Диагностическая система, содержащая белковые чипы и выполненная с возможностью одновременного определения множества показателей

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается диагностической системы для определения множественных параметров, содержащей белковый чип. Также заявителем предложен способ получения диагностической системы, при этом в состав стандартных образцов растворов входит азид натрия, фетальная бычья сыворотка и антигены в высоких концентрациях, а в реакционный раствор входят два или более белка, имеющих люминесцентную метку. Диагностическая система по заявленному изобретению позволяет повысить стабильность системы и ее чувствительность путем улучшения как представленной системы белковых чипов, так и ее производства. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл, 2 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к биотехнологии. В частности, оно относится к диагностической системе, содержащей белковые чипы и предназначенной для параллельного определения множества показателей, а также к способу изготовления такой диагностической системы.

Уровень техники

Технология биочипов, возникшая в середине 1990-х гг. в качестве нового направления в биотехнологии, базируется на крупномасштабном параллельном анализе взаимодействий между биомакромолекулами (в частности, нуклеиновыми кислотами, белками и т.д.). С целью увеличения серийности, группировки и уменьшения объемов проведения процессов взаимодействия образцов, определения, анализа и т.п., в ней сочетаются многие другие технологии, такие как микроэлектроника, микромеханика, химия, физика, вычислительная техника и т.д. Данная технология становится одной из тех технологий в области медико-биологических наук, которые в настоящее время демонстрируют наиболее быстрое развитие.

Биочипы могут найти широкое применение в сельском хозяйстве, воздействии на окружающую среду, пищевой промышленности, судебных расследованиях, а также использоваться в военных или исследовательских целях и т.д. Кроме того, биочипы обладают большой ценностью в клинической практике, поскольку они могут быть использованы для определения некоторых заболеваний, затрагивающих как гены, так и белки, помогая таким образом в диагностике генных заболеваний, опухолей, инфекционных заболеваний и т.д.

Биочипы подразделяются на три основные категории: чипы, содержащие нуклеиновые кислоты, белковые чипы и чипы-лаборатории.

Белковый чип представляет собой биочип для определения взаимодействия между белками. Технология белковых чипов, согласно данному исследованию, базируется главным образом на принципах специфического связывания антигена и антитела. В соответствии с технологией белковых чипов, несколько белков связаны на твердой основе (например, специально обработанные предметные стекла, органические пленки, силиконовые микросферы и т.д.), при этом определяются те соответствующие белки в биологических образцах, которые способны специфически взаимодействовать с указанными несколькими белками.

При помощи белкового чипа можно с точностью диагностировать физиологические/патологические изменения посредством определения изменений состава конкретного эндогенного белка. Белковые чипы обладают значительным потенциалом для применения в клинической диагностике.

В китайской патентной заявке CN 01105023.3 авторы настоящего изобретения раскрывают диагностическую систему для одновременного определения множества показателей, содержащую белковые чипы, и ее изготовление таким образом, что белки, обладающие высокой специфичностью, но содержащиеся в небольших количествах в средах организма, могут быть определены в клинических условиях одновременно.

Раскрытие изобретения

Технической задачей, на решение которой направлено данное изобретение, основываясь на первоначальной заявке CN 01105023.3, является улучшение диагностической системы, содержащей белковый чип, с увеличением ее стабильности и чувствительности.

В Китайской патентной заявке CN 01105023.3 раскрыта диагностическая система, содержащая белковый чип, предназначенная для параллельного определения множества показателей, которая включает:

(1) белковый чип для параллельного определения множества показателей;

(2) смешанный раствор одного или более белков, т.е., реакционный раствор, приготовленный в конкретных соотношениях концентраций и содержащий люминесцентные метки;

(3) серии смешанных растворов белков, которые должны быть определены, в известных и возрастающих концентрациях, т.е., стандартные образцы;

(4) раствор для промывки белковых чипов.

В настоящем изобретении осуществлена модификация формулы (состава) стандартных образцов растворов белков, которые должны быть определены, с предупреждением, таким образом, потери активности различных белков после смешивания. В результате этого повышается как стабильность образца, так и точность определения.

