Иммуностимулирующие фосфортиоатные cpg-олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирные связи, способ иммуномодуляции, способ стимулирования иммунного ответа

Настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим фосфортиоатным CpG-олигонуклеотидов, которые могут быть использованы для стимуляции иммунного ответа. 17 н. и 32 з.п. ф-лы, 43 ил., 19 табл.

 

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, а также к иммуностимулирующим олигонуклеотидам, обладающим пониженным воспалительным действием на почки, к их композициям и к способам применения этих иммуностимулирующих нуклеиновых кислот.

Предшествующий уровень техники

Бактериальная ДНК обладает иммуностимулирующим действием, направленным на активацию В-клеток и клеток - натуральных киллеров, тогда как ДНК позвоночных не обладает подобным действием (Tokunaga Т., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga Т., et al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; см. также обзор в работе Kreig, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, С.А. Stein and A.M. Kreig (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448). В настоящее время известно, что эти иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом присутствия неметилированных динуклеотидов CpG с конкретным набором оснований (мотивов CpG), которые широко представлены в бактериальных ДНК, но недостаточно представлены в ДНК позвоночных, где они являются метилированными (Krieg et ai., 1995, Nature 374:546-549; Krieg 1999, Biochim. Biophys. Acia 93321:1-10). Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК могут быть имитированы синтетическими олигодезоксинуклеотидами (ODN), содержащими вышеупомянутые мотивы CpG. Такие CpG-ODN обладают сильным стимулирующим действием на человеческие и мышиные лейкоциты, включая пролиферацию В-клеток; секрецию цитокинов и иммуноглобулинов; цитолитическую активность природных киллеров (NK) и секрецию IFN-γ; активацию дендритных клеток (ДК) и антиген-презентирующих клеток для экспрессии ко-стимулирующих молекул и секреции цитокинов, а в частности, Th1-подобных цитокинов, которые играют важную роль в стимуляции вырабатывания Th1-подобных Т-клеточных ответов. Эти иммуностимулирующие эффекты нативной фосфодиэфирной основной цепи CpG-ODN являются в высокой степени CpG-специфическими в том смысле, что они резко снижаются в случае, когда указанный CpG-мотив является метилированным или замененным на GpC или как-либо иначе удален или модифицирован (Krieg et al., 1995, Nature 374:546-549; Hartmann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9305-10).

В ранних исследованиях было показано, что иммуностимулирующий CpG-мотив имеет формулу пурин-пурин-CpG-пиримидин-пиримидин (Krieg et al., 1995, Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996, J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998, EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Однако в настоящее время очевидно, что мышиные лимфоциты достаточно хорошо реагируют на фосфодиэфирные CpG-мотивы, которые не соответствуют этой "формуле" (Yi et al., 1998, J. Immunol. 160:5898-5906), и это справедливо для человеческих В-клеток и дендритных клеток (Hartmann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9305-10; Liang, 1996, J. Clin. Invest. 98:1119-1129).

Недавно было описано несколько различных классов нуклеиновых кислот, содержащих CpG. Один класс содержит сильные активаторы В-клеток, но относительно слабые индукторы активации IFN-α и NK-клеток, и этот класс был назван В-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты класса В обычно являются полностью стабилизированными и содержат неметилированный динуклеотид CpG с определенным предпочтительным набором оснований. См. например, патенты США №№ 6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты другого класса активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; и этот класс был назван С-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты С-класса, как было впервые определено, обычно являются полностью стабилизированными и содержат последовательность типа последовательности В-класса и GC-богатый палиндром или последовательность, близкую к палиндромной последовательности. Этот класс был описан в одновременно рассматриваемой предварительной заявке на патент США № 60/313273, поданной 17 августа 2001, и в заявке на патент США № 10/224523, поданной 19 августа 2002, а также в родственной заявке на патент РСТ, РСТ/US02/26468, опубликованной под номером Международной публикации WO 03/015711.

Краткое описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что иммуностимулирующие свойства CpG-содержащих нуклеиновых кислот В-класса и С-класса и других стабизизированных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот могут быть сохранены или даже улучшены путем селективного включения одной или нескольких нестабилизированных связей между определенными нуклеотидами. Такими нестабилизированными связями предпочтительно являются природные связи, то есть фосфодиэфирные связи или фосфодиэфироподобные связи. Нестабилизированная связь обычно, но необязательно является относительно чувствительной к расщеплению нуклеазой. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению содержат, по крайней мере, одну нестабилизированную связь, расположенную между 5'-пиримидином (Y) и смежным 3'-пурином (Z), а предпочтительно гуанином (G), где и 5'Y, и 3'Z являются внутренними нуклеотидами.

Подобно полностью стабилизированным иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для индуцирования Th1-подобного иммунного ответа. В соответствии с этим иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве адъювантов для вакцинации, и они могут быть также использованы для лечения заболеваний, включая злокачественную опухоль, инфекционное заболевание, аллергию и астму. Очевидно, что эти нуклеиновые кислоты могут быть особенно эффективными для лечения любых состояний, которые требуют продолжительного или многократного введения иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты независимо от цели ее введения.

Несмотря на то что полностью стабилизированные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты предназначены для многоцелевого применения, однако в некоторых вариантах иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению в отличие от вышеуказанных полностью стабилизированных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот имеют такие преимущества, как повышенная эффективность и пониженная токсичность.

Настоящее изобретение относится частично к иммуностимулирующим CpG-содержащим олигонуклеотидам. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему формулу: 5'T*C*G*T*CGTTTTGAN₁CGN₂*T*T3' (SEQ ID NO:296). В олигонуклеотиде N₁ состоит из 0-6 нуклеотидов, а в N₂ состоит из 0-7 нуклеотидов. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 2 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах N₁ состоит из 0-2 нуклеотидов. Этот олигонуклеотид имеет длину предпочтительно в 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

Символ _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

Предпочтительным олигонуклеотидом является:

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему 5'T*C*G*(T*/A*)TN₃CGTTTTN₄CGN₅*T*T3' (SEQ ID NO:301). N₃ состоит из 0-4 нуклеотидов. N₄ состоит из 1-5 нуклеотидов. N₅ состоит из 0-7 нуклеотидов. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 2 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах, N₄ состоит из 1-2 нуклеотидов. Предпочтительным олигонуклеотидом является олигонуклеотид длиной 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

Предпочтительным олигонуклеотидом является:

В соответствии с другими своими аспектами настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду: 5'T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO:306). N представляет собой любой нуклеотид. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 3 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах олигонуклеотид содержит 5 фосфодиэфирных межнуклеотидных связей. Предпочтительный олигонуклеотид имеет длину в 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

В одном из вариантов олигонуклеотид представляет собой: 5'T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*Т*C*G*T*T3' (SEQ ID NO:310). Символ _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид содержит, по крайней мере, один мотив С_G с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. В еще одном варианте осуществления изобретения данный олигонуклеотид не содержит каких-либо мотивов С_G с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему структуру 5'T*C_G(N₆C_GN₇)_2-3T*С_G*T*T3' (SEQ ID NO:311-312). N₆ и N₇, независимо, имеют длину 1-5 нуклеотидов, а олигонуклеотид имеет длину в 16-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₆ представляет собой один нуклеотид, например, N₆ может представлять собой Т или А. В некоторых вариантах изобретения N₇ представляет собой пять нуклеотидов, например, N₇ может представлять собой пять пиримидинов или TTTTG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет структуру:

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему структуру 5'T*CGCGN₈CGCGC*GN₉3' (SEQ ID NO:315). N₈ имеет длину 4-10 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив С_G. N₉ имеет длину 0-3 нуклеотида. Олигонуклеотид имеет длину 15-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₈ содержит, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG. В других вариантах осуществления изобретения N₈ представляет собой PuCGPyPyCG или PuCGPyPyCGCG. N₈ необязательно представляет собой ACGTTCG. N₉ может содержать, по крайней мере, один мотив CG, такой как CCG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет структуру:

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему формулу: 5'T*T*GX₁X₂TGX₃X₄T*T*T*T*N₁₀T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO:318). N₁₀ имеет длину 4-8 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив С_G. Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ независимо представляют собой С или G. Олигонуклеотид имеет длину 24-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₁₀ содержит, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

В других вариантах олигонуклеотид имеет структуру: 5'T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3' (SEQ ID NO:321).

В некоторых аспектах по настоящему изобретению ODN представляет собой олигонуклеотид, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, включающему октамерную последовательность, содержащую, по крайней мере, один динуклеотид YZ, имеющий фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и, по крайней мере, 4 нуклеотида Т, где Y представляет собой пиримидин или модифицированный пиримидин, а Z представляет собой гуанозин или модифицированный гуанозин и где олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь.

Y может представлять собой неметилированный С. Z может представлять собой гуанозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения Y представляет собой цитозин или модифицированные цитозиновые основания, выбранные из группы, состоящей из 5-метилцитозина, 5-метилизоцитозина, 5-гидроксицитозина, 5-галогеноцитозина, урацила, N4-этилцитозина, 5-фторурацила и водорода. В других вариантах осуществления изобретения Z представляет собой гуанин или модифицированное гуаниновое основание, выбранное из группы, состоящей из 7-деазагуанина, 7-деаза-7-замещенного гуанина (такого как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенного гуанина, гипоксантина, 2,6-диаминопурина, 2-аминопурина, пурина, 8-замещенного гуанина, такого как 8-гидроксигуанин и 6-тиогуанин, 2-аминопурина и водорода.

В некоторых вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность содержит мотив ТТТТ. В других вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность содержит два динуклеотида YZ. Оба динуклеотида YZ, но необязательно, имеют фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

где * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид имеет длину 8-40 нуклеотидов.

Фосфодиэфироподобная связь может представлять собой боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp. Стабилизированными межнуклеотидными связями являются, но необязательно, фосфортиоатная, фосфордитиоатная, метилфосфонатная, метилфосфортиоатная или любая их комбинация.

