Способ идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Сущность способа заключается в том, что интраоперационно, в стерильных условиях осуществляют забор фрагмента иссеченного клапана, помещают в раствор консерванта, для исследования вносят в лизирующий раствор, гомогенизируют ультразвуком до молекулярного уровня на ультразвуковой установке мощностью 200 Вт, частотой 40 кГц в течение 40 минут, исследуют с помощью полимеразной цепной реакции и идентифицируют возбудитель. Использование способа обеспечивает возможность проведения ПЦР для идентификации возбудителя непосредственно в месте поражения (в клапане сердца), что позволяет повысить точность и чувствительность диагностики.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиохирургии, и может быть использовано для идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца.

Решение проблем идентификации возбудителя внутрисердечной инфекции в настоящее время приобретает особую актуальность в связи с ростом заболеваемости в 3-4 раза (Гуревич М.А., 2000; Тюрин В.П., 2003).

При инфекционном эндокардите (ИЭ) часто поражаются клапаны сердца, что, как правило, требует замены их на протез. Во время этих операций появляется дополнительная возможность идентифицировать возбудитель бактериологическим методом, но только при обнаружении абсцессов сердца, которые встречаются крайне редко, а методики бактериологического исследования возбудителя в тканях клапана сердца не разработаны. Морфологическое исследование клапанов также не позволяет решить эту задачу, так как изменения не являются типоспецифическими, в указанных условиях при отсутствии идентификации возбудителя ИЭ резко возрастает риск рецидива инфекции, может развиться протезный эндокардит и связанные с ним осложнения, что резко ухудшает результаты и прогноз. Летальность при ИЭ сохраняется на высоком уровне и по опубликованным данным разных авторов составляет от 18 до 45%, а в случаях грибкового эндокардита достигает 90%.

Согласно диагностическим критериям Дьюка (Durack D.T. New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings: (Duke Endocarditis Servis / D.T. Durack, A.S. Lukes, D.K. Bright / Am. J. Med. - 1994. - Voi.96. - P.200-209) диагноз ИЭ может быть несомненным, вероятным или отвергнут при наличии альтернативного. Важнейшими диагностическими признаками являются: положительный результат исследования на гемокультуру, а также доказательства вовлечения эндокарда по данным эхокардиограммы (ЭхоКГ). Дополнительными критериями являются: предшествующие заболевания сердца и внутривенное введение наркотиков, лихорадка выше 38°С, сосудистые проявления (крупные артериальные эмболы, септические инфаркты легких, микотическая аневризма и т.д.), иммунные нарушения (узелки Ослера, пятна Рота и т.д.), микробиологическое подтверждение (серологическое подтверждение активной инфекции в отсутствии микроорганизма), ЭхоКГ признаки (сходные с таковыми при ИЭ, но не соответствующие основным критериям). Диагноз ставится при наличии двух основных критериев или одного основного и трех дополнительных, или пяти дополнительных, признаков. Из перечисленных критериев только при положительной гемокультуре может быть правильно подобрано специфическое этиотропное лечение, тогда как все прочие критерии только констатируют факт наличия поражения клапана сердца, не позеоляя определить его этиологию, т.е. являются косвенными, и не могут быть полезны при выборе специфической этиопатогенетической консервативной терапии.

В целом из обзора литературы следует, что в настоящее время не существует способа, позволяющего всегда точно идентифицировать возбудителя инфекционного поражения клапана сердца.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому является способ идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца не основании бактериологического исследования крови и/или содержимого внутрисердечных абсцессов (посев на жидкие и плотные питательные среды), используемый при диагностике ИЭ, как упомянуто выше, и принятый авторами за прототип (Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология: Учебник. - 2-е изд., перераб. и доп. - Медицина, 2003. - С.49-51).

Способ имеет следующие недостатки: методика бактериологического исследования не охватывает спектр вирусной инфекции, трудно культивируемые штаммы грибов и бактерий, требует длительного времени для получения результата.

