каждую лунку добавляли 10 мкл МТТ и возвращали в инкубатор, в котором он находился при 37°С в течение примерно 3 часов в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и имеющей влажность 99%. МТТ удаляли инверсией и фильтрацией через тонкую бумагу. В каждую лунку затем добавляли еще 100 мкл ДМСО и встряхивали в течение 1 минуты. После этого считывали поглощательную способность каждой лунки с измерительного микропланшет-радера. Dynatech (BioRad Model 3550) при длине волны 595 нм и времени смешивания 5 сек. Данные пробы нельзя было использовать повторно и поэтому после завершения анализа их выбрасывали. Полученные показания сразу же сводили в таблицы и представляли в виде процентного содержания от контрольного значения. Показания поглощательной способности анализировали в сравнении с контрольными значениями испытанием по Даннету (Dunnetts) при уровне значимости в 5% для определения, будет ли наблюдаться статистически значимая разница в пролиферации клеток, когда концентрацию МТХ повышают.

Результаты

Оценка ГА в качестве системы доставки лекарственного средства МТХ

Результаты показали, что различные системы пористого ГА успешно нагружались МТХ и высвобождали это противораковое средство. Разница в методах нагрузки оказывала значительное действие на кинетику высвобождения МТХ. Однако результаты образцов, помещенных в среду, давали неустойчивые и ненадежные показания поглощательной способности на УФ-спектрометре и поэтому они не отображены графически.

Полную двухфазную модель высвобождения для регулируемой доставки лекарственного средства наблюдали в системах 7 и 8, смотри таблицу 1. Она включала быстрое высвобождение лекарственного средства на ранней фазе и пролонгированное и медленное, но постепенное высвобождение на поздней фазе. Системы 1-6 таблицы 1 не соответствуют такой модели и показывают быстрый начальный рост высвобождения МТХ в течение первых 24 часов и необнаружимое высвобождение на поздней фазе. Результаты для каждой системы представляют среднее значение трех повторяющихся опытов, методы нагрузки для каждой из систем можно увидеть в таблице 1.

Таблица 1 Различные методы загрузки МТХ на НА диски
Система 1	Адсорбция в течение 1 часа
Система 2	Адсорбция в течение 3 часов
Система 3	Адсорбция в течение 6 часов
Система 4	Вакуум в течение 1 часа
Система 5	Вакуум в течение 3 часов
Система 6	Вакуум в течение 6 часов
Система 7	Центрифугирование в течение 1 часа при 1000 оборотах в минуту
Система 8	Сушка вымораживанием в течение 24 часов

Результаты показаны на графике фигуры 1, показывающем начальное высвобождение, и на фигуре 2, показывающей высвобождение через 24 часа.

Исследования имеют большое значение в отношении системы высвобождения лекарственного средства, т.к. системное лечение МТХ обычно происходит только в течение времени от 24 до 42 часов, и законченные интенсивные исследования не показали разницы в эффективности при возрастании концентрации. Такое исследование было проведено с целью посмотреть будут ли продолжительность времени и концентрация, при которых МТХ высвобождается из системы доставки лекарственного средства, достаточными для обеспечения большей терапевтической пользы за счет увеличения гибели клеток остеосаркомы. Кроме того, проводили испытания клеточной линии НОВ, чтобы посмотреть может ли выбор лекарственного средства (МТХ) быть достаточно селективным для опухолевых клеток и не будет ли ингибироваться костный рост, обеспечиваемый остеобластами.

Полученные в целом результаты позволяли определить оптимальные системы на основе пористого материала, основанные на положительных профилях кинетики высвобождения. Эксперименты показали, что оптимальными методами загрузки были центрифугирование и сушка вымораживанием, которые показывали самое большое пролонгированное высвобождение во всех системах. Кроме того, было установлено время экспозиции, необходимое для обеспечения значительного уменьшения пролиферации клеток, по меньшей мере, в одной из клеточных линий остеосаркомы.

В целом, оптимальные профили приближены к «двухфазной модели» регулируемого высвобождения (фигура 3). Она включает быстрое высвобождение во время ранней фазы и постепенное пролонгированное высвобождение во время поздней фазы. Такие оптимальные профили обеспечивали ГА-диски, нагруженные МТХ с помощью центрифугирования (система 7) и сушки вымораживанием (система 8). Они рассматриваются как оптимальные системы, так как только они одни показывают обнаружимое высвобождение МТХ в терапевтическом диапазоне до 168 часов. Системы 1-6 (нагруженные методами адсорбции и вакуума) показывали высокое начальное высвобождение, но не обнаружимое высвобождение через 48 часов.