Составы указанных стандартных образцов растворов белков, которые должны быть определены (вкратце названные белками-мишенями А) в заданных и возрастающих концентрациях, являются следующими: 40-60% фетальной бычьей сыворотки + различные очищенные антигены в высоких концентрациях + 0,02-0,1‰ NaN₃, или фосфатно-солевой буферный раствор (PB) (КН₂РО₄-Na₂НРО₄) 0,05М при рН 7,0-7,8 + 2-30% БСА + 1,5-2,5% сахарозы + 0,02-0,1‰ NaN₃ + различные очищенные антигены в высоких концентрациях. Осуществляют лиофилизацию и хранение серий смешанных растворов, приготовленных как указано выше, которые содержат определяемые белки А в известных и возрастающих концентрациях.

Другая техническая задача, решаемая настоящим изобретением, представляет собой улучшение способа изготовления белкового чипа в вышеуказанной диагностической системе.

Белковый чип, как описано в настоящем изобретении, включает твердофазный носитель и белки, иммобилизированные на носителе, для параллельного определения множества показателей. При изготовлении белкового чипа используется автоматическая система нанесения проб на поверхность чипа для иммобилизации различных белков на твердофазном носителе в определенном порядке посредством физической адсорбции или ковалентного связывания; затем используется блокирующий раствор для блокирования участков, не содержащих образцов, нанесенных на твердофазный носитель, и полученный продукт высушивают и хранят. Белки могут представлять собой антигены, антитела, рецепторы, лиганды и т.д. Они могут также включать белки, способные специфически связываться с природными белками-маркерами заболеваний, в частности белками-маркерами опухолей.

Указанный твердофазный носитель может представлять собой неорганическую основу или основу, состоящую из органических соединений. Неорганические основы включают кремниевые полупроводниковые основы, основы из стекла, микропористые кремниевые основы, микропористые основы из стекла и т.д. Предпочтительными являются основы из стекла. Органические основы включают ацетатцеллюлозные пленки, нитроцеллюлозные пленки, нейлоновые пленки, полипропиленовые пленки и т.п.

Белковый чип изготавливают по следующей схеме:

1. Устанавливают различные белки, подлежащие определению (вкратце названные белками-мишенями А), и антигены, антитела или рецепторы и т.п. (вкратце названные В), которые являются специфичными для «А», такие как эндогенные белки-маркеры заболеваний и белки, способные связываться с ними.

2. Как описано выше, «В», т.е. различные образцы белков, растворяют в покрывающем растворе в конкретной концентрации и затем наносят на твердофазный носитель, используя автоматическую систему нанесения проб на поверхность чипа, где плотность нанесения составляет 25-200 точек/см², а количество вещества на одну точку составляет 0,1-10 нг/точку.

3. Полученный продукт хранят в течение ночи при 4°С.

Для определения соседних порядков величин (наибольшее пятно/наименьшее пятно < 100) световые сигналы, испускаемые различными белками, нанесенными на чип, после проведения серий реакций, были заранее отрегулированы для удобства определения с использованием диагностических инструментов (для достижения оптимальных концентраций при нанесении).

Состав покрывающего раствора, согласно настоящему изобретению, является следующим: фосфатно-солевой буферный раствор (КН₂РО₄-Na₂НРО₄) при рН 7,0-8,0.

Состав блокирующего раствора, согласно настоящему изобретению, является следующим: фосфатно-солевой буферный раствор (КН₂РО₄-Na₂НРО₄), содержащий 1-9% БСА, 1-9% сахарозы и 0,01-1‰ NaN₃. Преимущества данного состава состоят в том, что БСА выполняет функцию блокирования, сахароза достаточно инертна для воздухоизоляции, при этом как БСА, так и сахароза способны поддерживать структуру раствора. Роль блокирующего раствора заключается в том, что он препятствует смешиванию белков между разными участками на твердофазном носителе, обеспечивая, таким образом, точность экспериментальных данных.

В сравнении с предшествующим уровнем техники, измененный (модифицированный) состав буферного раствора, используемого в способе приготовления в соответствии с настоящим изобретением, позволяет снизить неспецифическое поглощение и уровень фонового сигнала. Он также повышает стабильность белкового чипа и чувствительность определения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует сигнал, генерируемый белковым чипом, который изготовлен способом в соответствии с настоящим изобретением, в котором используется модифицированный состав буферного раствора.

Фиг. 2 иллюстрирует сигнал, генерируемый белковым чипом, который изготовлен способом, известным из предшествующего уровня техники.

Осуществление изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, количество твердых веществ (в частности, БСА, сахароза, тирозин и NaN₃) представлено в массовых процентах, а содержание растворов (в частности, Твин-20, фетальная бычья сыворотка и раствор Proclin) представлено в объемных процентах.

