Способ количественного определения №-ацетилсульфаниламида и сульфаниламидав смеси

 

ОПИСАНИЕ

И ЗО Б РЕТЕН ИЯ

К ЛВтО СКОММ СВИД тЕЛЬСтВ (Союз Советских

Социалистических

Республик

Всес из H«;и

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Заявлено 16.VI.1967 (Л" 1164619/23-4) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 28.Х1.1968. Б1оллстень ¹ 36

Дата опубликования описа11ия 6.V.1969

2/, 308

МПК G 01п

УДI, 543.42.062 (088.8) Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Авторы изобретения

Заявитель

В. С. Родионов и Е. И. Лизенко

Институт биологии Петрозаводского государственного университета имени О. В. Куусинена

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

N4-АЦЕТИЛСУЛ ЬФАН ИЛАМИДА И СУЛЬФАН ИЛАМИДА

В СМЕСИ

С,= " лю/л, Š— Е„ пИ

С, = лю/л; 1

Кп (Е1Кп Е)

Кс Кп

С„ и С, — конгде

Способ количественного спектрофотометричсского определения Х4-ацетилсульфаниламида и сульфаHèëàìèäà в смеси относится к области биохимии. Он может быть использован для изучения ацетилирования сульфаниламида в изо7HpoB2HHf>fx хлоропластах листьев растений. Принцип метода может найти применение при ферментативном анализе ацетата, ацетил-КоА, а также количественном определении ферментов-ацетил-КоА-синтотазы и ариламин-ацетилтрансферазы.

Предлагаемый способ основан на измерении оптических плотностей Х4 ацетилсульфаниламида и сульфаниламида в средах с различными рН.

По приведенному уравнению концентрации компонентов смеси определяют по значениям оптических плотностей, полученных при одной и той же длине волны в растворах с рН

0,1 — 0,5 и 4 — 10: центрации V4 — ацетилсульфаниламида и сульфаниламида, соответственно; d — толщина слоя жидкости в кювете; в, — молярный коэффициент поглощения, равный 19 000 (7, 255 — 7 ль11к); е, — молярный коэффициент поглощения, равный 15 400 (i. 252 — 8 11л1к);

Е, — суммарная оптическая плотность данного раствора при подкислении до рН 3,5;

5 Е, — оптическая плотность Х4-ацетилсульфаниламида; Š— суммарная оптическая плотность данного раствора при рН 4 — 13; Кп и

К, — отношение оптически.; плотностей, измеренных при рН 4 — 13, в максимуме погло10 щения к оптическим плотностях1, измеренным

11 ри рН:. 3,5 (Е2ь7 2бз)

Через К„и К, учитывают поправки н;1 уменьшение молярных коэффициентов поглощения с падением рН среды и поправки на

15 измерение оптических плотностей (при рН 3,5) ие в максимуме поглощения.

Л!олярный коэффициент поглощения Л4ацетилсульфаниламида не изменяется в пределах рН О,1 — 13 и уменьшается ниже и выше

20 этих пределов. >!олярный же коэффициент поглощения сульфаниламида падает при рН<4,0> а при рН<0,5 он изменяется незначительно.

IIa основании такого различия свойств Л7425 ацетилсульфаниламида и сульфаниламида в зависимости от кислотности среды можно вычислить матемятически концентрацию каждого компонента в смеси без их разделения.

Оптическую плотность Е желательно изме30 рять при 257 л»11к в пределах рН 4 — 10, ra»

231885

Предмет изобретения

Составитель А, Тищенко

Редактор Г. Гуськова Текред Л. К. Малова Корректор Т. Д. Чунаева

Заказ 343/13 Тираж 530 Подписное

11НИИПИ Комитета по делана изобретений и открьгтий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Сапунова, 2

Типография, как в этих условиях не требуется введение специального поправочного коэффициента на измерение оптической плотности не в максимуме поглощения сульфаниламида. При измерении же величин Е в пределах рН 10 — 13 поправочный коэффициент следует учитывать.