Высвобождение лекарственного средства, включенного в поры пористого гидроксиапатита, обусловлено степенью макропористости и микропористости и кажущейся плотностью (AD), отражающей профили высвобождения на ранних стадиях в виде функции макропористости, и действительной плотностью, отображающей регулируемое высвобождение на поздних стадиях в виде функции уровня открытой микропористости. Иными словами, процентное содержание и размер макропор и уровень несомого загруженного лекарственного средства (МТХ) являются преобладающими факторами на ранних стадиях, а лекарственное средство, содержащееся в микропорах, является решающим фактором на II-й поздней фазе высвобождения лекарственного средства.

Цель данного исследования состояла в определении степени, до которой различные методы загрузки могут загружать лекарственное средство в микро- и макропоры и, следовательно, в получении пролонгированного высвобождения. Поскольку центрифугирование и сушка вымораживанием обеспечивали пролонгированное позднее высвобождение, а также раннее высвобождение, микро- и макропоры должны быть загружены. Высокая степень раннего высвобождения имеет важное значение в противораковой терапии, т.к. она может обнаруживать и местно убивать «ранние», вновь появляющиеся раковые клетки, а пролонгированное высвобождение на поздней фазе является важным для поддерживания терапевтического эффекта. Поэтому биодоступность МТХ, в особенности при быстром раннем высвобождении и пролонгированном позднем высвобождении, может быть существенной и важной в противораковой терапии.

Все 8 испытуемых систем показывали высокое первоначальное высвобождение. Высокое первоначальное высвобождение может быть отнесено за счет эффекта «вымывания», когда отвержденное лекарственное средство, покрывающее поверхность, растворяется при первоначальном помещении системы в первый элюент. Система 8 (сушка вымораживанием) показывала самое высокое первоначальное высвобождение через 2 часа, что, наиболее вероятно, обусловлено природой процесса сушки вымораживанием. В конце процесса пробы концентрировали, при этом отвержденный МТХ, покрывающий поверхность, мог быть частично смыт, но значительный избыток МТХ все же остается и поэтому он может быть растворен в первом элюенте.

Самая высокая скорость высвобождения через первые 4 часа проявлялась также при использовании способа сушки вымораживанием (система 8). Вслед за ней близко следуют метод центрифугирования (система 7), затем вакуумная пропитка и абсорбция (системы 1-6). Такое обстоятельство может быть обусловлено следующими причинами: процесс сушки вымораживанием может предусматривать непосредственную экструзию раствора МТХ в поры ГА-диска, давая возможность раствору МТХ поступать в макропоры, но МТХ не находится в растворе, когда га-диск удаляют. Таким образом, при удалении ГА-диска часть жидкого МТХ в других системах может вытекать из макропор, уменьшая тем самым загрузку лекарственного средства, доступного для первоначального высвобождения. Однако система 8 не будет сталкиваться с утечкой МТХ из макропор при удалении, т.к. оно уже отвердилось в порах.

Разница между начальными скоростями высвобождения в системах 1-8 может быть обусловлена способностью каждого способа давать эффективную сильную экструзию МТХ через макропоры. После центрифугирования наиболее действенными возможно, являются сушка вымораживанием и вакуумирование, при этом, очевидно, что наименее действенными являются методы обычной абсорбции. Разница между увеличенными временами вакуумирования и временами абсорбции является незначительной, при том, что TKHSDT показывает небольшую статистическую разницу, что указывает на достижение максимизированной загрузки лекарственного средства к первым моментам отсчета времени, т.е. через 1 час абсорбции и 1 час вакуумирования. Очень незначительная разница может встречаться в результате изменения размера пор, плотности и связности пор в ГА-дисках в результате небольших несоответствий при изготовлении.

Системы с пролонгированным высвобождением представляют системы 7 и 8, причем система 7 предусматривает более высокую скорость высвобождения во время поздней фазы. Как уже указывалось, высвобождение во время поздней фазы является функцией микропористости. Факт, состоящий в том, что высвобождения МТХ в системах 1-6 через 24 часа не обнаружено, указывает на то, что или УФ-спектрометр был не чувствителен к небольшим количествам МТХ или что раствор МТХ не поступал в микропоры ГА-дисков. Однако, вероятно, что некоторое количество раствора МТХ поступало в микропоры и небольшое количество может быть высвобождено, но оно меньше порога для обнаружения и, возможно, меньше терапевтического порога, равного 0,01 мкм.

Скорость замедленного высвобождения во время поздней фазы выше при центрифугировании, вероятно потому, что раствор МТХ вращается со скоростью 1000 оборотов в минуту в течение 1 часа, что дает возможность микропорам заполняться лекарственным средством более эффективно, чем в методе сушки вымораживанием. Кроме того, способность жидкости экструдироваться в микропоры ГА может быть адекватной при отрицательном давлении в сушилке для сушки вымораживанием, но раствор может отверждаться до поступления в микропоры или в середине процесса поступления в микропоры.