Олигонуклеотид может иметь 3'-3'-связь с одним или двумя доступными 5'-концами. В некоторых предпочтительных вариантах олигонуклеотид имеет два доступных 5'-конца, каждым из которых является 5'TCG.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему: 5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO:368). По крайней мере, один динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, а олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему 5'GNC3', где N представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-10 нуклеотидов; которая, по крайней мере, на 50% состоит из Т и не содержит динуклеотид CG, а олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения N содержит мотив ТТТТ. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из G*T*T*T*T*G*T*C и G*T*T*T*T*G*А*C, где * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей, по крайней мере, один внутренний динуклеотид "пиримидин-пурин" (YZ) и необязательно динуклеотид "пиримидин-гуанозин" (YG), и химерная основная цепь, где, по крайней мере, один внутренний динуклеотид YZ имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, где каждый дополнительный внутренний динуклеотид YZ имеет, но необязательно, фосфодиэфирную, фосфодиэфироподобную или стабилизированную межнуклеотидную связь и где все остальные межнуклеотидные связи являются стабилизированными. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество внутренних динуклеотидов YZ, каждый из которых имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения каждый внутренний динуклеотид YZ имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, _ означает фосфодиэфир, U означает 2'-дезоксиурацил, а 7 означает 7-деазагуанин.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, содержащей химерную основную цепь и, по крайней мере, одну последовательность N₁YGN₂, где в каждой последовательности N₁YGN₂ YG независимо представляет собой внутренний динуклеотид "пиримидин-гуанозин" (YG), N₁ и N₂ независимо представляют собой любой нуклеотид и где, по крайней мере, в одной последовательности N₁YGN₂ и необязательно в каждой дополнительной последовательности N₁YGN₂: динуклеотид YG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, при этом N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, либо N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, где все остальные межнуклеотидные связи являются стабилизированными.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество последовательностей N₁YGN₂, где в каждой последовательности N₁YGN₂: динуклеотид YG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, при этом N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, либо N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG, имеющим фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, является CG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG, имеющим фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, является TG.

В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является фосфодиэфир. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфироподобной связью является боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp.

В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированные межнуклеотидные связи выбраны из группы, состоящей из фосфортиоатной, фосфордитиоатной, метилфосфонатной, метилфосфортиоатной и любой их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированными межнуклеотидными связями является фосфортиоатная связь.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты В-класса. В одном из вариантов осуществления изобретения указанной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты С-класса.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 4-100 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-40 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-19 нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты не является антисмысловым олигонуклеотидом; олигонуклеотидом, образующим тройную спираль; или рибозимом.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, а G-N₂-С содержит 1 или 2 стабилизированных связи.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-20 нуклеотидов, а G-N₂-С содержит, по крайней мере, 5 стабилизированных связей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁, N₂ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь и где указанный олигонуклеотид не является антисмысловым олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, образующим тройную спираль, или рибозимом.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

Х₁-N₁-(GTCGTT)_n-N₂-Х₂ (SEQ ID NO:18-20 и 57)

где каждый из N₁ и N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, где n=2 или n=4-6, а каждый из Х₁ и Х₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую фосфортиоатные межнуклеотидные связи и имеющую длину 3-10 нуклеотидов; и где N₁-(GTCGTT)_n-N₂ содержит, по крайней мере, одну фосфодиэфирную межнуклеотидную связь, а 3'- и 5'-нуклеотиды указанного олигонуклеотида не содержат поли-G-, поли-А-, поли-Т-, или поли-С-последовательности.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота имеет основную цепь, содержащую дезоксирибозу или рибозу.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет основную цепь, содержащую дезоксирибозу или рибозу.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид находится в фармацевтической композиции, необязательно содержащей фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид, кроме того, содержит адъювант или цитокин.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид, кроме того, содержит антиген, где указанным олигонуклеотидом является вакцина-адъювант.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген выбран из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, грибкового антигена, паразитарного антигена и опухолевого антигена. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген кодируется векторной нуклеиновой кислотой. В одном из вариантов осуществления изобретения указанным антигеном является пептидный антиген. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген ковалентно связан с олигонуклеотидом или с иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления изобретения указанный антиген не является ковалентно связанным с олигонуклеотидом или с иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации относительной эффективности или токсичности тестируемой иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Указанный способ предусматривает отбор известной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей известную последовательность, стабилизированную основную цепь и обладающей известной иммуностимулирующей активностью или токсичностью; отбор тестируемой иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей известную последовательность, фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную связь вместо стабилизированной связи между Y и N, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида YN в известной последовательности, где Y представляет собой пиримидин, а N представляет собой любой нуклеотид, и обладающей тестируемой иммуностимулирующей активностью или токсичностью; и сравнение тестируемой иммуностимулирующей активности или токсичности с известной иммуностимулирующей активностью или токсичностью для идентификации относительной активности или токсичности тестируемой иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором активности, направленной на передачу TLR9-сигнала, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором интерферона типа 1, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором IP-10, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения YN представляет собой YG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является CG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является TG.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество внутренних динуклеотидов YG, каждый из которых имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является каждый внутренний динуклеотид YG.

В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является фосфодиэфир. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфироподобной связью является боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp.

В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированные межнуклеотидные связи выбраны из группы, состоящей из фосфортиоатной, фосфордитиоатной, метилфосфонатной, метилфосфортиоатной и любой их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированная основная цепь содержит множество фосфортиоатных межнуклеотидных связей.

В одном из вариантов осуществления изобретения известной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты В-класса. В одном из вариантов осуществления изобретения известной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты С-класса.

В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 4-100 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-40 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-19 нуклеотидов.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу конструирования стабилизированной иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей длину менее чем 20 нуклеотидов. Указанный способ предусматривает отбор последовательности длиной 6-19 нуклеотидов, где указанная последовательность содержит, по крайней мере, один внутренний динуклеотид CG; отбор фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной связи между С и G, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида CG; независимый отбор фосфодиэфирной, фосфодиэфироподобной или стабилизированной связи между С и G каждого присоединенного внутреннего динуклеотида CG; и отбор стабилизированной связи для всех других межнуклеотидных связей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики аллергии или астмы. Указанный способ осуществляют путем введения субъекту описанного здесь иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для лечения или профилактики аллергии или астмы. В одном из вариантов осуществления изобретения олигонуклеотид доставляют к поверхности слизистой. В других вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид вводят в виде аэрозольной композиции. Указанный олигонуклеотид может быть введен интраназально.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции продуцирования цитокинов. Указанный способ осуществляют путем введения субъекту описанного здесь иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для индуцирования цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанные здесь иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды в комбинации с антигеном или с другим терапевтическим соединением, таким как противомикробный агент. Указанным противомикробным агентом может быть, например, противовирусный агент, противопаразитарный агент, антибактериальный агент или противогрибковый агент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, изготовленной в форме препарата пролонгировнного действия, содержащего описанные здесь иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды.

Указанная композиция может, но необязательно, содержать фармацевтический носитель, и/или она может быть приготовлена в виде препарата для доставки. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат для доставки выбран из группы, состоящей из катионных липидов; белков, проникающих в клетку, и препаратов пролонгированного действия. В одном из вариантов осуществления изобретения препарат пролонгированного действия представляет собой биологически разлагаемый полимер или микрочастицу.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа. Этот способ предусматривает введение субъекту иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для индуцирования у данного субъекта иммунного ответа. Иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид предпочтительно вводят перорально, местно, в виде препарата пролонгированного действия, через слизистую, системно, парентерально или внутримышечно. Если иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид вводят на поверхность слизистой, то он может быть доставлен в количестве, эффективном для индуцирования иммунного ответа в слизистой или системного иммунного ответа. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения поверхность слизистой выбрана из группы, состоящей из поверхности полости рта, носа, прямой кишки, влагалища и глаза.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает введение субъекту антигена, где продуцируемый иммунный ответ является ангиген-специфическим иммунным ответом. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный антиген выбран из группы, состоящей из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена и пептидного антигена.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут обладать способностью стимулировать иммунные ответы широкого спектра. Так, например, эти иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы для переориентации иммунного Th2-ответа на иммунный Th1-ответ. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы для активации иммунных клеток, таких как лимфоцит (например, В- и Т-клетки), дендритная клетка и NK-клетка. Такая активация может быть осуществлена in vivo, in vitro или ex vivo, то есть путем выделения иммунной клетки у субъекта, контактирования указанной иммунной клетки с иммуностимулирующим CpG-олигонуклеотидом в количестве, эффективном для активации иммунной клетки, и последующего введения активированной иммунной клетки указанному субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения дендритная клетка представляет раковый антиген. Указанная дендритная клетка может быть подвергнута воздействию ракового антигена ex vivo.

Иммунный ответ, продуцируемый иммуностимулирующими CpG-олигонуклеотидами, может также приводить к индукции продуцирования цитокинов, например, продуцирования IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В еще одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения злокачественной опухоли. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды также могут быть использованы для профилактики злокачественной опухоли (например, уменьшения риска развития злокачественной опухоли) у субъекта с риском развития злокачественной опухоли. Злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желчных путей; рака молочной железы; рака шейки матки; хориокарциномы; рака толстой и прямой кишки; рака эндометрия; рака желудка; внутриэпителиальной неоплазмы; лимфомы; рака печени; рака легких (например, мелкоклеточного и немелкоклеточного); меланомы; нейробластомы; рака ротовой полости; рака яичника; рака поджелудочной железы; рака предстательной железы; рака прямой кишки; саркомы; рака щитовидной железы и рака почек, а также других карцином и сарком. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака костей; рака головного мозга и ЦНС; рака соединительной ткани; рака пищевода; рака глаз; лимфомы Ходжкина; рака гортани; рака ротовой полости; рака кожи и рака яичек.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы для повышения восприимчивости злокачественных клеток к лечению злокачественной опухоли (например, к противораковой терапии), при этом необязательно путем введения иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в комбинации с противораковой терапией. Такой противораковой терапией может быть химиотерапия, вакцинная терапия (например, с применением вакцины на основе in vitro примированных дендритных клеток или вакцина на основе ракового антигена) или терапия с применением антител. Терапия с применением антител может также предусматривать введение антитела, специфичного к антигену клеточной поверхности, например, раковой клетки, где иммунный ответ приводит к продуцированию антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело может быть выбрано из группы, состоящей из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, онколима, SMART M195, ATRAGEN, оварекса, бексара, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, антитела против VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMab-G2, TNT, Gliomab-H, GHI-250, EMD-72000, LymphoCide, СМА-676, монофарма-С, 4В5, ior egf.r3, ior c5, BABS, антитела против FLK-2, MDX-260, антитела против ANA, антитела против SMART 1D10, антитела против SMART ABL364 и ImmuRAIT-CEA.

Таким образом, в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения субъекту, страдающему злокачественной опухолью, или субъекту с риском возникновения злокачественной опухоли вводят иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид в сочетании с противораковой терапией. В некоторых вариантах осуществления изобретения противораковая терапия выбрана из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, иммунотерапевтического средства и противораковой вакцины.