Пример 1. Сравнение фонового и сигнального значений между белковыми чипами для диагностики опухоли, изготовленными с включением модифицированного буферного раствора (включая блокирующий раствор и покрывающий раствор) и белковыми чипами, содержащими буферный раствор, состав которого известен из предшествующего уровня техники.

1. Изготовление белкового чипа Е, содержащего состав, включающий модифицированный буферный раствор:

1.1 Соответствующие антитела (антитела I) к шести опухолевым маркерам, в частности, AFP, CEA, PSA, свободный PSA, CA125, CA153 растворили в покрывающем растворе в определенных концентрациях, затем данные белки были нанесены на твердофазный носитель при помощи автоматической системы нанесения проб на поверхность чипа, при этом плотность нанесения составила 48 точек на см², нанесенное количество вещества составило 0,5 нг на точку, и каждому антителу из числа антител I соответствовали 4 последовательные точки.

1.2 Конечный продукт хранили в течение ночи при температуре 4°С;

1.3 Белковый чип обрабатывали в течение часа блокирующим раствором;

1.4 Белковый чип высушивали в течение 2-х часов и хранили при температуре 4°С для последующего использования.

Состав покрывающего раствора, который использовался в соответствии с вышеизложенным вариантом воплощения изобретения, был следующим: фосфатно-солевой буферный раствор (КН₂РО₄-Na₂НРО₄) при рН 7,0-8,0.

Состав блокирующего раствора, который использовался в соответствии с вышеизложенным вариантом воплощения изобретения, был следующим: фосфатно-солевой буферный раствор (КН₂РО₄-Na₂НРО₄), содержащий 3% БСА, 5% сахарозы и 0,5‰ NaN₃.

2. Изготовление белкового чипа F способом, предназначенным для изготовления белковых чипов, который известен из предшествующего уровня техники.

Состав покрывающего раствора, который использовался в данном варианте, был следующим: карбонатный буферный раствор (NaHCO₃-Na₂СО₃) при рН 9,6.

Состав блокирующего раствора, который использовался в данном варианте, был следующим: ТБС, содержащий 0,2% Твин-20, 0,1% тирозина, 5% БСА, 4% сахарозы, 0,5% раствора Proclin.

Проводили взаимодействие белковых чипов Е и F, изготовленных как описано выше, с соответствующими реакционными растворами, промывными растворами и образцами сыворотки в известных концентрациях (оставшиеся образцы сыворотки сохраняли для использования в следующем эксперименте). Полученные продукты фотографировали при помощи устройства для диагностики биочипов, и полученная информация подвергалась анализу. Значения сигналов показаны в таблице 1.

Таблица 1
	Чип Е	Чип F
AFP	925	1035
CEA	2995	2906
PSA	2170	2201
свободный PSA	2017	1978
CA125	913	879
CA153	1082	1033

По истечении 6-месячного периода хранения при температуре 4°С, вышеописанные чипы подвергались реакции с реакционными растворами и промывными растворами из той же группы, что и растворы в вышеуказанном эксперименте, а также с образцами сыворотки, описанными выше, при этом сигнальные значения показаны в таблице 2:

Таблица 2
	Чип Е	Чип F
AFP	875	477
CEA	2630	1486
PSA	2140	864
свободный PSA	1087	671
CA125	906	311
CA153	972	557

В сравнении с белковым чипом F белковый чип Е, изготовленный с включением буферного раствора, имеющего состав в соответствии с настоящим изобретением, очевидно обладает улучшенной стабильностью.

Далее, сигнал от белкового чипа Е, полученный от биочипа посредством фотографирования, показан на Фиг. 1, а сигнал от белкового чипа F показан на Фиг. 2. На этих фигурах отчетливо видно, что фоновый сигнал, показанный на Фиг. 1, намного слабее, чем на Фиг. 2.

Пример 2. Сравнение стабильности стандартного образца, приготовленного с включением модифицированного состава буферного раствора, со стабильностью стандартного образца, известного из предшествующего уровня техники.

1. Буферный раствор для стандартного образца был приготовлен в соответствии со следующим составом: 60% фетальной бычьей сыворотки + различные очищенные антигены в высоких концентрациях + 0,05‰ NaN₃. Стандартный образец раствора «А» был получен посредством добавления 60 мкл высококонцентрированных очищенных антигенов AFP, CEA, NSE.