Химические силы прямой адсорбции лекарственного средства на поверхность могут также играть роль в высвобождении во время ранней и поздней фазы. Во всех указанных методах не используется носитель для доставки лекарственного средства, такой как желатин или альгинат, и единственное средство, при котором лекарственное средство может оставаться связанным на ГА поверхности, представляют физические и химические связи. Физически адсорбированный МТХ получается за счет сил Ван-дер-Ваальса. Они дают возможность нескольким слоям молекулы МТХ связываться с поверхностью ГА. Химические связи имеют более короткую длину, они гораздо прочнее и включают электростатические (ионные) и/или ковалентные связи. Только такой тип связывания дает возможность образования монослоя молекулы на поверхности.

Вероятно, что физически адсорбированное на поверхности ГА лекарственное средство вносит вклад в раннее высвобождение, поскольку в теплом месте (37°С), в которое помещают системы, температура возрастает, физические связи разрушаются, высвобождая лекарственное средство в первый элюент. Однако поскольку химические связи гораздо прочнее, вероятно, что они в большей степени вносят вклад в высвобождение во время поздней фазы. Так как, по-видимому, центрифугирование обеспечивает наибольший охват микропор и, следовательно, удельную поверхность, то разумно предположить, что это приводит к большей степени покрытия ГА физическими и химическими связями. Следовательно, разрыв указанных связей приводит к наиболее высокой скорости и количеству высвобождаемого средства во время поздней фазы исследования, чем в другой системе. Данные химические связи состоят из ковалентных и ионных связей, но ковалентные взаимодействия вряд ли играют роль в высвобождении лекарственного средства, поскольку прочность таких связей может не давать МТХ возможности десорбироваться. Ионные связи могут быть удобными для высвобождения лекарственного средства и могут иметь место между ионами кальция и карбоксильными группами или между фосфатными группами и N-метильными группами МТХ. Могут также встречаться другие химические связи, такие как между гидроксильными группами ГА и ароматическими атомами азота, карбоксильными группами, амид/пептидные связи. Могут также происходить различные взаимодействия типа хелатообразования между ионами кальция и молекулой МТХ, опосредованные через комбинации нескольких или более из следующих групп, присутствующих в лекарственном средстве: амид/пептидных групп, гидроксильных групп, ароматических атомов азота, свободных аминогрупп.

Значимость МТХ, непосредственно адсорбированного на ГА, состоит в том, что покрытия ГА на эндопротезе при операционном спасении конечностей, могут быть загружены МТХ, что уменьшает вероятность местного повторного возникновения остеосаркомы.

Самое высокое общее накопленное высвобождение отображалось системой 8 и, по-видимому, оно коррелирует с самым высоким первоначальным высвобождением через 2 часа. Количество МТХ, высвобожденное через 24 часа и далее, по отношению к первоначальной высвобожденной дозе является очень маленьким. Таким образом, самое высокое общее накопленное высвобождение в системах будет в значительной степени определяться первоначальным количеством, высвобожденным благодаря «эффекту вымывания».

Было найдено, что оптимальным методом загрузки ГА-дисков МТХ является центрифугирование с последующей сушкой вымораживанием. Другие физические свойства ГА, такие как измененное время спекания (которое изменяет связность пор, размер пор и плотность пор), могут определять его способность действовать в качестве системы доставки лекарственного средства. Кроме указанных исследований, следует также определить терапевтическое действие МТХ после адсорбции на ГА, т.к. десорбция может привести к изменению химической структуры.

Влияние концентрации лекарственного средства и времени экспозиции на три клеточные линии: HOS, MG63 и НОВ показали следующие результаты. Все клеточные линии через 1 день экспозиции показывали уменьшение пролиферации, по мере того как концентрация МТХ возрастала. Наименее чувствительные клеточные линии представляли клетки HOS, которые показывали только небольшое уменьшение пролиферации после добавления МТХ и только 4 статистически значимые значения разницы выходили за пределы двенадцати концентраций МТХ. Через 3 дня экспозиции при тех же самых концентрациях клетки HOBs и HOS показывали уменьшенный уровень разрастания клеток по сравнению с образцами, подвергнутыми экспозиции в течение 1 дня. Напротив, клетки MG63 показывали неустойчивое поведение, когда концентрация МТХ увеличивалась. Таким образом, данные результаты показывают, что НОВ и HOBs являются чувствительными к повышенному цитотоксическому действию при увеличенном времени экспозиции МТХ. Данное обстоятельство может быть объяснено тем фактом, что при длительных периодах экспозиции лекарственного средства образование полиглутамата усиливается, вследствие чего возрастает цитотоксичность. Кроме того, представляется, что, по мере того как время экспозиции увеличивается, цитотоксическое действие становится лишь чуть большим, когда концентрация возрастает, что указывает на то, что время экспозиции является важным фактором и, возможно, для цитотоксической эффективности может быть достигнут порог концентрации.