В еще одном варианте осуществления способов, направленных на предупреждение или лечение злокачественной опухоли, указанному субъекту может быть дополнительно введен интерферон-α.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способам профилактики заболевания у субъекта. Этот способ предусматривает регулярное введение субъекту иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в целях стимуляции восприимчивости иммунной системы субъекта к предупреждению у него данного заболевания. Примерами заболеваний или состояний, на предупреждение которых направлены профилактические способы по настоящему изобретению, являются микробные инфекции (например, заболевания, передаваемые половым путем) и анафилактический шок, вызываемый пищевой аллергией.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования естественного иммунного ответа путем введения данному субъекту иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для активации естественного иммунного ответа.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. Этот способ предусматривает введение субъекту, страдающему вирусной или ретровирусной инфекцией, или субъекту с риском возникновения вирусной или ретровирусной инфекции любой из композиций по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения такая вирусная инфекция вызывается вирусом гепатита, например вирусом гепатита В, гепатита С, ВИЧ, герпесвирусом или папиломавирусом.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики бактериальной инфекции. Этот способ предусматривает введение субъекту, страдающему бактериальной инфекцией, или субъекту с риском возникновения бактериальной инфекции любой из композиций по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики бактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления изобретения такая бактериальная инфекция вызывается внутриклеточными бактериями.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики паразитарной инфекции, предусматривающему введение субъекту, страдающему паразитарной инфекцией, или субъекту с риском возникновения паразитарной инфекции любой из композиций по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики паразитарной инфекции. В одном из вариантов осуществления изобретения такая бактериальная инфекция вызывается внутриклеточными паразитами. В другом варианте осуществления изобретения указанная паразитарная инфекция вызывается паразитами, не относящимися к гельминтам.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанным субъектом является человек, а в других вариантах - позвоночное, не являющееся человеком и выбранное из группы, состоящей из собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, индейки, козы, рыбы, обезьяны, курицы, крысы, мыши и овцы.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного TH1-ответа, предусматривающему введение указанному субъекту любой из композиций по настоящему изобретению в количестве, эффективном для продуцирования иммуного Th1-ответа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа, предусматривающему введение указанному субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества иммуностимулирующего олигонуклеотида 5'T*C*G*T*X₁*T*T3', где Х₁ имеет длину 3-30 нуклеотидов, * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи, а указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, две фосфодиэфирных межнуклеотидных связи.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания, предусматривающему введение субъекту, страдающему аутоиммунным заболеванием, или субъекту с риском возникновения у него аутоиммунного заболевания любой из композиций по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания.

В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид вводят субъекту в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии цитокинов. Такой цитокин выбирают, но необязательно, из группы, состоящей из IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ и IP-10. В других вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид вводят субъекту в количестве, эффективном для переключения иммунного Th2-ответа на Th1-ответ.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения ремоделирования дыхательных путей, предусматривающему введение субъекту олигонуклеотида, содержащего динуклеотид CG, в количестве, эффективном для лечения ремоделирования дыхательных путей. В одном варианте осуществления изобретения таким субъектом является субъект, страдающий астмой или хроническим обструктивным заболеванием легких, или курильщик. В другом варианте у указанного субъекта не обнаруживаются симптомы астмы.

В одном из аспектов настоящее изобретение также относится к применению олигонуклеотида по настоящему изобретению для стимуляции иммунного ответа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения олигонуклеотида для стимуляции иммунного ответа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа путем введения субъекту олигонуклеотида длиной, по крайней мере, в 5 нуклеотидов, в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа, где указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, один мотив иммуностимулирующего динуклеотида, в котором межнуклеотидная связь между нуклеотидами указанного динуклеотида имеет R-хиральность, и где, по крайней мере, 70% других межнуклеотидных связей указанного олигонуклеотида имеют S-хиральность.

Каждое из ограничений настоящего изобретения может охватывать различные варианты его осуществления. Из этого следует, что каждое из ограничений настоящего изобретения, содержащее любой один элемент или комбинацию элементов, может входить в каждый из аспектов настоящего изобретения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (пг/мл), секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, по сравнению с уровнем, секретируемым после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 1А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:242. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.1В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является 5'TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3' (SEQ ID NO:329). Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от шести доноров. Ниже графиков указаны уровни интерферона-альфа (пг/мл), секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой), для каждого эксперимента.

На фиг.2 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни IL-10 (пг/мл), секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, по сравнению с уровнем, секретируемым после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.2А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:242. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.2В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от шести доноров. Ниже графиков указаны уровни IL-10 (пг/мл), секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой), для каждого эксперимента.

На фиг.3 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни TNF-альфа (пг/мл), секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, по сравнению с уровнем, секретируемым после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.3А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.3В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от трех доноров. Ниже графиков указаны уровни TNF-альфа (пг/мл), секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой) и ЛПС, для каждого эксперимента.

На фиг.4 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни IL-6 (пг/мл), секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, по сравнению с уровнем, секретируемым после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 4А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329 (с полноразмерной основной цепью, модифицированной фосфортиоатом). Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 4В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от трех доноров. Ниже графиков указаны уровни IL-6 (пг/мл), секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой) и ЛПС, для каждого эксперимента.

На фиг.5 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-гамма (пг/мл), секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, по сравнению с уровнями, секретируемыми после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.5А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.5В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от трех доноров. Ниже графиков указаны уровни интерферона-гамма (пг/мл), секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой) и ЛПС, для каждого эксперимента.

На фиг.6 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD69 (MFI) на NK-клетках, которые являются индикаторами активации NK-клеток после обработки этих клеток олигонуклеотидами, которые отмечены номерами вдоль оси Х данного графика и обозначены ▴, и олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 6А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.6В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328, а олигонуклеотидом позитивного контроля является SEQ ID NO:329. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ). Указанные данные представляют собой среднее, полученное от трех доноров. Ниже графиков указаны уровни экспрессии CD69 на NK-клетках, обработанных негативным контролем (средой) и ЛПС, для каждого эксперимента.

На фиг.7 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(7А) и IL-10 (7В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:313, обозначенным , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенного ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.8 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(8А) и IL-10 (8В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:314, обозначенным , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. ODN негативного контроля представляет собой SEQ ID NO:330: tccaggacttctctcaggtt. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.9 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(9А) и IL-10 (9В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:319, обозначенным , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.10 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(10А) и IL-10 (10В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:316, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.11 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(11А) и IL-10 (11В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:317, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.12 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(12А) и IL-10 (12В), продуцируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:320, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.13 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (13А) и экспрессии CD80 на моноцитах (13В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:313, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.14 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (14А) и экспрессии CD80 на моноцитах (14В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:314, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.15 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (15А) и экспрессии CD80 на моноцитах (15В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:319, обозначенные , по сравнению с уровнями, полученными с применением олигонуклеотида позитивного контроля SEQ ID NO:242, обозначенным ●. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.16 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (16А) и экспрессии CD80 на моноцитах (16В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:316, по сравнению с уровнями, полученными после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля SEQ ID NO:242 и олигонуклеотидом 5' TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT 3' (SEQ ID NO:330). Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.17 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни интерферона-альфа (IFN-α)(17А) и IL-10 (17В), продуцированные человеческими клетками МКПК после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:321, по сравнению с уровнями, полученными после обработки контрольным олигонуклеотидом SEQ ID NO:242 и олигонуклеотидом SEQ ID NO:330. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.18 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (18А) и экспрессии CD80 на моноцитах (18В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:321, по сравнению с уровнями, полученными после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля SEQ ID NO:242 и олигонуклеотидом SEQ ID NO:330. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.19 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (19А) и экспрессии CD80 на моноцитах (19В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:317, по сравнению с уровнями, полученными после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля SEQ ID NO:242 и олигонуклеотидом SEQ ID NO:330. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.20 представлена серия графиков, иллюстрирующих уровни экспрессии CD86 на В-клетках (20А) и экспрессии CD80 на моноцитах (20В) после обработки этих клеток олигонуклеотидом SEQ ID NO:320, по сравнению с уровнями, полученными после обработки олигонуклеотидом позитивного контроля SEQ ID NO:242 и олигонуклеотидом SEQ ID NO:330. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения экспериментальных точек, отложена по оси Х (мкМ).

На фиг.21 схематически представлена часть молекулы нуклеиновой кислоты, иллюстрирующая структурные признаки, включая основания (В), сахара и основную цепь с фосфодиэфирной связью (отмеченную кружком) между 5'-цитидином и 3'-гуанозином, и смежные фосфортиоатные связи.

На фиг.22 представлена гистограмма, на которой указаны относительные количества фосфортиоата (SEQ ID NO:242), мягкого олигонуклеотида (SEQ ID NO:294) и полумягкого олигонуклеотида (SEQ ID NO:241) в тканях почек, селезенки и печени через 48 часов после подкожной инъекции мышам. Олигонуклеотиды SEQ ID NO:242 и SEQ ID NO:241 имеют идентичные нуклеотидные последовательности и отличаются по составу их основной цепи.

На фиг.23 проиллюстрирована стимуляция человеческих иммунных клеток in vitro путем индуцирования цитокинов IL-6, IL-10, IFN-α и IP-10.

На фиг.24 проиллюстрирована стимуляция мышиных спленоцитов in vitro путем повышения эффективности и/или активности TLR9-ассоциированных цитокинов IL-6, IL-10, IL-12р40, IFN-α, TNF-α и IP-10, используемых в качестве индукторов, без детектируемой секреции IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 или GM-CSF.

На фиг.25 проиллюстрирована экспрессия TLR9-ассоциированных генов (IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ и IP-10) в легких, индуцированная ODN по настоящему изобретению (SEQ ID NO:313).

На фиг.26 проиллюстрировано влияние CpG-ODN на индуцированное антигеном образование лимфоузлов у мышей in vivo.

На фиг.27 продемонстрировано, что CpG-ODN подавляет Th2-ответ на сенсибилизацию антигеном.

На фиг.28 проиллюстрировано влияние на индуцированное антигеном продуцирование IgE у мышей in vivo.

На фиг.29 продемонстрировано, что антигенная стимуляция вызывает увеличение общего числа лейкоцитов, преимущественно эозинофилов, в просвете дыхательных путей.

На фиг. 30 и 32 продемонстрировано, что антигенная стимуляция вызывает увеличение общего числа лейкоцитов, преимущественно эозинофилов, в просвете дыхательных путей, и что эта стимуляция подавляется ODN по настоящему изобретению (SEQ ID NO:313) в зависимости от дозы.