Чтобы определить концентрацию сульфаниламида и Ла-ацетилсульфаниламида в смеси по одному измерению в сильнокислой среде в конкретных условиях опыта, строят калибровочный график. Для этого в пробирки вносят по 0,1 мл смеси указанных сульфамидов разной концентрации. Затем добавляют 3,9 м г буферного раствора Мв 1. Смесь перемешивают, и измеряют оптическую плотность растворов.

Очистка биологической жидкости.

Метод использован для изучения процесса ацетцлирования сульфаниламнда в хлоропластах. Прямому спектрофотометрическому определению этих сульфаниламидов в суспензии хлоропластов, содержащей необходимые компоненты для ацетилирования сульфаниламиды мешают ЛТФ, АМФ, КоЛ, белки и другие вещества, имеющие поглощение в УФ-свете.

Частичную очистку системы проводят на алюминиевом геле (гидроокиси алюминия), который получают добавлением в инкубационную смесь Л1в($0 )а и КОН. Белок осаждают добавлением 5% НС!01. В ходе опытов устанавливают, что осаждение мешающих веществ па алюминиевом геле в значительной степени зависит от рН раствора. При рН 5 — 6 наблюдают практически полное осаждение АТФ, ЛМФ, КоЛ. При этом К -ацетилсульфаниламид и сульфаниламид обнару>кивают в надосадной жидкости.

Ход анализа.

Инкубационная смесь для изучения апстилирования сульфаниламида в хлоропластах содер>кит, лгк»го.гь: 150 трис-НС1-буфер прп рН 8,5; 1050 сахарозы; 4 ЛТФ; 3,0 ацетата калия; 10 МрС1а, 0,4 КоА; 1,86 сульфанпламида, а также суспензию хлоропластов (0,4 — 0,6 тгг хлорофила). Обший объем инкубационной смеси 4 тг.г.

К 4 л.г инкубационной смеси в колбе Зрленмейра приливают 2 мл 5%-ной -IC101 и содержимое перемешивают вращательным движением колбы. В колбу вносят 1,0 лг.г

1 МА1в(801)в и 5 II КОН. Предварительно определяют количество вносимой щелочи пу5

35 тем титрования специальной пробы, в которую добавляют все указанные выше компоненты смеси, раствором 5 Н КОН до рН 55. При титровании щелочь приливают к пробе из

1-игл микробюретки.

Количество вносимой щелочи колеблется в пределах 1,2 — 1,8 м>г. После добавления в исследуемые пробы найденного количества

5 Н КОН смесь перемешивают, и полученную суспензию центрифугируют 20»Iue при

15 000 g. К 3 лгл надосадочной жидкости добавляют 3 м г 20 /о-ной НС10 .

При этом рН раствора меньше 0,5, Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 257 ллгк. Количество N4-ацетилсульфаниламида определяют по калибровочному граф и к .

Для построения калибровочного графика к 3,8 л.г инкубационной смеси добавляют 2 гг.г

5с/о-ной НС104, 0,2 м,г смеси указанных сульфамидов разной концентрации; 1,0 лг.г

Al(S04);, и 5 Н. КОН (pI- 4,5). Смесь перемешивают, очищают на алюминиевом геле, спектрофотометрируют, как описано выше. На оси абсцисс откладывают концентрации Х1ацетилсульфаниламида и сульфаниламида, а на оси ординат — их оптические плотности.

При проведении определения в условиях, имитирующих ацетилирование сульфанпламида, начальная концентрация которого известна, концентрацию Ха-ацетилсульфаниламида и сульфаниламида вычисляют по одному измерению оптической плотности при длине волны

257 лг,ик при рН 0,1 — 0,5.

1. Способ количественного определения

Х"-ацетплсульфаниламида и сульфаниламнда в смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, анализируемую смесь обрабатывают хлорной кислотой и смесью сернокислого алюминия и едкого калия, центрифугируют, подкисляют и спектрофотометрируют два>кды при одной длине волны в интервале 255 — 263 гглгк при различных рН среды (от — 1,8 до +3,5 и 4 — 13) и расчетным путем определяют содер>капие компонентов в смеси.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что спектрофотометрируют при 257 млк и рН

0,1 — 0,5 и 4,0 — 10.