Способ микроклонального размножения картофеля
Владельцы патента RU 2329639:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" (RU)
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Культивируют оздоровленные растения картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу. Получают растения-регенеранты. Затем их высаживают в грунт. В питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Проводят микрочеренкование исходных растений на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт. Выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность и ускорить рост эксплантантов, увеличить коэффициент размножения растений-регенерантов и количества микроклубней in vitro, а также улучшить приживаемость растений-регенерантов при пересадке в грунт. 6 табл.
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, картофелеводству, семеноводству картофеля, а именно к ускоренному размножению семенного картофеля на безвирусной основе.
Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro. Черенкование проводят на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по Мурасиге-Скугу, сахарозу, Fe-хелата, глицерин, ИУК (гетероауксина), агар-агара, витамины по Уайту и коричную кислоту. Полученные растения высаживают в грунт (RU №2181942, МПК7 А01Н 4/00, С12N 5/02, опубл. 10.05.2002 г.).
Недостатками данного способа являются низкая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения in vitro, кроме того, приживаемость растений, выращенных на питательной среде in vitro при пересадке в грунт, составляет всего 70-80%.
Технический результат заключается в повышении жизнеспособности и ускорении роста эксплантов, увеличении коэффициента размножения растений-регенерантов и количества микроклубней in vitro, а также улучшении приживаемости растений-регенерантов при пересадки в грунт.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.
Увеличение или уменьшение температуры выращивания растений-регенерантов от предлагаемой (23-25°С днем и 17-18°С ночью) и концентрации сахарозы в среде (20 г/л) приводит к снижению роста растений-регенерантов и уменьшению коэффициента их размножения.
Изменение пределов температуры получения микроклубней, предлагаемой по данному способу (8-10°С), и концентрации сахарозы в среде (80 г/л) приводит к уменьшению выхода микроклубней и их массы.
При добавлении в питательную среду 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты происходят более быстрый рост стебля, формирование хорошо развитой корневой системы и образование большого числа междоузлий, что позволяет вести повторное микрочеренкование через 3-4 недели. В результате происходит повышение коэффициента размножения, в связи с чем увеличивается выход пробирочных растений через 3 месяца после посадки одного исходного до 1,5-2 тыс. штук, в зависимости от сорта. Корневая система растений-регенерантов картофеля in vitro, культивируемых на данной среде, более мощная, и такие растения лучше укореняют в грунте (процент выживания 90-98%).
Опыты проводились в лаборатории клеточной инженерии кафедры ботаники и физиологии растений ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева» с коллекционными безвирусными сортами картофеля. Питательная среда в контрольном варианте (табл.1) готовилась по прототипу, в опытном - с добавлением 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты и 1000-2000 мг/л активированного угля.
| Таблица 1. | ||
| Состав питательной среды, мг/л | Контроль (прототипя) | Предлагаемое решение |
| Аммоний азотнокислый | 1650 | 1650 |
| Калий азотнокислый | 1900 | 1900 |
| Кальций хлористый двухводный | 440 | 440 |
| Магний сернокислый семиводный | 370 | 370 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 170 | 170 |
| Борная кислота | 6,2 | 6,2 |
| Марганец сернокислый четырехводный | 27,7 | 27,7 |
| Цинк сернокислый четырехводный | 8,6 | 8,6, |
| Калий йодистый | 0,83 | 0,83 |
| Натрий молибденовокислый двухводный | 0,25 | 0,25 |
| Медь сернокислая пятиводная | 0,025 | 0,025 |
| Кобальт хлористый шестиводный | 0,025 | 0,025 |
| Трилон Б | 373 | 373 |
| Железо сернокислое семиводное | 27,8 | 27,8 |
| Глицин | 3 | 3 |
| Коричная кислота | 0,5-1,0 | - |
| Гетероауксин | 1 | - |
| Тиамин | 1,0 | 0,5 |
| Пиридоксин | 0,2 | 0,5 |
| Пантотенат кальция | 0,2 | - |
| Активированный уголь | - | 1000-2000 |
| Аскорбиновая кислота | - | 1-2 |
| Сахароза | 30000 | 20000-80000 |
| Агар-агар | 7000,0 | 7000 |
| Вода | до 1 л | до 1 л |
Способ осуществляют следующим образом.