На фиг. 31 и 32 продемонстрировано, что антигенная стимуляция вызывает гиперактивность дыхательных путей и что эта стимуляция подавляется ODN по настоящему изобретению (SEQ ID NO:313) в зависимости от дозы.

На фиг.33 показаны концентрации ODN в плазме крысы после i.v. и i.t.-введения при 5 мг/кг. Данные, полученные для плазмы, показали, что SEQ ID NO:313 выводится из плазмы быстрее, чем SEQ ID NO:329 после i.v. и i.t.-введения.

На фиг.34 показаны концентрации ODN в легких крысы после i.v. и i.t.-введения при 5 мг/кг. После i.v.-введения в тех же дозах, концентрации SEQ ID NO:313 в легких были ниже, чем концентрации SEQ ID NO:329. После i.t.-введения эти различия были менее заметными. Данные для SEQ ID NO:329 в легких были получены только через 48 часов после введения дозы.

На фиг.35 показаны концентрации ODN в почках крысы после i.v. и i.t.-введения при 5 мг/кг. Данные, полученные для почек, показали, что абсолютные уровни SEQ ID NO:313 в почках были более низкими, чем соответствующие концентрации SEQ ID NO:329 после i.v. и i.t.-введения.

Обработка почек олигонуклеотидом SEQ ID NO:313 после i.t.-введения показала, в частности, заметное снижение уровней этого олигонуклеотида по сравнению с уровнями, наблюдаемыми после обработки той же самой дозой SEQ ID NO:329.

На фиг.36 показаны концентрации ODN в почках крысы после i.v.-введения при 5 мг/кг.

На фиг.37 показаны концентрации ODN в почках крысы после i.t.-введения при 5 мг/кг.

На фиг.38 показаны концентрации SEQ ID NO:313 и его 8-мерного(ых) метаболита(ов) в почках крысы после i.v.-введения SEQ ID NO:313 при 5 мг/кг.

На фиг.39 показаны концентрации SEQ ID NO:313 и его 8-мерного(ых) метаболита(ов) в почках крысы после i.t.-введения SEQ ID NO:313 при 5 мг/кг.

На фиг.40 представлен график, иллюстрирующий индекс стимуляции серии полумягких ODN по сравнению с полностью фосфортиоатным ODN, имеющим такую же последовательность.

На фиг.41 представлены гистограммы, иллюстрирующие индукцию цитокинов А и В (IP-10), С (IFN) и D и Е (TNF) в ответ на введение мягкого ODN (SEQ ID NO:294), полумягкого ODN (SEQ ID NO:241) и полностью фосфортиоатного ODN (SEQ ID NO:242).

На фиг.42 представлена серия графиков, иллюстрирующих активность антитела и цитотоксических Т-лимфоцитов в ответ на введение мягкого ODN (SEQ ID NO:294), полумягкого ODN (SEQ ID NO:241) и полностью фосфортиоатного ODN (SEQ ID NO:242).

На фиг.43 представлена серия графиков, иллюстрирующих противоопухолевую терапию, проводимую на мышах с применением полумягкого ODN (SEQ ID NO:241) и полностью фосфортиоатного ODN (SEQ ID NO:242). На фиг. 43А и В показаны результаты, полученные на модели клеточной карциномы почек. На фиг. 43С и D показаны результаты, полученные на модели мышиной нейробластомы. На фиг. 43Е и F показаны результаты, полученные на мышиной модели немелкоклеточного рака легких.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к мягким и полумягким иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам. В некоторых вариантах настоящего изобретения описанные здесь иммуностимулирующие олигонуклеотиды обладают улучшенными свойствами, включая аналогичную или повышенную активность, пониженное системное воздействие на почки, печень и селезенку, и могут обладать пониженной реактогенностью в области инъекции. Хотя заявитель не намерен ограничиваться описанным механизмом, однако он предполагает, что эти улучшенные свойства ассоциированы со стратегическим расположением фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных "межнуклеотидных связей" в иммуностимулирующих олигонуклеотидах. Используемый здесь термин "межнуклеотидная связь" означает ковалентную связь основной цепи, соединяющую два смежных нуклеотида в молекуле нуклеиновой кислоты. Такая ковалентная связь основной цепи обычно представляет собой модифицированную или немодифицированную фосфатную связь, однако возможны и другие модификации. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет длину в n нуклеотидов, содержит общее число межнуклеотидных связей n-1. В соответствии с описанием настоящего изобретения указанные ковалентные связи основной цепи в иммуностимулирующих олигонуклеотидах могут быть модифицированы или немодифицированы.

В частности, фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи входят в состав "внутренних динуклеотидов". Термин "внутренний динуклеотид" в общих чертах означает любую пару смежных нуклеотидов, соединенных межнуклеотидной связью, в которой ни один из этой пары нуклеотидов не является концевым нуклеотидом, то есть ни один из этой пары нуклеотидов не является нуклеотидом, определяющим 5'- или 3'-конец данного олигонуклеотида. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет длину в n нуклеотидов, содержит в целом n-1 динуклеотидов и лишь n-3 внутренних динуклеотидов. Каждая межнуклеотидная связь во внутреннем динуклеотиде представляет собой внутреннюю межнуклеотидную связь. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет длину в n нуклеотидов, содержит в целом n-1 межнуклеотидных связей и лишь n-3 внутренних межнуклеотидных связей. Поэтому "стратегически расположенные фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи" означают фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи, расположенные между любой парой нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи между любой парой нуклеотидов, наиболее близких к 5'- или 3'-концу, отсутствуют.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того факта, что описанные здесь мягкие и полумягкие нуклеиновые кислоты обладают, по крайней мере, одинаковой, или во многих случаях большей иммуностимулирующей активностью, чем соответствующие полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды, имеющие ту же самую нуклеотидную последовательность. Этот факт оказался неожиданным, поскольку имеется широко распространенное мнение, что фосфортиоатные олигонуклеотиды в основном обладают большей иммуностимулирующей активностью, чем нестабилизированные олигонуклеотиды. Эти результаты были неожиданными, так как предполагалось, что если "смягчающая" связь расположена между важными иммуностимулирующими мотивами, то есть CG, то данная нуклеиновая кислота может обладать пониженной активностью, поскольку такая нуклеиновая кислота должна легко разлагаться с образованием фрагментов, не содержащих CG, in vivo. Вопреки этим ожиданиям многие из этих нуклеиновых кислот в действительности обладали эквивалентной или повышенной активностью in vitro и in vivo. Очевидно, что мягкие и полумягкие олигонуклеотиды являются такими же эффективными, если не более эффективными, как и их полностью стабилизированные аналоги; при этом суммарный иммуностимулирующий эффект мягких и полумягких олигонуклеотидов представляет собой равновесие между активностью и стабильностью. При высоких концентрациях это равновесие нарушается в пользу активности, то есть их активность становится выше. При низких концентрациях это равновесие нарушается в пользу стабильности, то есть преобладает относительная нестабильность, ассоциированная с восприимчивостью к нуклеазе.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к мягким олигонуклеотидам. Мягкий олигонуклеотид представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированную основную цепь, в которой фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи присутствуют только, по крайней мере, в одном внутреннем динуклеотиде "пиримидин - пурин (YZ)", или являются, по крайней мере, смежными с указанным внутренним динуклеотидом. Предпочтительным YZ является YG, динуклеотид "пиримидин-гуанозин" (YG). Этот, по крайней мере, один внутренний динуклеотид YZ сам имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. Такой фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, являющейся непосредственно смежной, по крайней мере, с одним внутренним динуклеотидом YZ, может быть связь, находящаяся со стороны 5', 3' или и 5', и 3'-концов по отношению, по крайней мере, к одному внутреннему динуклеотиду YZ. Предпочтительно фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь, являющаяся непосредственно смежной, по крайней мере, с одним внутренним динуклеотидом YZ, сама является внутренней межнуклеотидной связью. Так, например, для последовательности N₁YZN₂, где каждый из N₁ и N₂ независимо представляет собой любой один нуклеотид; динуклеотид YZ имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и кроме того, (а) N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, (b) Z и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, или (с) N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, и Z и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид.

Неограничивающими примерами мягких олигонуклеотидов являются олигонуклеотиды, представленные SEQ ID NO:105-231, SEQ ID NO:232-234, SEQ ID NO:235-237 и SEQ ID NO:238-240.

Очевидно, что мягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются относительно восприимчивыми к расщеплению нуклеазой по сравнению с полностью стабилизированными олигонуклеотидами. Не претендуя на какую-либо конкретную теорию или механизм, авторы предполагают, что мягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут расщепляться с образованием фрагментов, обладающих пониженной иммуностимулирующей активностью, или вообще не обладающих такой активностью, по сравнению с полноразмерными мягкими олигонуклеотидами. Очевидно, что введение, по крайней мере, одной чувствительной к нуклеазе межнуклеотидной связи, в частности, почти в середину олигонуклеотида, приводит к его "отключению" и тем самым к изменению фармакокинетики данного олигонуклеотида, так что в результате этого уменьшается продолжительность действия максимальной иммуностимулирующей активности указанного олигонуклеотида. Это свойство может иметь особенно важное значение в тканях и в клинических применениях, где необходимо избежать повреждений, ассоциированных с хроническим локальным воспалением или иммуностимуляцией, например, в почках.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к полумягким олигонуклеотидам. Полумягкий олигонуклеотид представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированную основную цепь, в которой фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи присутствуют только, по крайней мере, в одном внутреннем динуклеотиде "пиримидин-пурин" (YZ). Полумягкие олигонуклеотиды обычно обладают повышенной иммуностимулирующей активностью по сравнению с соответствующими полностью стабилизированными иммуностимулирующими олигонуклеотидами. Так, например, иммуностимулирующая активность полумягкого олигонуклеотида SEQ ID NO:241 в 2-5 раз выше активности полностью фосфортиоатного олигонуклеотида SEQ ID NO:242, где эти два олигонуклеотида имеют одинаковую нуклеотидную последовательность и отличаются только внутренними межнуклеотидными связями YZ, как показано ниже, где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир:

Олигонуклеотид SEQ ID NO:241 вводит внутренние фосфодиэфирные межнуклеотидные связи, в результате чего образуются динуклеотиды CG и TG (оба YZ). Из-за более высокой активности полумягких олигонуклеотидов эти полумягкие олигонуклеотиды могут быть использованы при более низких эффективных концентрациях и имеют меньшие эффективные дозы для достижения нужного биологического эффекта, чем стандартные полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