Когда концентрация МТХ и время экспозиции увеличиваются, это лишь незначительно влияет на MG63, что может быть обусловлено резистентностью. Хотя при лечении остеосаркомы часто используют высокую дозу МТХ, обычная терапевтическая доза может быть иногда неэффективной. Некоторые ретроспективные исследования предполагают, что для получения хорошей реакции на химиотерапию/0-53 необходимо достигнуть порогового уровня МТХ. Данное соотношение предполагает, что остеосаркоме присуща устойчивость к обычным дозам МТХ, которая может быть преодолена использованием чрезвычайно высоких доз. Потенциальный механизм внутренней резистентности представляет собой сниженный перенос в клетки через восстановленный фолатный носитель (RFC), что может объяснить, почему время экспозиции не оказывает влияния, в то время как для обеспечения переноса альтернативными средствами, такими как пассивная диффузия, требуется, возможно, большее время. Кроме того, дозы не могут быть достаточно высокими, чтобы обеспечить возможность переноса в клетки. Второй потенциальной причиной внутренней резистентности является результат нарушенного полиглутамилирования, что приводит к недостаточному удержанию лекарственного средства в клетке, ингибируя его действие.

МТХ предположительно является высокоселективным в отношении опухолевых клеток, кроме того, оно воздействует на клетки НОЕ до степени, подобной степени воздействия на клетки HOS. Причина этого состоит в том, что МТХ является наиболее активным против быстро пролиферирующих клеток, потому что его цитотоксическое действие осуществляется в основном во время S-фазы клеточного цикла. Во время более длительных экспозиций большинство клеток имеет возможность поступать на фазу синтеза ДНК в клеточном цикле, что приводит к большей гибели клеток. Поскольку клетки НОЕ, культивированные in vitro, быстро делятся, подобно клеткам остеосаркомы, то на них можно воздействовать таким же путем. Таким образом, можно было бы моделировать клинический сценарий, в котором некоторые остеобласты делятся медленно. С другой стороны, исследования in vitro показали только 30% уменьшение разрастания остеобластов по сравнению с 90% уменьшением разрастания клеток остеосаркомы при концентрации МТХ 5 мМ.

Данное исследование показало, что пористый ГА способен успешно высвобождать МТХ в течение 7 дней с использованием двух методов загрузки лекарственного средства. Кроме того, уровни высвобожденного лекарственного средства находились в терапевтическом диапазоне для лечения остеосаркомы. Исследования пролиферации клеток подтвердили терапевтическую эффективность увеличенного времени экспозиции лекарственного средства для предотвращения разрастания клеток HOS. Время экспозиции в испытаниях было более продолжительным, чем время, дающее возможность осуществить системное введение лекарственного средства, и находилось в диапазоне периода времени, в течение которого лекарственное средство высвобождается из изученных ГА систем.

Таким образом, применение ГА, нагруженного МТХ, в качестве системы доставки лекарственного средства для лечения остеосаркомы показывает ее большой потенциал, и она может быть использована в клиническом сценарии на участках, не несущих массу, для заполнения небольших послеоперационных дефектов, например, в челюстно-лицевой хирургии, и, кроме того, может быть включена в протезирование в хирургии для спасения конечностей и лечения участков, несущих нагрузку.

Пример II

Поглощение трис-фенантролинперхлората железа (II) [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ на ГА

Исследовали четыре метода поглощения [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ на ГА, при этом в каждом использовали блоки с пористостью 83,35 (0006) и примерными размерами 20×15×20 мм и массой 303,5 г. Растворы получали растворением [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ (0,031 ммоль) в метаноле (30 см³). Все блоки взвешивали влажными и сушили в печи всю ночь при температуре примерно 100°С.

1. Поглощение погружением ГА в раствор [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ на 35 минут.

2. Поглощение погружением ГА в раствор [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ на 24 часа.

3. Поглощение помещением ГА в вакуум на 10 минут перед прямой инжекцией раствора [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ на блок, с сохранением вакуума в течение еще 30 минут.

4. Поглощение погружением ГА в раствор [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ и воздействия вакуума в течение 35 минут.