В вымытые и высушенные пробирки (19×210 мм) наливают по 7-10 мл агаризированной среды, закрывают ватно-марлевыми пробками, составляют в медицинские бюксы, автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°С. Используют 2 варианта питательных сред, которые различают по содержанию сахарозы. Для выращивания растений-регенерантов используют питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, сахарозу, глицин, агар-агар, витамины по Уайту, 20 г/л сахарозы и дополнительно 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, а для получения микроклубней аналогичную питательную среду, содержащую 80 мг/л сахарозы.
Микрочеренкование исходных растений производят в ламинар-боксе. Пробирочные растения, имеющие 12-15 листьев, извлекают из пробирки и черенкуют на чашке Петри. В пробирки высаживают с помощью пинцета по 2 однопочковых черенка из апикальной (верхушечной) и средней частей растения на питательную среду, содержащую 20 г/л сахарозы. Пробирки с черенками подписывают и выставляют в штативах на стеллажи с освещением 4-5 тыс. люкс люминесцентными лампами, фотопериод 16 ч и поддерживают температуру ночью 17-18°С, днем - 23-25°С для дальнейшего получения растений-регенерантов. Пробирки с черенками базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), высаженными на питательную среду, содержащую 80 г /л сахарозы, помещают в темноту при температуре 8-10°С для дальнейшего клубнеобразования.
В табл.2 представлена динамика развития растений-регенератов картофеля сорта Невский in vitro в зависимости от состава питательной среды по предлагаемому способу, (содержащей 20 г/л сахарозы).
| Таблица 2. | |||
| Питательная среда | Возраст растения-регенеранта, сут. | ||
| 10 | 20 | 30 | |
| Длина корня, мм | |||
| Прототип | 10,1±0,5 | 21,7±0,6 | 36,4±0,8 |
| Среда 1 | 11,7±0,4 | 24,6±0,5 | 40,1±0,7 |
| Среда 2 | 12,3±0,3 | 25,1±0,7 | 49,7±0,8 |
| Среда 3 | 14,3±0,4 | 25,7±0,5 | 48,3±0,7 |
| Среда 4 | 12,5±0,8 | 25,8±0,4 | 47,1±0,5 |
| Длина побега, см | |||
| Прототип | 3,1±0,5 | 5,7±0,6 | 8,4±0,8 |
| Среда 1 | 3,7±0,3 | 6,6±0,2 | 9,1±0,7 |
| Среда 2 | 3,9±0,3 | 7,1±0,7 | 10,7±0,8 |
| Среда 3 | 4,3±0,7 | 7,7±0,3 | 11,3±0,7 |
| Среда 4 | 4,9±0,8 | 8,8±0,4 | 12,2±0,5 |
| Количество узлов/листьев, шт. | |||
| Прототип | 3,0±0,1 | 5,7±0,6 | 8,1±1,7 |
| Среда 1 | 3,2±0,2 | 6,3±0,4 | 9,1±0,7 |
| Среда 2 | 3,4±0,3 | 6,6±0,8 | 9,7±0,6 |
| Среда 3 | 3,3±0,7 | 6,8±0,7 | 10,3±0,7 |
| Среда 4 | 4,1±0,8 | 8,8±0,4 | 11,2±0,5 |
| Примечания: | |||
| Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты | |||
| Среда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты | |||
| Среда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля | |||
| Среда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля |
К концу первой недели растения-регенеранты из микрочеренков в варианте с активированным углем и аскорбиновой кислотой были на 0,5-1,5 см выше растений контрольного варианта и достигали 3,5-4,9 см. В условиях опытной среды растения раньше и быстрее формировали корневую систему: к концу второй недели длина корней растений-регенерантов достигла 1,1-1,5 см, а к концу третьей - 2,5-2,6 см, в то время как в контрольном варианте она составила лишь 0,5-1,0 см и 2,0-2,2 см. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. В течение третьей недели максимальный ежедневный прирост у растений по предлагаемому способу составил 5-8 мм, у растений контрольной группы 3-6 мм. Растения контрольного варианта к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 2,0-3,5 см. К повторному черенкованию в опытных вариантах растения были готовы к концу 3-й - началу 4-й недели. Количество черенков к этому сроку на опытных растениях было 8-11 против 6-8 на контрольных (табл.3).