Несмотря на то что полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут давать максимальный дозозависимый ответ, кривые дозовой зависимости для полумягких олигонуклеотидов по настоящему изобретению обнаруживают монотонное возрастание (как было проанализировано путем TLR9-стимуляции), при котором наблюдается увеличение эффекта с увеличением концентраций, превышающих оптимальную концентрацию для соответствующих полностью стабилизированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Таким образом, очевидно, что полумягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут индуцировать более высокую степень иммуностимуляции, чем полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что иммуностимулирующая активность полностью стабилизированных олигонуклеотидов со слабой иммуностимулирующей активностью может быть увеличена путем введения, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида YZ с фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью. Таким образом, можно начать с олигонуклеотида со слабой иммуностимулирующей активностью, имеющий полностью стабилизированную основную цепь, и повышать его иммуностимулирующую активность путем замены стабилизированной межнуклеотидной связи, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида YG, на фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. Так, например, было обнаружено, что олигонуклеотид SEQ ID NO:243 обладает большей иммуностимулирующей активностью, чем его полностью стабилизированный аналог SEQ ID NO:244, где олигонуклеотид SEQ ID NO:244 является относительно слабым иммуностимулирующим олигонуклеотидом по сравнению с SEQ ID NO:242:

Несмотря на то что полностью стабилизированные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, имеющие длину менее 20 нуклеотидов, могут обладать умеренной иммуностимулирующей активностью по сравнению с более длинными (например, в 24 нуклеотида) полностью стабилизированными олигонуклеотидами, однако было обнаружено, что полумягкие олигонуклеотиды, имеющие длину, по крайней мере, в 16 нуклеотидов, обладают иммуностимулирующей активностью, по крайней мере, равной иммуностимулирующей активности полностью стабилизированных олигонуклеотидов, имеющих длину свыше 20 нуклеотидов. Так, например, олигонуклеотиды SEQ ID NO:245 и 5602 (которые оба являются 16-мерами с последовательностями, частично подобными последовательности SEQ ID NO:242) обладают иммуностимулирующей активностью, сравнимой с активностью SEQ ID NO:242 (24-мера).

Было обнаружено, что в некоторых случаях, где 6-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид не обладает иммуностимулирующей активностью, замена фосфортиоатной связи даже на одну фосфодиэфирную внутреннюю межнуклеотидную связь YZ приводит к образованию соответствующего 6-мера, обладающего иммуностимулирующей активностью.

Также очевидно, что вышеупомянутые свойства полумягких олигонуклеотидов обычно улучшаются с увеличением "числа" фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных межнуклеотидных связей, присутствующих во внутренних динуклеотидах YZ. Таким образом, очевидно, что в основном для данной олигонуклеотидой последовательности с пятью внутренними динуклеотидами YZ олигонуклеотид с пятью внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями YZ обладает лучшими иммуностимулирующими свойствами, чем олигонуклеотид с четырьмя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями YZ, который, в свою очередь, обладает лучшими иммуностимулирующими свойствами, чем олигонуклеотид с тремя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями YZ, который, в свою очередь, обладает лучшими иммуностимулирующими свойствами, чем олигонуклеотид с двумя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями YZ, который, в свою очередь, обладает лучшими иммуностимулирующими свойствами, чем олигонуклеотид с одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью YZ. Важно отметить, что содержание даже одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связи YZ может оказаться предпочтительным по сравнению с отсутствием внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связи YZ. Помимо числа фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных межнуклеотидных связей на эффективность может также влиять положение этих связей по всей длине нуклеиновой кислоты.

Неограничивающими примерами мягких олигонуклеотидов являются олигонуклеотиды, представленные SEQ ID NO:1-99 и 241 и SEQ ID NO:100-104.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно защищены от их быстрой деградации в сыворотке. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению также обычно защищены от быстрой деградации в большинстве тканей за исключением тканей со специфической или избыточной нуклеазной активностью, в которых может происходить деградация иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Это приводит к снижению уровня иммуностимулирующих олигонуклеотидов в этих конкретных тканях, накопление которых может так или иначе приводить к возникновению нежелательных эффектов при длительном лечении с применением резистентных к деградации олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению помимо фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных межнуклеотидных связей в предпочтительных внутренних положениях обычно содержат 5'- и 3'-концы, которые являются резистентными к деградации. Такие резистентные к деградации концы по сравнению с соответствующими немодифицированными концами могут обеспечивать любую подходящую модификацию, которая приводит к повышению резистентности к расщеплению экзонуклеазой. Так, например, 5'- и 3'-концы могут быть стабилизированы путем введения, по крайней мере, одной фосфатной модификации в основную цепь. В предпочтительном варианте настоящего изобретения по крайней мере, одной фосфатной модификацией в основной цепи у каждого конца независимо являются фосфортиоатная, фосфордитиоатная, метилфосфонатная или метилфосфортиоатная межнуклеотидные связи. В другом варианте изобретения резистентный к деградации конец содержит одно или несколько нуклеотидных звеньев, соединенных пептидными или амидными связями у 3'-конца. В объем настоящего изобретения также входят и другие стабилизированные концы, включая, но не ограничиваясь концами, описанными ниже.

Как описано выше, олигонуклеотиды по настоящему изобретению содержат фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные связи, присутствующие во внутренних динуклеотидах YG и необязательно смежные с ними. Такие динуклеотиды YG часто являются частью иммуностимулирующих мотивов. Однако при этом необязательно, чтобы олигонуклеотид содержал фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные связи в каждом иммуностимулирующем мотиве. Примером является такой олигонуклеотид, как T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:242), где четыре CpG-динуклеотида могут иметь фосфодиэфирные связи между С и G второго, третьего или четвертого CpG-динуклеотида и любые их комбинации. Для более быстрого разложения в почках тех или иных "стабилизированных олигонуклеотидов" могут быть также сохранены дополнительные фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные связи. Так, например, олигонуклеотид SEQ ID NO:242, кроме того, содержит два внутренних динуклеотида TG, каждый из которых или оба присутствуют отдельно или в комбинации друг с другом, или комбинацию внутренних динуклеотидов CG, и может иметь фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи.

Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь представляет собой тип связи, характерный для природных нуклеиновых кислот. Как показано на фиг.20, фосфодиэфирная межнуклеотидная связь содержит атом фосфора, фланкированный двумя мостиковыми атомами кислорода и также связанный двумя дополнительными атомами кислорода, один из которых является заряженным, а другой - незаряженным. Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь является особенно предпочтительной, если она играет важную роль в снижении времени полужизни олигонуклеотида в ткани.

Фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь представляет собой фосфорсодержащую мостиковую группу, которая имеет химическое и/или диастереомерное сходство с фосфодиэфиром. Мерой сходства с фосфодиэфиром является чувствительность к расщеплению нуклеазой и способность активировать РНКазу Н. Так, например, чувствительными к расщеплению нуклеазой являются фосфодиэфирные, а не фосфортиоатные олигонуклеотиды, тогда как РНКАзу Н активируют как фосфодиэфирные, так и фосфортиоатные олигонуклеотиды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является боранфосфатная (или эквивалентно, боранфосфонатная) связь. См. патент США № 5177198, патент США № 5859231, патент США № 6160109, патент США № 6207819; Sergueev et al., (1998) J.Am.Chem.Soc. 120:9417-27. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является диастереомерно чистый фосфортиоат Rp. Очевидно, что диастереомерно чистый фосфортиат Rp является более чувствительным к расщеплению нуклеазой и лучше активирует РНКазу Н, чем смешанный или диастереомерно чистый фосфортиоат Sp. Стереоизомеры CpG-олигонуклеотидов являются объектом совместно рассматриваемой заявки на патент США 09/361575, поданной 27 июля 1999, и опубликованной заявки РСТ, РСТ/US99/17100 (WO 00/06588). Следует отметить, что в целях настоящего изобретения понятие "фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь", в частности, не содержит фосфордитиоатные и метилфосфонатные межнуклеотидные связи.

Иммуностимулирующие молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеют химерную основную цепь. В целях по настоящему изобретению термин "химерная основная цепь" означает частично стабилизированную основную цепь, где, по крайней мере, одной межнуклеотидной связью является фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная связь и где, по крайней мере, одной другой межнуклеотидной связью является стабилизированная межнуклеотидная связь, причем по крайней мере, одна фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная связь, и, по крайней мере, одна стабилизированная связь являются различными. Поскольку сообщалось, что боранфосфонатные связи являются стабилизированными по сравнению с фосфодиэфирными связями, то в целях определения химерной природы основной цепи, боранфосфонатные связи могут быть классифицированы либо как фосфодиэфироподобные связи, либо как стабилизированные связи в зависимости от конкретного случая. Так, например, в одном из вариантов изобретения химерная основная цепь по настоящему изобретению может содержать, по крайней мере, одну фосфодиэфирную (фосфодиэфирную или фосфордиэфироподобную) связь и, по крайней мере, одну боранфосфонатную (стабилизированную) связь. В другом варианте химерная основная цепь по настоящему изобретению может содержать боранфосфонатные (фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные) и фосфортиоатные (стабилизированные) связи. Термин "стабилизированная межнуклеотидная связь" означает межнуклеотидную связь, которая является относительно резистентной к in vivo-деградации (например, к деградации под действием экзонуклеазы или эндонуклеазы) по сравнению с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. Предпочтительными стабилизированными межнуклеотидными связями являются, но не ограничиваются ими, фосфортиоатная, фосфордитиоатная, метилфосфонатная и метилфосфортиоатная связи. Другими стабилизированными межнуклеотидными связями являются, но не ограничиваются ими, пептидные связи, алкильные связи, дефосфо-связи и другие связи, описанные выше.

Модифицированные основные цепи, такие как фосфортиоаты, могут быть синтезированы с применением автоматизированного оборудования с применением либо фосфорамидатных, либо Н-фосфонатных методов химического синтеза. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США № 4469863, а алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная группа является алкилированной, как описано в патенте США № 5023243 и в заявке на Европатент № 092574), могут быть получены методом автоматического твердофазного синтеза с применением коммерчески доступных реагентов. Были описаны методы внесения других модификаций и замен в ДНК-основная цепь. Uhlmann E. et al., (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165. Методы получения химерных олигонуклеотидов также известны специалистам. Такие методы описаны, например, в патентах, выданных Uhlmann et al.