Количество раствора, абсорбированного блоками, находилось в диапазоне между 2,7-3,5 г, наибольшие количества наблюдали для методов с использованием вакуума (Точность взвешивания ограничена вследствие испарения растворителя).

Наблюдаемое проникновение в блоки во всех случаях было небольшим при большой степени поверхностной абсорбции. Наилучшее проникновение наблюдали для блоков, нагруженных в соответствии с методом 2, т.е. при длительном погружении.

Выщелачивание [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ из блоков ГА, полученных в соответствии с методом 3

Выщелачивание осуществляли с перемешиванием растворов, чтобы избежать неточностей вследствие градиентов концентрации. (Однако в соответствии с современными представлениями могут происходить некоторые аномалии в результате случайного сотрясения блока за счет магнитного механизма).

Половину блока, полученного в методе 3, погружали в дистиллированную воду (30 см³) и регистрировали поглощательную способность УФ-видимой спектрометрией при длине волны 512 нм. Во всех вычислениях использовали коэффициент экстинкции 10,620 моль^-1дм³см^-1.

Представленный ниже график показывает количество [Fe(фен)₃][ClO₄]₂, высвобожденного из блока с течением времени.

Выщелачивание [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ из НА, нагруженного в соответствии с методом 3

График показывает две фазы, которые, вероятно, соответствуют начальному высвобождению абсорбированного [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ с поверхности и последующему высвобождению [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ из внутренней части блока. Через 170 минут почти весь [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ был высвобожден из блока. Через 330 минут раствор заменяли дистиллированной водой и еще через 20 часов измеряли поглощательную способность. Показание обнаружило высвобождение из блока еще 0,14 мг, это может быть обусловлено высвобождением [Fe(фен)₃][ClO₄]₂, который находился внутри блока, когда система достигла равновесия в течение первых 330 минут.

50

100

150

200

250

300

350

Пример III

Использование сополимера DL-лактида и гликолида для замедления высвобождения [Fe(фен)₃][ClO₄]₂

Поскольку биоразлагаемый сополимер DL-лактида и гликолида (PLG) не растворим в метаноле, в следующих экспериментах использовали ацетонитрил.

Нагрузка

Для нагрузки соединений на ГА использовали вакуумный метод 3, вновь использовали блоки с пористостью 83,35% (0006) и примерными размерами 20×20×15 мм, весом 3,6-3,8 г. Для контрольного блока только с [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ (0,01 г, 0,013 ммоль в 6 см³ ацетонитрила) наблюдали хорошее проникновение в блок. Для блока, нагруженного [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ (0,01 г, 0,013 ммоль) и PLG (50:50) (200 мг в 6 см³ ацетонитрила) наблюдали меньшее проникновение, но распределение было более однородным. Блоки снова сушили в печи. (Для полного растворения полимера в ацетонитриле перед нагрузкой требуется перемешивание в течение времени до 1 часа).

Выщелачивание

Все эксперименты, касающиеся выщелачивания, проводили с использованием разрезанных половинок блоков, погруженных в воду (30 см³) и постоянном перемешивании. Первоначальные эксперименты по выщелачиванию показывали, что блоки, пропитанные полимером, всплывали, в связи с чем было необходимо взвешивание с использованием стеклянных стержней. Плавучесть, вероятно, обусловлена блокирующими порами полимера в ГА, захватывающими воздух внутрь блока. Кроме того, данные эксперименты обнаружили, что показания должны быть взяты в течение нескольких дней, следовательно, для предотвращения испарения воды, приводящего к неточностям, была необходима закрытая система. Поглощательную способность регистрировали, опять-таки при λ512 нм через соответствующие интервалы.

Выщелачивание [Fe(фен)₃][ClO₄]₂

Через 300 минут высвободился примерно весь [Fe(фен)₃][ClO₄]₂. Дальнейшие показания были взяты через 24 часа, при этом наблюдали уменьшение поглощательной способности. Через 48 часов наблюдалось почти полное исчезновение цвета. Данное явление могло быть обусловлено гидролизом [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ в блоке ГА.

Выщелачивание из блока, пропитанного [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ PLG (50:50)

Выщелачивание [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ из ГА, нагруженного PLG

Когда блок сначала погружали в воду, на поверхности блока наблюдали пузырьки, и, данное явление, в дополнение к наблюдаемой плавучести, указывает на захват воздуха внутри блока. Через 24 часа блок утрачивал плавучесть, что может указывать на проникновение в блок воды. Результаты показывают, что пропитка PLG в пути блока значительно замедляет высвобождение [Fe(фен)₃]. Высвобождение дополнительных количеств комплекса наблюдалось даже через 5 дней.