2. Буферный раствор для стандартного образца был приготовлен в соответствии со следующим составом: фосфатно-солевой буферный раствор (КН₂РО₄-Na₂НРО₄) 0,05М при рН 7,8 + 15% БСА + 2,5% сахарозы + 0,05‰ NaN₃. Стандартный образец раствора «В» был получен посредством добавления 60 мкл высококонцентрированных очищенных антигенов AFP, CEA, NSE.

3. Буферный раствор для стандартного образца был приготовлен в соответствии с составом, который известен из предшествующего уровня техники, а стандартный образец раствора «С» был получен посредством добавления 60 мкл высококонцентрированных очищенных антигенов AFP, CEA, NSE.

Примечание: итоговые концентрации AFP, CEA и NSE в растворах А, В и С были совпадающими.

Стандартные образцы трех вышеописанных растворов были лиофилизированы (стандартные образцы a, b и c) и исследованы на автоматическом анализаторе хемилюминесценции. Концентрации, определенные в данном исследовании, приведены в таблице 3.

Таблица 3
Маркер опухоли	Размерность	Стандартный образец a	Стандартный образец b	Стандартный образец c
AFP	нг/мл	728	709	711
NSE	нг/мл	1862	1830	1875
CEA	нг/мл	1161	1163	1172

По истечении периода хранения при температуре 4°С в течение 3-х месяцев стандартные образцы a, b и c были повторно исследованы с использованием того же автоматического анализатора хемилюминесценции. Концентрации, определенные в данном исследовании, приведены в таблице 4.

Таблица 4
Маркер опухоли	Размерность	Стандартный образец a	Стандартный образец b	Стандартный образец c
AFP	нг/мл	731	705	352
NSE	нг/мл	1799	1803	1007
CEA	нг/мл	1095	1168	409

В сравнении со стандартным образцом «с», изготовленным с включением буферной системы, известной из предшествующего уровня техники, концентрации в стандартных образцах a и b являются более стабильными, таким образом, они могут храниться более продолжительное время без потери активности.

1. Диагностическая система, содержащая белковый чип и предназначенная для параллельного определения множества показателей, которая включает

белковый чип для параллельного определения множества показателей;

смешанный раствор двух или более белков, приготовленный в определенных соотношениях концентраций и содержащий люминесцентные метки, т.е. реакционный раствор,

серии смешанных растворов белков, которые должны быть определены, в известных и возрастающих концентрациях, т.е. стандартные образцы растворов, и

раствор для промывки белковых чипов,

где состав указанных стандартных образцов растворов является следующим:

40-60% фетальной бычьей сыворотки, различные очищенные антигены в высоких концентрациях и 0,02-0,1‰ NaN₃, или

фосфатно-солевой буферный раствор (KH₂PO₄-Na₂HPO₄) 0,05M при рН 7,0-7,8, 2-30% БСА, 1,5-2,5% сахарозы, 0,02-0,1‰ NaN₃ и различные очищенные антигены в высоких концентрациях.

2. Способ изготовления диагностической системы, содержащей белковый чип по п.1, где белковый чип получают посредством следующих стадий:

1) устанавливают различные белки, которые должны быть определены (вкратце названные белками-мишенями А), а также антигены, антитела или рецепторы и т.п., специфичные для А (вкратце названные В), такие как эндогенные белки-маркеры заболеваний и белки, способные специфически связываться с ними;

2) описанные выше вещества В, т.е. образцы различных белков, растворяют в покрывающем растворе в определенной концентрации и затем наносят на твердофазный носитель при помощи автоматической системы нанесения проб на поверхность чипа, где плотность нанесения составляет 25-200 точек/см², а количество вещества на одну точку составляет 0,1-10 нг/точку;

3) полученный продукт хранят в течение ночи при 4°С;

4) осуществляют блокирование белкового чипа блокирующим раствором;

5) высушивают и хранят белковый чип при температуре 4°С,

где указанный блокирующий раствор имеет следующий состав: фосфатно-солевой буферный раствор (KH₂PO₄-Na₂HPO₄) при рН 7,0-8,0.

3. Способ изготовления диагностической системы, содержащей белковый чип, по п.2, где указанный блокирующий раствор имеет следующий состав: фосфатно-солевой буферный раствор (KH₂PO₄-Na₂HPO₄), содержащий 1-9% БСА, 1-9% сахарозы и 0,01-1‰ NaN₃.