Смешанный ODN с модифицированной основной цепью может быть синтезирован с применением коммерчески доступного ДНК-синтезатора и стандартных фосфорамидитных методов химического синтеза (F.E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogs - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, и M.D. Matteucci & Caruthers M.H., Tetrahedron Lett. 21:719 (1980)). После присоединения PS-связи вводят путем сульфирования с применением реагента Бокажа (R.P. Iyer, W. Egan, J.B. Regan & S.L. Beaucage, J.Am.Chem.Soc., 112, 1253 (1990)) (0,075 М в ацетонитриле) или фенилацетилдисульфида (PADS) с последующим кэппированием уксусным ангидридом, 2,6-лутидином в тетрагидрофуране (1:1:8, об.:об.:об.) и N-метилимидазолом (16% в тетрагидрофуране). Эту стадию кэппирования осуществляют после реакции сульфирования в целях минимизации образования нежелательных фосфордиэфирных (РО) связей в положениях, где должна быть локализована фосфортиоатная связь. В случае введения фосфодиэфирной связи, например, в динуклеотид CpG, промежуточный фосфор-III окисляют путем обработки раствором иода в смеси вода/пиридин. После отщепления от твердого носителя и конечного снятия защиты путем обработки концентрированным аммиаком (15 часов при 50°С) ODN анализируют с помощью ВЭЖХ на колонке Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) с применением NaCl-градиента (например, буфер А: 10 мМ NaH₂РО₄ в смеси ацетонитрил/вода=1:4/об.:об., рН 6,8; буфер В: 10 мМ NaH₂РО₄, 1,5М NaCl в смеси ацетонитрил/вода=1:4/об.:об., 5-60% В, 30 минут, 1 мл/мин) или с помощью электрофореза в капиллярном геле. ODN может быть очищен с помощью ВЭЖХ или ЖЭХБ на высокоразрешающей колонке Source High Perfomance (Amersham Pharmacia). Гомогенные ВЭЖХ-фракции объединяют и обессоливают либо на колонке С18, либо путем ультрафильтрации. ODN анализируют с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF для подтверждения вычисленной массы.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут также содержать другие модификации. Такими модификациями являются неионные ДНК-аналоги, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный кислород фосфоната заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфир и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженный кислородный радикал является алкилированным. Было также показано, что нуклеиновые кислоты, содержащие диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, у любого или у обоих концов, в основном являются резистентными к расщеплению нуклеазой.

Размер (то есть число нуклеотидных остатков в данной нуклеиновой кислоте) иммуностимулирующего олигонуклеотида может также влиять на стимулирующую активность данного олигонуклеотида. Для облегчения проникновения иммуностимулирующих олигонуклеотидов в клетки они должны предпочтительно иметь минимальную длину в 6 нуклеотидных остатков. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновые кислоты любого размера, превышающего 6 нуклеотидов (даже большое число т.п.н.), способны индуцировать иммунный ответ, если присутствует достаточное количество иммуностимулирующих мотивов, поскольку большее число нуклеиновых кислот разлагается внутри клеток. Авторы настоящего изобретения считают, что полумягкие олигонуклеотиды, содержащие, по крайней мере, 4 нуклеотида, могут также обладать иммуностимулирующим действием, если они могут быть доставлены внутрь клетки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют длину 4-100 нуклеотидов. В типичных вариантах иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют длину 6-40 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют длину 6-19 нуклеотидов.

Было обнаружено, что олигонуклеотиды по настоящему изобретению представляют собой нуклеиновые кислоты, которые содержат специфические последовательности, необходимые для вырабатывания иммунного ответа. Эти специфические последовательности, которые индуцируют иммунный ответ, называются "иммуностимулирующими мотивами", а олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующие мотивы, называются "иммуностимулирующими молекулами нуклеиновой кислоты" и аналогично "иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами" или "иммуностимулирующими олигонуклеотидами". Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению содержат, по крайней мере, один иммуностимулирующий мотив. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим мотивом является "внутренний иммуностимулирующий мотив". Термин "внутренний иммуностимулирующий мотив" означает, что эта последовательность мотива находится внутри более длинной последовательности нуклеиновой кислоты, которая длиннее последовательности данного мотива, по крайней мере, на один нуклеотид, присоединенный как к 5'-, так и к 3'-концу иммуностимулирующей последовательности данного мотива.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды содержат иммуностимулирующие мотивы, которые представляют собой "динуклеотиды CpG". Динуклеотид CpG может быть метилированным или неметилированным. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая, по крайней мере, один неметилированный динуклеотид CpG, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит динуклеотидную последовательность "неметилированный цитозин-гуанин" (то есть за неметилированным 5'-цитидином следует 3'-гуанозин, которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему; причем такой иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой является CpG-содержащая нуклеиновая кислота. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты были описаны в различных выданных патентах, в опубликованных патентных заявках и в других публикациях, включая патенты США №№ 6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая, по крайней мере, один метилированный динуклеотид CpG, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая содержит динуклеотидную последовательность "метилированный цитозин - гуанин" (то есть за метилированным 5'-цитидином следует 3'-гуанозин, которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему. В других вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды не содержат динуклеотидов CpG. Такие олигонуклеотиды, не содержащие динуклеотидов CpG, называются не-CpG-олигонуклеотидами и имеют иммуностимулирующие мотивы, не содержащие CpG. Поэтому настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам с иммуностимулирующими мотивами других типов, которые могут быть метилированными или неметилированными. Кроме того, иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию метилированных и неметилированных иммуностимулирующих CpG и не-CpG-мотивов.

Что касается CpG-содержащих нуклеиновых кислот, то недавно сообщалось, что существуют различные классы CpG-содержащих нуклеиновых кислот. Один класс содержит сильные активаторы В-клеток, но относительно слабые индукторы активации IFN-α и NK-клеток, и этот класс был назван В-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты В-класса обычно являются полностью стабилизированными и содержат неметилированный динуклеотид CpG с определенным предпочтительным набором оснований. См. например, патенты США №№ 6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. Другой класс содержит сильные индукторы активации IFN-α и NK-клеток, но относительно слабые стимуляторы В-клеток, и этот класс был назван А-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты А-класса обычно имеют стабилизированные поли-G последовательности у 5'- и 3'-концов и палиндромную фосфодиэфирную последовательность, содержащую динуклеотид CpG и состоящую, по крайней мере, из 6 нуклеотидов. См., например, опубликованную патентную заявку РСТ/US00/26527 (WO 01/22990). CpG-содержащие нуклеиновые кислоты еще одного класса активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; и этот класс был назван С-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты С-класса, как было впервые определено, обычно являются полностью стабилизированными и содержат последовательность типа последовательности В-класса и GC-богатый палиндром или последовательность, близкую к палиндромной последовательности. Этот класс был описан в одновременно рассматриваемой предварительной заявке на патент США № 60/313273, поданной 17 августа 2001, и в US10/224523, поданной 19 августа 2002, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Некоторыми неограничивающими примерами нуклеиновых кислот С-класса являются:

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения основан на обнаружении того факта, что специфические подклассы иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов, имеющих химерные основные цепи, являются высокоэффективными в опосредовании иммуностимулирующих эффектов. Эти CpG-содержащие нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве терапевтических и профилактических средств в целях стимуляции иммунной системы для лечения злокачественной опухоли, инфекционных заболеваний, аллергии, астмы, аутоиммунных заболеваний и других расстройств, и для защиты организма от условно-патогенных инфекций после противораковой химиотерапии. Сильные и, кроме того, сбалансированные клеточные и гуморальные иммунные реакции в ответ на CpG-стимуляцию представляют собой естественную защитную систему самого организма против инвазии патогенов и раковых клеток.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что субсерия иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов имеет улучшенные иммуностимулирующие свойства и оказывает пониженное воспалительное действие на почки. В некоторых случаях воспаление почек наблюдалось у субъектов, которым вводили полностью фосфортиоатный олигонуклеотид. Очевидно, что описанные здесь химерные нуклеиновые кислоты оказывают более слабое воспалительное действие на почки, чем полностью фосфортиоатные олигонуклеотиды. Кроме того, эти олигонуклеотиды являются в высокой степени эффективными стимуляторами иммунного ответа. Таким образом, фосфодиэфирная область указанной молекулы не снижает ее эффективности.

Предпочтительные иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды имеют одну из нижеследующих 6 общих формул:

В этих формулах N представляет собой любой нуклеотид; N₁ имеет 0-6 нуклеотидов, N₂ имеет 0-7 нуклеотидов, N₃ имеет 0-4 нуклеотидов, N₄ имеет 1-5 нуклеотидов, N₅ имеет 0-7 нуклеотидов, N₆ и N₇ независимо имеют длину в 1-5 нуклеотидов, N₈ имеет длину в 4-10 нуклеотидов, N₉ имеет длину в 0-3 нуклеотида, а N₁₀ имеет длину в 4-8 нуклеотидов. Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ независимо представляют собой С или G. Указанные формулы определяют субсерии класса CpG-олигонуклеотидов, которые обнаруживают превосходные иммуностимулирующие свойства и являются еще более чувствительными к деградации в организме, чем полностью фосфортиоатные олигонуклеотиды. В этой формуле 5' означает свободный 5'-конец олигонуклеотида, а 3' означает свободный 3'-конец олигонуклеотида.

Используемый в этих формулах символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть стабилизированными или нестабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 2-3 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения предпочтительно, чтобы такие олигонуклеотиды содержали 3-6 фосфодиэфирных связей. В некоторых случаях связи между мотивами CG представляют собой фосфодиэфир, а в других случаях они представляют собой фосфортиоатные или другие стабилизированные связи.

Другими формулами являются 5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO:368), где, по крайней мере, один динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь и указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь и 5'GNC3', где N представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной в 4-10 нуклеотидов, которая, по крайней мере, на 50% состоит из Т и не содержит динуклеотид CG; причем указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид имеет одну из следующих структур:

В этих структурах, символ _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

Некоторыми предпочтительными примерами указанных структур являются:

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды обычно имеют длину в пределах от 4 до 100 нуклеотидов, а в некоторых вариантах от 10 до 40 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида может составлять в пределах от 16 до 24 нуклеотидов.

Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" также содержат нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с заменами или модификациями, например, в основаниях и/или сахарах. Так, например, они содержат нуклеиновые кислоты, имеющие в своей основной цепи сахара, которые ковалентно связаны с низкомолекулярными органическими группами, не являющимися гидроксильной группой во 2'-положении и не являющимися фосфатной группой или гидроксигруппой в 5'-положении. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут содержать 2'-О-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут содержать сахара, например арабинозу или 2'-фторарабинозу, вместо рибозы. Так, например, по составу своей основной цепи нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными, то есть они могут содержать любую возможную комбинацию связанных друг с другом полимерных звеньев, таких как "пептид-нуклеиновые кислоты" (которые имеют аминокислотную основную цепь, связанную с основаниями нуклеиновой кислоты).

