Патент ссср 156345

 

Класс G 011; 421, 13в3

М 156345

СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОбРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Подписная группа ЛЗ 173

Н. А. Китросский, В. 3. Горкин, H. В. Комиссарова, Г. А. Леонтьева

v И. С. Северина

СПОСОБ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧ ЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ МО НОАМИ НО КС ИДАЗЫ

Заявлено 27;поли 1962 г. за Хо 789230/31-16 в Комитет по лелам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Оп ол ковано в «Бюллетене пзоореге: пй и товарных знаков» Х«15 за !963 г.

1Лзвестны способы спектрофотометрпческого определения активности моноаминоксидазы путеAI гомогенпзации исследуемого материала детергентом, отфильтровывания соед1шительной ткани, внесения в пробы раствора субстрата и измереш1я оптической плотности. Способы предусматривают применение в качестве субстрата кпнурамина или оензиламина. При использовании кинурамина активность моноаминоксидазы определяется по убыли субстрата при окислительном дезамипировании его ферментом. Для получения четких результатов реакция ведется до тех пор, пока не окислится значительное количество внесенного в пробы амина. Такое снижение концентрации смбстрата B ходе реакции может повлиять на ее скорость и привести к искажению результатов.

При использовании в качестве субстрата бензилампна спектрофотометрическое определение производят при 250 л.11к. Однако в этой

Ооласти спектра проявляется спосооность хlнОГих биох11з1ических компонентОв тканей (белков, B) I<.7coTI130B, ароматических аминОкис.70T li т. п.) поглощать ультрафиолетовые лучи.

Предлагаемый способ спектрофотометрического определения акг1шпссти моноаминоксидазы предусматривает»ci7O.7baoBB II!Ie в качестве субстрата л-нитро-и-оксибензиламина. что сокращает время и повышает точность определения активности мопоам1шоксидазы.

При ферментативном дезамипировании л-нптро-и-окспбензилампна образуется 11-нитро-п-оксибензальдегпд, который в водной среде при

315 1ь11к в 10> раз более инте11сивно поглощает ультрафиолетовые лу№ 156345 чи, чем исходный амин. Повторные измерения величины оптической плотности при этой длине волны в течение 5 — 6 мин после смешенич фермента и субстрата позволяют точно определить скорость реакции.

Добавлением неионного детергента ОП-10 можно значительно «просветлить» исследуемый материал (на активность моноаминоксидазы де— тергент не действует) .

П р и мер. Свехкеполученную печень крысы для удаления эритроцитов перфузируют охлаяденным 0,9%-ным раствором хлористого натрия, в течение 3 — 4 нин гомогенизи руют в стеклянном гомогенизаторе с равным по весу объемом 3%-ного водного раствора детергента ОП-10 и добавлением к гомогепату 1%.ного водного раствора едкого кали доводят рН до 8,5. Полученную смесь для отделения соединительной ткани фильтруют через двойной слой марли и в количестве 0,05—

0,1 лл вносят в пробы для спектрофотометрического определения.

В пробу, кроме того, вносят 0,1,нл фосфатного буфера (рН =-7,45) и

0,05,ил 3,2 10-- М водного раствора а1-11игро-п-оксибенз11ламина, доводя затем ее объем до 0,5 ил. Сразу хке по внесении в пробу л1-нигрои-оксибензиламина измеряют ее оптическую плотность при 315 д1лг., сравнивая с контрольной пробой, содержащей все указанные компоне;1ты кроме л-нитро-и-оксибензиламина. Измерения с интервалами в

1 лин повторяют в течение 6 лик после внесения субстрата в пробу.

При наличии в исследуемом материале активной моноамипоксидазы величина оптической плотности линейно нарастает во времени. Тангенс угла, образованного осью абсцисс с полученной в опыте прямой, количественно характеризует начальную скорость, катализир емой моноаминоксидазой реакции.

Предмет изобретения

Способ спектрофотометрического определения актив11ости моноаминоксидазы путем гомогепизации исследуемого материа I3 детергентом, отфильтровывания соединительной ткани, внесешья в пробы раствора субстрата и измерения оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью сокрашения времени и обеспечения точности определения, в качестве субстрата берут н-нитро-п-оксибензилами1..

Составитель В. Л. Таратута

Редактор Б. Л. Шнейдерман Техред Т, П. Курнлко Корректор Л. Я. Баранова

Г1одп. i ие .. 12, " 11 — 63 г. Формат бум. 70;- 1081;6 Объем 0,18 изд. л.

:,àê. 1881/12 Ти1за>t(82о Цена 4 коп.

ЦР11:1ИГ111 Государственного комитета по делам изобретений и открытий СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4. ! и .ографии, пр. Сапунова, 2.