Кроме того, по литературным данным (Резник И.И. Инфекционный эндокардит за четверть века: клинико-морфологическая эволюция, лечебная тактика. - Екатеринбург: Изд-во УрГУПС, 2004. - с.23, 24) в клинических наблюдениях положительная гемокультура выявлена в восьмидесяти восьми случаях из двухсот девяносто четырех, что составляет 30%, за период 1990-2000 г., тогда как за предыдущий десятилетний период этот показатель составляет 40% (в 29 случаях из 74). В настоящее время сообщается о большой частоте стерильных гемокультур: в остром периоде заболевания она составляет 50-55%, а в подостром достигает 57-87%. Однако и положительный ответ при исследовании гемокультуры вовсе не значит, что он соответствует истинному возбудителю, вызвавшему поражение клапанов сердца, так как возбудитель выделен не из самого очага поражения, а также нередки случаи экзогенного засорения биоматериала, транзиторной бактериемии из других источников.

В связи с этим задачей изобретения является создание нового, более чувствительного способа идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца за счет достижения нового технического результата.

Технический результат изобретения заключается в возможности проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации любого, из известных, возбудителя, выделенного из тканей клапана сердца.

Технический результат достигается тем, что в известном способе идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца на основании исследования биологической ткани, согласно изобретению интраоперационно, в стерильных условиях осуществляют забор фрагмента иссеченного клапана, помещают в раствор консерванта, для исследования вносят в лизирующий раствор, гомогенизируют ультразвуком (УЗ) до молекулярного уровня, исследуют с помощью ПЦР и идентифицируют возбудитель.

Отличительными признаками предлагаемого способа от прототипа являются исследование непосредственно ткани пораженного клапана, обеспечение ее стерильности, обработка (гомогенизация) исследуемой ткани УЗ до молекулярного уровня, идентификация всего известного спектра инфекции, включая вирусы и грибы с помощью ПЦР.

До настоящего времени проведение ПЦР для твердых тканей, в частности тканей клапана сердца, не представлялось возможным. Исследования показали, что ткань клапана сердца (фрагмент клапана весом не более 0,005 г), предварительно обработанную в лизирующем растворе по методике проведения ПЦР, необходимо гомогенизировать до молекулярного уровня. С этой цепью использовали УЗ установку (FinnSonic m 030), наполненную дистиллированной водой. По максимальному уровню экспрессии β-актина определили время воздействия УЗ, в течение которого ткань клепана сердца гомогенизируется до молекулярного уровня. Как показали исследования, максимальная экспрессия β-актина на конкретной УЗ установке наблюдается при воздействии УЗ (мощность - 200 Вт, частота - 40 кГц) в течение 40 минут. Таким образом, был определен режим гомогенизации ткани клапана сердца УЗ при использовании УЗ установки FinnSonic m 030.

Целесообразно оставшуюся часть фрагмента иссеченного клапана сердца банкировать в растворе консерванта при t=-30°С для повторных исследований.

Способ осуществляют следующим образом.

Во время кардиохирургической операции, в стерильных условиях осуществляют забор фрагмента иссеченного клапана сердца, помещают фрагмент в стерильную пробирку с раствором ЭДТА (Этилендиаминтетраацетата динатриевая соль).

Обработку образца для проведения ПЦР проводят в соответствии с протоколом, включающим комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот (НК). Лизирующий раствор (100 мл): гуанидина тиацианат - 47,25, натрия цитрат (1 М) - 2,5 мл, саркозил (10%) - 5,0 мл, 2-β меркаптоэтанол (14 М) - 0,72 мл, DEPC - Н₂O - до 100 мл. Реагент для преципитации: изопропиловый спирт, Промывочный раствор №1: этанол 75%. Промывочный раствор №2: ацетон. Буфер для растворения НК; DEPC - Н₂O.

Проведение ПЦР для фрагмента клапана сердца осуществляют, используя инструкцию по применению метода ПЦР, следующим образом.

1. Внести 300 мкл лизирующего раствора в пластиковую пробирку емкостью 1,5 мл, не касаясь ее края.

2. Внести в пробирку фрагмент (˜0,005 г) митрального/аортального клапана.

3. Поместить пробирку в ультразвуковую установку FinnSonic m 030: при мощности - 200 Вт, частоте - 40 кГц время УЗ обработки - 40 минут.

4. Добавить 400 мкл реагента для преципитации НК и перемешать пробу на вортексе в течение 3-5 секунд.

5. Центрифугировать пробирку при 14000 об/мин в течение 5 минут.

6. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).

7. Добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5 раз аккуратно перевернуть пробирку.

8. Центрифугировать пробирку при 14000 об/мин и течение 5 минут.

9. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).

10. Добавить к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и 3-5 раз аккуратно перевернуть пробирку.

11. Центрифугировать пробирку при 14000 об/мин в течение 5 минут.

12. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).

13. Открыть крышку пробирки и высушить осадок при температуре 65°С в течение 10 минут.

Осадить капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 секунд, Препарат НК готов для постановки реакции обратной транскрипции (РНК) или проведению ПЦР (ДНК).

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1, Больная О., 56 лет, проходила обследование и лечение по поводу ИЭ с поражением митрального клапана (митральная недостаточность (IVст.). Диагноз подтвержден ЭХО-КГ данными: вегетации на митральном клапане, митральная недостаточность IV ст. Гемокультура (ответ через 14 дней) - отрицательная, возбудителя выявить не удалось. Выполнена операция 18.05.2005 г.: протезирование митрального клапана, иссеченный клапан отправлен на гистологическое исследование, ответ получен через 7 дней: картина клапанного эндокардита с подострым течением. Методом ПЦР в течение суток исследованы фрагменты створок иссеченного клапана, обнаружено: P.gingivalis, Actinobacillus actinom, S. Mutans.

Пример 2. Больной И., 53 лет, проходил обследование и лечение по поводу миксоматозной дегенерации митрального клапана, митральная недостаточность IV ст. ЭХО-КГ: выраженный пролапс митрального клапана, нельзя исключить отрыв хорд, митральная недостаточность IV ст. Протезирование митрального клапана от 10.10.2005 г. Гистологическое исследование иссеченного клапана, ответ через 9 дней: фиброзные изменения клапана. Методом ПЦР в течение суток исследованы фрагменты створок иссеченного клапана, обнаружено: S. Mutans.

Пример 3. Больной С., 45 лет, проходил обследование и лечение по поводу хронического первичного грибкового эндокардита с поражением аортального клапана, аортальная недостаточность IV ст. Гемокультура 10.03.2005 г. - Candida. Протезирование аортального клапана 01.12.2005 г. Методом ПЦР в течение суток исследованы фрагменты створок иссеченного клапана, обнаружено: Candida albicans.

Пример 4. Больная К., 54 лет, проходила обследование и лечение по поводу ревматизма сочетание-комбинированных пороков митрального (MC>MH), трикуспидального (ТС>=ТН), аортального (АС>АН) клапанов. ЭХО-КГ: критический трикуспидальный стеноз, умеренный митральный стеноз, митральная недостаточность I ст., умеренный аортальный стеноз, аортальная недостаточность I ст. Протезирование митрального клапана 03.10.2005 г. Гистологическое заключение через 10 дней; склероз" кальциноз, гиалиноз, очаговое мукоидное набухание створок. Посев крови через 10 дней отрицательный. Методом ПЦР в течение суток исследованы фрагменты створок иссеченного клапана, обнаружено: B.forsythus.

Всего предлагаемым способом было обследовано 40 человек, из них у 19 идентифицирован возбудитель инфекционного поражения клапана сердца, при этом диагноз инфекционный эндокардит до операции был установлен клинически только у 10 пациентов и идентифицирован возбудитель методом гемокультуры только у 4. У всех больных с выявленной инфекцией методом ПЦР в створках иссеченного клапана отмечалась длительная лихорадка в послеоперационном периоде и более длительный срок пребывания в стационаре по сравнению с больными, у которых исследование фрагментов иссеченного клапана методом ПЦР не обнаружило инфекции.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

1. Идентификация возбудителя производится непосредственно в месте поражений.

2. Ультразвуковая обработка исследуемого образца позволяет проведение ПЦР для идентификации возбудителя.

3. Возможность проведения ПЦР позволяет в течение суток при минимальном объеме исследуемого материала идентифицировать весь известный спектр инфекции, включая вирусы и грибы.

4. Методика осуществления способа исключает занос инфекции извне.

5. Имеется возможность длительного хранения (банкирования) забранного материала с геномами возбудителя, которые могут быть повторно типированы в случае необходимости.

6. Способ обладает более высокой чувствительностью и точностью.

Способ идентификации возбудителя инфекционного поражения клапана сердца на основании исследования биологической ткани, отличающийся тем, что интраоперационно, в стерильных условиях осуществляют забор фрагмента иссеченного клапана, помещают в раствор консерванта, для исследования вносят в лизирующий раствор, гомогенизируют ультразвуком до молекулярного уровня на ультразвуковой установке мощностью 200 Вт, частотой 40 кГц в течение 40 мин, исследуют с помощью полимеразной цепной реакции и идентифицируют возбудитель.