Нуклеиновые кислоты также содержат замещенные пурины и пиримидины, такие как основания, модифицированные С-5-пропинпиримидином и 7-деаза-7-замещенным пурином. Wagner R.W. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:840-4. Пуринами и пиримидинами являются, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин, тимин, 5-метилцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-фторцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие природные и неприродные нуклеотидные основания, замещенные и незамещенные ароматические группы. Другие такие модификации хорошо известны специалистам в данной области.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению в отличие от природных РНК и ДНК могут содержать различные химические модификации и замены, включая фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, β-D-рибозное звено и/или природное нуклеозидное основание (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил). Примеры химических модификаций известны специалистам и описаны, например, Uhlmann E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs "Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke S.T. et al., (1996) Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129 & Hunziker J. et al. (1995) Mod. Synth. Methods. 7:331-417. Олигонуклеотид по настоящему изобретению может иметь одну или несколько модификаций, где каждая модификация локализована в конкретном фосфодиэфирном межнуклеотидном мостике, и/или в конкретном β-D-рибозном звене, и/или в конкретном положении природного нуклеотидного основания в отличие от олигонуклеотида с той же самой последовательностью, которая состоит из природных ДНК или РНК.

Так, например, настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который может содержать одну или несколько модификаций, где каждая модификация независимо выбрана из:

а) замены фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, расположенной у 3'- и/или у 5'-конца нуклеотида, модифицированным межнуклеотидным мостиком,

b) замены фосфодиэфирного мостика, расположенного у 3'- и/или у 5'-конца нуклеотида, дефосфо-мостиком;

с) замены сахаро-фосфатного звена в сахаро-фосфатной основной цепи другим звеном;

d) замены β-D-рибозого звена модифицированным сахарным звеном; и

е) замены природного нуклеотидного основания модифицированным нуклеотидным основанием.

Более подробные примеры химических модификаций олигонуклеотида описаны ниже.

Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь, расположенная у 3'- и/или у 5'-конца нуклеотида, может быть заменена модифицированной межнуклеотидной связью, где указанная модифицированная межнуклеотидная связь выбрана, например, из фосфортиоата, фосфордитиоата, NR¹R²-фосфорамидита, боранфосфоната, α-гидроксибензилфосфоната, фосфат-(С₁-С₂₁)-О-алкилового эфира, фосфат-[(С₆-С₁₂)арил-(С₁-С₂₁)-О-алкил]эфира, (С₁-С₈)алкилфосфонатных и/или (С₆-С₁₂)арилфосфонатных мостиков, (С₇-С₁₂)-α-гидроксиметиларила (например, описанного в WO 95/01363), где (С₆-С₁₂)арил, (С₆-С₂₀)арил и (С₆-С₁₄)арил необязательно замещены галогеном, алкилом, алкокси, нитро, циано, и где R¹ и R² независимо представляют собой водород, (С₁-С₁₈)алкил, (С₆-С₂₀)арил, (С₆-С₁₄)арил-(С₁-С₈)алкил, а предпочтительно водород, (С₁-С₈)алкил, а предпочтительно (С₁-С₄)алкил и/или метоксиэтил, либо, R¹ и R², взятые вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое, кроме того, может содержать дополнительный гетероатом, выбранный из О, S и N.

Фосфодиэфирный мостик, расположенный у 3'- и/или у 5'-конца нуклеотида, заменен дефосфо-мостиком (дефосфо-мостики описаны, например, в работе Uhlmann E. и Peymann A., "Methods in Molecular Biology", Vol.20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp.355 ff), где дефосфо-мостик выбран, например, из группы, состоящей из дефосфо-мостиковых формацетальных, 3'-тиоформацетальных, метилгидроксиламиновых, оксимных, метилендиметилгидразо-, диметилсульфоновых и/или силильных групп.

Сахаро-фосфатное звено (то есть β-D-рибоза и фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, вместе образующие сахаро-фосфатное звено) в сахаро-фосфатной основной цепи (то есть в сахаро-фосфатной основной цепи, состоящей из сахаро-фосфатных звеньев) может быть заменено другим звеном, где это другое звено является, например, подходящим для конструирования олигомера "морфолино-производное" (как описано, например, в работе Stirchak E.P. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-41), например, путем замены на звено "морфолино-производное", или для конструирования полиамид-нуклеиновой кислоты ("ПНК", как описано, например, Nielsen P.E. et al. (1994) Bioconjug Chem. 5:3-7), например, путем замены на звено ПНК-основной цепи, например, 2-аминоэтилглицин.

β-рибозное звено или β-D-2'-дезоксирибозное звено может быть заменено модифицированным сахарным звеном, где указанное модифицированное сахарное звено выбрано, например, из β-D-рибозы, α-D-2'-дезоксирибозы, L-2'-дезоксирибозы, 2'-F-2'-дезоксирибозы, 2'-F-арабинозы, 2'-О-(С₁-С₆)алкилрибозы, где 2'-О-(С₁-С₆)алкилрибоза предпочтительно представляет собой 2'-О-метилрибозу; 2'-О-(С₂-С₆)алкенилрибозы, 2'-[О-(С₁-С₆)алкил-О-(С₁-С₆)алкил]рибозы, 2'-NH₂-2'-дезоксирибозы, β-D-ксилофуранозы, α-арабинофуранозы, 2,4-дидезокси-β-D-эритрогексопиранозы и карбоциклических аналогов (описанных, например, Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114:8320) и/или аналогов сахаров с незамкнутой цепью (описанных, например, Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) и/или аналогов бициклосахаров (описанных, например, Tarkov M. et al. (1993) Helv. Chim. Acta 76:481).

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанным сахаром является 2'-О-метилрибоза, в частности, для одного или обоих нуклеотидов, связанных фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью.

Нуклеиновые кислоты также содержат замещенные пурины и пиримидины, такие как основания, модифицированные С-5-пропинпиримидом и 7-деаза-7-замещенным пурином. Wagner R.W. et al. (1996) Nat.Biotechnol. 14:840-4. Пуринами и пиримидинами являются, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин, тимин и другие природные и неприродные нуклеотидные основания и замещенные или незамещенные ароматические группы.

Модифицированным основанием является любое основание, которое химически отличается от природных оснований, обычно присутствующих в ДНК и РНК, таких как Т, С, G, А и U, но химическая структура которого аналогична природной структуре этих оснований. Такое модифицированное нуклеотидное основание может быть выбрано, например, из гипоксантина, урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(С₁-С₆)алкилурацила, 5-(С₂-С₆)алкенилурацила, 5-(С₂-С₆)алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5-хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(С₁-С₆)алкилцитозина, 5-(С₂-С₆)алкенилцитозина, 5-(С₂-С₆)алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, N²-диметилгуанина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7-деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина, 5-гидроксиметилцитозина, N4-алкилцитозина, например N4-этилцитозина, 5-гидроксидезоксицитидина, 5-гидроксиметилдезоксицитидина, N4-алкилдезоксицитидина, например N4-этилдезоксицитидина, 6-тиодезоксигуанозина и дезоксирибонуклеотидов нитропиррола, С5-пропинилпиримидина и диаминопурина, например 2,6-диаминопурина, инозина, 5-метилцитозина, 2-аминопурина, 2-амино-6-хлорпурина, гипоксантина или других модификаций природных нуклеотидных оснований. Этот список приводится лишь в иллюстративных целях и не должен рассматриваться как ограничение изобретения.

В описанных здесь конкретных формулах определена последовательность модифицированных оснований. Так, например, используемая здесь буква Y означает нуклеотид, содержащий цитозин или модифицированный цитозин. Используемый здесь термин "модифицированный цитозин" означает природный или неприродный аналог пиримидинового основания, цитозина, которое может быть заменено этим основанием без негативного воздействия на иммуностимулирующую активность указанного олигонуклеотида. Модифицированными цитозинами являются, но не ограничиваются ими, 5-замещенные цитозины (например, 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5-бромцитозин, 5-иодцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 5-дифторметилцитозин и незамещенный или замещенный 5-алкинилцитозин), 6-замещенные цитозины, N4-замещенные цитозины (например, N4-этилцитозин), 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, аналоги цитозина с конденсированными циклическими системами (например, N,N'-пропиленцитозин или феноксазин) и урацил и его производные (например, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-бромвинилурацил, 4-тиоурацил, 5-гидроксиурацил, 5-пропинилурацил). Некоторыми предпочтительными цитозинами являются 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин и N4-этилцитозин. В другом варианте осуществления изобретения цитозиновое основание замещено универсальным основанием (например, 3-нитропирролом, Р-основанием), ароматической циклической системой (например, фторбензолом или дифторбензолом) или атомом водорода (d-спейсером).

Используемая здесь буква Z означает гуаниновое или модифицированное гуаниновое основание. Используемый здесь термин "модифицированный гуанин" означает природный или неприродный аналог пуринового основания, гуанина, который может заменять это гуаниновое основание без какого-либо негативного воздействия на иммуностимулирующую активность указанного олигонуклеотида. Модифицированными гуанинами являются, но не ограничиваются ими, 7-деазагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенный гуанин, гипоксантин, N2-замещенные гуанины (например, N2-метилгуанин), 5-амино-3-метил-3Н,6Н-тиазоло[4,5-d]пиримидин-2,7-дион, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, индол, аденин, замещенные аденины (например, N6-метиладенин, 8-оксоаденин), 8-замещенный гуанин (например, 8-гидроксигуанин и 8-бромгуанин) и 6-тиогуанин. В другом варианте осуществления изобретения гуаниновое основание замещено универсальным основанием (например, 4-метилиндолом, 5-нитроиндолом и К-основанием), ароматической циклической системой (например, бензимидазолом или дихлорбензимидазолом, амидом 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты) или атомом водорода (d-спейсером).

Олигонуклеотиды могут иметь один или несколько доступных 5'-концов. При этом можно получить модифицированные олигонуклеотиды, имеющие два таких 5'-конца. Это может быть достигнуто путем присоединения двух олигонуклеотидов посредством 3'-3'-связи с образованием олигонуклеотида, имеющего один или два доступных 5'-конца. 3'-3'-связь может представлять собой фосфодиэфирный, фосфортиоатный или другой модифицированный межнуклеотидный мостик. Методы образования таких связей известны специалистам. Так, например, такие связи описаны в работе Seliger H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 and Jiang et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.