Количество [Fe(фен)₃][ClO₄]₂, абсорбированного на ГА, увеличивается при применении вакуума во время нагрузки. Повышенное проникновение наблюдается, когда в качестве растворителя предпочтительнее используют ацетонитрил, а не метанол.

Высвобождение [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ из ГА происходит в виде начального всплеска (благодаря высвобождению комплекса с поверхности блока с последующей медленной фазой (высвобождение комплекса из внутренней части блока). Общее высвобождение является быстрым, и большая часть комплекса высвобождается через 300 минут. Пропитка ГА смесью [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ и PLG резко замедляет высвобождение [Fe(фен)₃][ClO₄]₂ с продолжением высвобождения комплекса, наблюдаемого даже через 5 дней.

Пример IV

Пропитка ГА противораковым средством цисплатином

С использованием вакуумного метода 3 цисплатин (0,025 г, 0,08 ммоль) в водном растворе хлорида натрия (50 см³ 0,9 мас.% раствора) инжектировали на блок ГА с пористостью 84,04% (0003), размерами 21×23×15 мм и весом 4,2 г. После сушки на поверхности блока наблюдали пятна желтого цвета, которые, как предполагалось, были цисплатином. Желтый цвет внутри блока не наблюдался.

Выщелачивание

Эксперименты по выщелачиванию осуществляли в дистиллированной воде (35 см³) при перемешивании в отсутствие света и в закрытом состоянии для предотвращения испарения. Поглощательную способность регистрировали при λ 206 нм через соответствующие интервалы и во всех необходимых вычислениях использовали коэффициент экстинкции 30 57 моль^-1дм³см^-1.

Выщелачивание цисплатина из ГА

Высвобождение цисплатина было быстрым: почти все лекарственное средство высвободилось через 45 минут. Быстрое высвобождение лекарственного средства может указывать на то, что проникновения в блок не происходит и что лекарственное средство высвобождается только с поверхности блока.

Пример V

Использование сополимера DL-лактида и гликолида для замедления высвобождения цисплатина

Поскольку PLG не растворим в воде, а цисплатин не растворим в ацетонитриле, применяли двухфазную программу загрузки. С использованием вакуумного метода 3 цисплатин (0,025 г, 0,08 ммоль) первоначально загружали на блок в водном растворе хлорида натрия (50 см³ 0,9 мас.% раствора). После сушки блока в печи в течение ночи вновь использовали вакуумный метод для инжекции раствора PLG (85:15) (0,105 г) в ацетонитриле (50 см³). Блок также сушили в печи всю ночь.

Заключение

Высвобождение цисплатина из ГА было также быстрым, причем большая часть лекарственного средства высвободилась только через 45 минут.

Пример VI

Высвобождение противовоспалительного лекарственного средства предниаолона из ГА

Для получения следующего калибровочного графика и уравнения для преднизолона осуществляли эксперименты, включающие последовательное разбавление.

Последовательное разбавление преднизолона

Во время получения растворов для нагрузки на диски ГА (указанное включает перемешивание растворов/суспензий лекарственного средства/полимера в течение одного часа и изредка погружение в емкость для ультразвуковой обработки на 30 секунд) было обнаружено, что преднизолон растворяется в ацетонитриле. Поэтому становится ясным, что следующая методика не представляет методику с загрузкой суспензии.

Для данных экспериментов использовали четыре диска ГА из второй партии. В каждом из ацетонитрильных растворов использовали примерно 0,01 г преднизолона. Диски в экспериментах пометили как 1АА, 1ВВ, 1СС и 1DD. 1АА и 1ВВ нагружали центрифугированием и 1ВВ содержал 0,1 г PLG (50:50). 1СС и 1DD нагружали с использованием вакуумного метода и 1DD содержал 0,1 г PLG (50:50). Осуществляли стандартные эксперименты по выщелачиванию, результаты представлены ниже.

Результаты показывают, что в присутствии полимера высвобождение предниэолона из ГА является медленным. Следующие два графика показывают аккумулированное высвобождение лекарственного средства из ГА.

Аккумулированное высвобождение преднизолона из ГА

Аккумулированное высвобождение преднизолона из ГА

Пример VII

Наслоение терапевтических средств на диски ГА

Первоначальное высвобождение МТХ из ГА с использованием полимера PLG (75:25) осуществляли, чтобы установить, будет ли данный полимер {который, как ожидается, будет разлагаться с более низкой скоростью, чем PLG (50:50)} вызывать замедленную скорость высвобождения МТХ. В эксперименте использовали диски ГА из второй партии и примерно такие же количества МТХ, PLG и ацетонитрила. Диски в экспериментах помечали следующим образом: IA и IB нагружали центрифугированием, и IB содержал полимер; IC и ID нагружали вакуумным методом, и ID содержал полимер. Получали следующие результаты.