| Таблица 3 | |||||
| Сорт | Контроль (прототип) | Среда 1 | Среда 2 | Среда 3 | Среда 4 |
| Жуковский ранний | 10,3±0,4 | 12,3±0,4 | 12,2±0,1 | 13,5±0,2 | 15,2±0,1 |
| Удача | 11,3±0,4 | 12,3±0,4 | 12,2±0,1 | 13,5±0,2 | 15,2±0,1 |
| Невский | 9±0,7 | 9,1±0,2 | 9,7±0,6 | 10,3±0,7 | 11,2±0,5 |
| Никулинский | 7,2±0,7 | 7,5±0,2 | 8,7±0,6 | 9,3±0,3 | 9,7±0,1 |
| Примечания: | |||||
| Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты | |||||
| Среда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты | |||||
| Среда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля | |||||
| Среда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля |
В табл.4 представлены результаты исследований по динамике развития растений-регенерантов, полученных из различных типов черенков картофеля сорта Невский in vitro, по предлагаемому способу на среде №4, содержащей 20 г/л сахарозы и дополнительно 2000 мг/л активированного угля, 2 мг/л аскорбиновой кислоты.
| Таблица 4 | |||
| Тип экспланта | Возраст растения-регенеранта, сут. | ||
| 10 | 20 | 30 | |
| Длина корня, мм | |||
| апикальный | 14,3±0,1 | 25,7±0,5 | 49,7±0,8 |
| средний | 12,3±0,3 | 25,1±0,7 | 48,3±0,7 |
| базальный | 11,7±0,2 | 24,6±0,5 | 40,1±0,7 |
| Длина побега, см | |||
| апикальный | 4,9±0,8 | 8,8±0,4 | 16,2±0,5 |
| средний | 3,9±0,3 | 7,1±0,7 | 12,7±0,8 |
| базальный | 3,1±0,5 | 5,7±0,6 | 10,4±0,8 |
| Количество узлов/листьев, шт. | |||
| апикальный | 4,1±0,8 | 8,8±0,4 | 15,2±0,5 |
| средний | 3,4±0,3 | 6,6±0,8 | 12,7±0,6 |
| базальный | 3,3±0,4 | 6,8±0,7 | 10,3±0,7 |
К концу первой недели растения-регенеранты, полученные из микрочеренков апикальной (верхушечной) и средней частей растения, были на 0,5-1,0 см выше растений, полученных из базальной части. Они раньше и быстрее формировали корневую систему. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. Растения, полученные из черенков базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 1,5-3 см. К повторному черенкованию в опытном варианте черенки, полученные из апикальной и средней части растений, были готовы к концу 3-й недели, а базальной части - к 4-5-й неделе.
Коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля через 4 недели после черенкования представлен в табл.5.
| Таблица 5 | |||
| Сорт | Апикальные | Средние | Базальные |
| Жуковский ранний | 15,2±0,1 | 13,5±0,2 | 12,3±0,4 |
| Удача | 15,3±0,2 | 12,2±0,1 | 11,3±0,4 |
| Невский | 11,2±0,5 | 9,7±0,6 | 9,1±0,2 |
| Никулинский | 9,7±0,1 | 9,3±0,3 | 7,5±0,2 |
В то же время способность к клубнеобразованию у черенков различных ярусов растения различна. Черенки апикальной части растения образуют незначительное количество мелких клубней, причем значительно позже, чем черенки из базальной части растения, которые образовывают крупные микроклубни. В опытах выявлено, что масса микроклубней, полученных на однопочковых микрочеренках картофеля in vitro, выше при использовании черенков базальной части (табл.6).
Полученные предлагаемым способом микроклубни были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующим выращивании in vivo формировали здоровые растения
| Таблица 6 | |||
| Сорт | Масса микроклубня, мг | ||
| Апикальная часть | Средняя часть | Базальная часть | |
| Жуковский ранний | 12,8±1,5 | 36,8±2,1 | 81,6±6,7 |
| Удача | 19,8±1,4 | 46,8±5,8 | 95,8±5,7 |
| Невский | 17,2±2,7 | 25,2±2,6 | 90,3±3,4 |
| Никулинский | 25,2±2,6 | 46,3±3,5 | 100,8±3,5 |
Полученные растения-регенеранты картофеля с хорошо развитыми механическими и проводящими тканями стебля, обширной корневой системой и хорошо развитыми листьями при пересадке в грунт легко адаптировались к условиям in vivo, что обеспечивало их высокую приживаемость (90-98%) по сравнению с прототипом (70-80%).
Отсюда следует, что предлагаемый способ позволяет повысить коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля in vitro за 3 месяца последовательного черенкования на 0,2-1,5 тыс. штук от одного исходного за счет сокращения периода между повторными черенкованиями, увеличения выхода микрочеренков и пробирочных растений и их лучшей приживаемости в грунте, а также дополнительного получения микроклубней.
Способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части, причем выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.