Высвобождение МТХ из ГА в экспериментах, проведенных для сравнения с высвобождением в присутствии PLG (75:25)

Результаты подтверждают, что присутствие PLG (75:25) не замедляет высвобождения МТХ из ГА. Однако данный эффект не проявляется в большей степени для PLG (75:25), чем для PLG (50:50).

Аккумулированное высвобождение МТХ из ГА в экспериментах, включающих PLG

Несмотря на данные результаты, показывающие, что указанный полимер не был эффективным для дальнейшего уменьшения скорости высвобождения МТХ из ГА, наблюдения за дисками в экспериментах показали, что все же имеются дополнительные количества МТХ, уловленные на диск, которые нагружались в присутствии полимера. Данное обстоятельство указывает на то, что после дополнительного разложения полимера может быть высвобождено дополнительное количество МТХ.

Пример VIII

Нагрузка ГА двумя различными лекарственными средствами, включенными в полимеры

Четыре диска ГА из второй партии нагружали сначала суспензиями МТХ, загруженными в ацетонитрил, причем два из дисков содержали полимер PLG (75:25). Как метод центрифугирования, так и вакуумный метод использовали, как указано выше. Затем дискам давали возможность высыхать на воздухе и последовательно нагружали растворами, содержащими преднизолон в растворе, при этом два из растворов содержали в данном случае полимер PLG (50:50). В этот момент возникала потенциальная проблема, состоявшая в том, что для двух дисков, нагружаемых в присутствии полимера, после нагрузки преднизолоном, растворы, оставшиеся после нагрузки, были бледно-желтыми по цвету, что указывало на высвобождение некоторого количества МТХ во время процесса нагрузки. Данный факт согласуется с поведением вторых растворов (ацетонитрил), растворяющих часть первоначального полимера (PLG (75:25)) на дисках и приводящих к высвобождению некоторого количества МТХ. Выщелачивание с данных дисков, как ожидается, приведет к одновременному высвобождению обоих лекарственных средств. Для достижения эффективного наслоения лекарственных средств на ГА предлагаются два пути. Идентификация ряда биоразлагаемых полимеров, растворимых в различных растворителях, может обеспечить возможность наслаивания лекарственных средств или, альтернативно, может оказаться успешной инжекция растворов полимера в различные участки блоков ГА.

Заключение

Многочисленные повторения высвобождения МТХ в присутствии или в отсутствие PLG (50:50) не были достаточными для вынесения заключения, вероятно вследствие разложения МТХ и/или полимера.

Выщелачивание МТХ (с PLG (50:50) на некоторых дисках) из ГА при взвешивании дисков показывало тенденцию, подобную той, которая наблюдалась в первоначальном эксперименте в присутствии PLG (50:50), показывающем пониженную скорость высвобождения МТХ по сравнению с отсутствием полимера. В более поздние периоды времени высвобождение МТХ в присутствии полимера было более высоким по сравнению с дисками, нагруженными в отсутствии полимера.

Высвобождение лекарственных средств цисплатина и преднизолона из ГА также замедляется за счет присутствия PLG (50:50).

Выщелачивание МТХ (с PLG (75:25) на некоторых дисках) из ГА не показывает, как представляется, более низкую скорость высвобождения, чем для PLG (50:50), однако наблюдения за дисками в конце экспериментов по вышелачиванию не показывают присутствие дополнительных количеств МТХ. Когда применяется второй раствор полимера/лекарственного средства, наблюдается некоторое высвобождение первоначального лекарственного средства, вследствие растворения некоторого количества исходного полимера. Биоразлагаемые полимеры с различными растворимостями, предназначенные для облегчения наслоения или инжекции растворов в ГА, могут преодолеть данную проблему.

Изобретение распространяется на любую и всякую новую и имеющую изобретательский уровень комбинацию и подкомбинацию нагруженного носителя или способ нагрузки носителя или применение нагруженного носителя, которые раскрыты в данном описании.

1. Предварительно формованный пористый керамический носитель, включающий связный каркас, состоящий из несущих слоев и поперечных элементов-распорок и имеющий поры, размер большинства которых находится в диапазоне от около 20 до около 1000 мкм, при этом носитель имеет плотность менее чем около 40% от теоретической, причем весь объем пор может быть заполнен лекарственным препаратом, поры содержат находящийся в них лекарственный препарат, причем скорость высвобождения лекарственного препарата из носителя регулируется.

2. Носитель по п.1, каркас которого имеет средние размеры пор в диапазоне от 20 до 800 мкм.

3. Носитель по п.2, средний размер пор которого находится в диапазоне от 60 до 800 мкм.

4. Носитель по п.3, в котором присутствуют микропоры, которые образованы спеканием предшественника носителя при условиях, которые являются более мягкими, чем условия, необходимые для полного спекания.

5. Носитель по любому предшествующему пункту, где каркас является биосовместимым материалом.

6. Носитель по любому предшествующему пункту, плотность которого находится в диапазоне от около 10 до около 30% от теоретической плотности.

7. Носитель по любому предшествующему пункту, поры которого содержат любой один или несколько материалов из: факторы роста; антибиотики; витамины; белки; гормоны; химиотерапевтические средства; средства, непроницаемые для рентгеновских лучей.

8. Носитель по п.7, поры которого содержат любой один или несколько из следующих факторов роста:

материал для роста кости;

FGF (фактор роста фибробласта);

IGF-I (инсулиноподобный фактор роста I);

IGF-II (инсулиноподобный фактор роста II);

PDGF (фактор роста, полученный из тромбоцитов);

TGF-B (трансформирующий фактор роста);

костеобразующая или костеразрушающая клетка;

BMP-Z;

HGH (фактор роста человека);

концентрации факторов роста, извлеченных у человека.

9. Носитель по п.7, где химиотерапевтическим средством является цисплатин.

10. Носитель по п.7, где средством непроницаемым для рентгеновских лучей, является стронций-67 или самарий-153.

11. Носитель по п.7, где средство представляет собой метотрексат.

12. Носитель по любому предшествующему пункту, поры которого содержат один или несколько из следующих объектов: координационных комплексов типа комплексов Вернера; макроциклических комплексов; металлоценов и сэндвичевых комплексов и металлоорганических комплексов.

13. Носитель по любому предшествующему пункту, поверхность пор которого модифицирована для регулируемого высвобождения лекарственного препарата.

14. Носитель по любому из пп.1-13, поверхность пор которого модифицирована обработкой кислотой, или щелочью, или плазмой, или химическим осаждением из паровой фазы.

15. Носитель по любому из пп.1-13, поры которого содержат лекарственный препарат на разлагаемой подложке, например на биоразлагаемой подложке.

16. Носитель по п.15, где биоразлагаемая подложка представляет собой коллаген или полимер.

17. Носитель по п.15 или 16, где подложка представляет собой один из следующих материалов: поли(карбоксифенокси)-пропансебациновая кислота (PCPP.SA), осажденный карбонат кальция (РСС), (карбоксифенокси)пропансебациновая кислота (CPP.SA), (димер жирной кислоты - себациновая кислота) триметиленкарбонат (FAD-SAPTMC), поли(аспарагиновая кислота)(РАА).

18. Носитель по пп.15, 16 или 17, поры которого содержат слои лекарственного препарата или биоразлагаемой подложки, при этом каждый слой отличается от соседнего или соседних.

19. Носитель по любому из пп.15-18, поры которого содержат материал в слоях, расположенных в виде чередующихся слоев, состоящих из слоя, не содержащего лекарственного препарата, и слоев, содержащих лекарственный препарат, или расположенных в порядке изменения концентрации средства в различных слоях коллагена или полимера.

20. Носитель по любому предшествующему пункту, где лекарственный препарат введен в поры одним или несколькими методами, выбранными из центрифугирования, погружения, вакуумной пропитки или сушки вымораживанием.

21. Носитель по любому предшествующему пункту, внешняя поверхность которого покрыта биоразлагаемым полимером, содержащим лекарственный препарат.

22. Носитель по п.1, каркас которого частично или полностью способен к рассасыванию.

23. Носитель по п.22, каркас которого образован из фосфата кальция или гидроксиапатита (ГА).

24. Носитель по п.1, где лекарственный препарат представляет собой перхлорат трис(фенантролин) железа (II) [Fe(фен)₃][ClO₄]₂.

25. Носитель по п.24, где перхлорат трис(фенантролин) железа (II) загружен в поры вакуумной пропиткой.

26. Носитель по п.1, где поры дополнительно содержат гликолид, причем скорость высвобождения перхлората трис(фенантролин) железа (II) является регулируемой.

27. Носитель по п.1, где лекарственный препарат включает цисплатин и гликолид, причем скорость высвобождения цисплатина и гликолида является регулируемой.

28. Носитель по п.1, где лекарственный препарат включает преднизолон, причем скорость высвобождения преднизолона является регулируемой.

29. Носитель по любому предшествующему пункту, сформованный для ортопедической, челюстно-лицевой или черепно-лицевой замены или для подобных целей.

30. Носитель по любому из пп.1-28, сформованный для размещения во внутримышечной области, внутрибрюшинной области, подкожной области, в области центральной нервной системы или глазной области.