Кроме того, 3'3'-связанные нуклеиновые кислоты, где связь между 3'-концевыми нуклеотидами не является фосфодиэфирным, фосфортиоатным или другим модифицированным мостиком, могут быть получены с применением дополнительного спейсера, такого как три- или тетраэтиленгликольфосфатная группа (Durand M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, патент США № 5658738 и патент США № 5668265). Альтернативно ненуклеотидный линкер может быть получен из этандиола, пропандиола или основного дезоксирибозного звена (d-спейсера) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) стандартным фосфорамидитным методом химического синтеза. Ненуклеотидные линкеры могут быть включены все сразу или в несколько приемов, либо они могут быть объединены друг с другом, что позволяет обеспечивать любое нужное расстояние между 3'-концами двух связанных ODN.

Недавно сообщалось, что иммуностимулирующий эффект CpG-олигонуклеотидов, очевидно, достигается посредством их взаимодействия с рецептором-ловушкой 9 (TLR9). Hemmi Н et al. (2000) Nature 408:740-5. Таким образом, активность TLR9-сигнала в ответ на действие CpG-олигонуклеотида или другой иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты может быть измерена путем детекции NF-kB, NF-kB-ассоциированных сигналов и соответствующих событий и промежуточных событий, происходящих до передачи NF-kB-сигнала.

Используемые в настоящем изобретении олигонуклеотиды могут быть синтезированы de novo с помощью ряда процедур, хорошо известных специалистам, например β-цианоэтилфосфорамидитным методом (Beaucage S.L. & Caruthers M.H. (1981) Tet. Lett. 22:1859) и нуклеозид Н-фосфонатным методом (Garegg et al., Tet. Lett. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Lett. 27:4055-4058, 1986; Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Эти химические методы могут быть осуществлены с помощью ряда автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, имеющихся в продаже. Такие олигонуклеотиды называются синтетическими олигонуклеотидами. Термин "выделенный олигонуклеотид" обычно означает олигонуклеотид, который был отделен от компонентов, с которым он обычно ассоциирован в природе. Так, например, выделенный олигонуклеотид может представлять собой олигонуклеотид, выделенный из клетки, ядра, митохондрии или хроматина.

Указанные олигонуклеотиды являются частично резистентными к деградации (например, являются стабилизированными). Термин "стабилизированная олигонуклеотидная молекула" означает олигонуклеотид, который является относительно резистентным к деградации in vivo (например, под действием экзо- или эндонуклеазы). Стабилизация нуклеиновой кислоты может быть осуществлена путем внесения модификаций в ее основную цепь. Олигонуклеотиды, имеющие фосфортиоатные связи, обладают максимальной активностью, и эти связи защищают олигонуклеотид от деградации под действием внутриклеточных экзо- и эндонуклеаз. Другими модифицированными олигонуклеотидами являются модифицированные фосфодиэфиром нуклеиновые кислоты, комбинации фосфодиэфирных и фосфортиоатных нуклеиновых кислот и нуклеиновые кислоты, модифицированные метилфосфонатом, метилфосфортиоатом, фосфордитиоатом, п-этокси и их комбинациями.

Модифицированные основной цепи, такие как фосфортиоаты, могут быть синтезированы с помощью автоматизированной техники с применением фосфорамидатного или Н-фосфонатного методов химического синтеза. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США № 4469863, а алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная группа является алкилированной, как описано в патенте США № 5023243 и в Европейском патенте № 092574) могут быть получены методами автоматизированного твердофазного синтеза с применением коммерчески доступных реагентов. Методы внесения других модификаций и замен в ДНК-основная цепь описаны, например, Uhlmann E. & Peyman A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild J. Bioconjugate Chem. 1:165, 1990.

Другими стабилизированными олигонуклеотидами являются: неионные ДНК-аналоги, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный кислород фосфоната заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфир и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная группа является алкилированной. Было также показано, что нуклеиновые кислоты, содержащие диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, у одного или у обоих концов, являются в основном резистентными к расщеплению нуклеазой.

Хотя CpG-эффекты у мышей хорошо охарактеризованы, однако информация, касающаяся человеческой системы, ограничена. Фосфортиоатные CpG-олигонуклеотиды, обладающие сильной стимулирующей активностью в мышиной системе, обнаруживают более низкую активность в иммунных клетках человека и других животных, не относящихся к грызунам. В примерах описывается получение в высокой степени активного человеческого мотива CpG и характеризация его эффектов и механизмов действия на человеческие ПКМК, например В-клетки и NK-клетки. ДНК, содержащая эти мотивы CpG и частично модифицированные основные цепи, оказывает сильное стимулирующее действие на клетки периферической крови человека с последующим продуцированием IL-6, IL-10, IP-10, TNF-α, IFN-α и IFN-γ. Уровни IFN-γ были увеличены по сравнению с контрольными уровнями. NK-клетки и Т-клетки были также индуцированы с увеличением уровней экспрессии CD69.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что субсерии иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов оказывают сильное иммуностимулирующее действие на человеческие клетки, такие как NK-клетки, что позволяет предположить, что эти иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды являются эффективными терапевтическими средствами для вакцинации человека, и могут быть использованы для иммунотерапии злокачественной опухоли, иммунотерапии астмы, общего усиления иммунной функции, увеличения числа гемопоэтических клеток после облучения или химиотерапии, для лечения аутоиммунного заболевания и для иммуномодуляции, применяемой в других целях.

Таким образом, в некоторых аспектах настоящего изобретения иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве вакцины для лечения субъекта с риском развития у него аллергии или астмы, возникновения инфекции, вызванной инфекционным микроорганизмом, или развития злокачественной опухоли, при котором был идентифицирован специфический раковый антиген. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы без антигена или аллергена для защиты от инфекции, аллергии или злокачественной опухоли, и в этом случае неоднократное введение дозы может обеспечивать защиту организма на более длительное время. Используемый здесь термин "субъект, подверженный риску" относится к субъекту, который подвержен риску заражения инфекцией, вызываемой патогеном, или риску заболевания злокачественной опухолью, или риску воздействия на нее аллергена, или риску развития у него злокачественной опухоли. Так, например, субъектом с риском заболевания может быть субъект, который планирует поездку в регион, где был обнаружен инфекционный агент определенного типа; субъект, который, по своему образу жизни или по назначению врача принимает водные процедуры, которые могут содержать инфекционные микроорганизмы, либо субъект, который может быть непосредственно подвержен воздействию микроорганизмов, либо им может быть любой субъект, проживающий в регионе, где был идентифицирован инфекционный микроорганизм или аллерген. Субъектами с риском развития инфекции также является коренное население, которому медицинское учреждение рекомендует вакцинацию конкретными инфекционными микроорганизмами-антигенами. Если таким антигеном является аллерген и у данного субъекта развиваются аллергические реакции на данный конкретный антиген, а также если такой субъект подвержен действию данного антигена, то есть во время сезонного созревания пыльцы, то такой субъект подвержен риску воздействия на него данного антигена. Субъектами с риском развития у них аллергии или астмы являются субъекты, у которых была идентифицирована аллергия или астма, но которые не страдают активным заболеванием во время лечения иммуностимулирующим CpG-олигонуклеотидом, а также субъекты, которые рассматриваются, как подверженные развитию заболеваний, вызываемых генетическими или внешними факторами.

Субъектом с риском развития у него злокачественной опухоли считается субъект, который имеет высокую вероятность развития у него злокачественной опухоли. Такими субъектами являются, например, субъекты с генетическими аномалиями, присутствие которых, как было продемонстрировано, коррелирует с повышенной вероятностью развития злокачественной опухоли, и субъекты, подверженные воздействию канцерогенов, таких как табак, асбест и другие химические токсины, или субъект, который ранее проходил курс противораковой терапии, и субъект, у которого наблюдается ремиссия. Если субъект с риском развития злокачественной опухоли подвергался воздействию антигена, специфичного к тому типу злокачественной опухоли, которой рискует заболеть данный субъект, и воздействию иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида, то у указанного субъекта злокачественные клетки могут уничтожаться по мере их развития. Если у данного субъекта начинает развиваться опухоль, то у такого субъекта будет вырабатываться специфический иммунный ответ против опухолевого антигена.

Помимо использования иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов для профилактического лечения настоящее изобретение также относится к применению иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов для лечения субъекта, страдающего инфекцией, аллергией, астмой или злокачественной опухолью.

Субъектом, имеющим инфекцию, является субъект, который был подвержен воздействию инфекционного патогена и имеет детектируемые в своем организме уровни острой или хронической инфекции, вызываемой данным патогеном. Иммуностимулирующиие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы отдельно или в комбинации с антигеном в целях продуцирования антигенспецифического системного иммунного ответа или иммунного ответа, вырабатываемого слизистой, способного снижать уровень инфекционного патогена или полностью уничтожать данный инфекционный патоген. Используемый здесь термин "инфекционное заболевание" означает заболевание, возникающее в результате присутствия чужеродного микроорганизма в организме субъекта. При этом особенно важно разработать эффективную стратегию вакцинации и лечения для защиты поверхностей слизистой организма, которые являются главным участком, служащим входными воротами для патогена.

Субъектом, страдающим аллергией, является субъект, у которого развивается аллергическая реакция на действие аллергена, или субъект с риском развития у него такой реакции. Термин "аллергия" означает приобретенную гиперчувствительность к определенному веществу (аллергену). Аллергическими состояниями являются, но не ограничиваются ими, экзема, аллергический ринит или острый ринит, сенная лихорадка, конъюнктивит, бронхиальная астма, крапивница (сыпи) и пищевые аллергии, а также другие атопические нарушения.

Аллергии обычно вызываются продуцированием антител IgE против безопасных аллергенов. Цитокины, которые индуцируются системным введением или введением через слизистую иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов, представляют собой преимущественно цитокины, относящиеся к классу, называемому Th1 (примерами являются IL-12, IP-10, IFN-α и IFN-γ), и эти цитокины индуцируют как гуморальный, так и клеточный иммунный ответы. Другим основным типом иммунного ответа, ассоциированного с продуцированием цитокинов IL-4 и IL-5, является иммунный Th2-ответ. В общих чертах очевидно, что аллергические заболевания опосредуются иммунными ответами Th2-типа. Поскольку иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды обладают способностью к смещению иммунного ответа у субъекта преимущественно от Th2-ответа (который ассоциируется с продуцированием антител IgE и аллергией) в сторону сбалансированного Th2/Th1-ответа (который является защитным ответом на аллергические реакции), то для лечения или профилактики астмы и аллергии у субъекта ему может быть введена доза иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида, которая является эффективной для индуцирования иммунного ответа.

Таким образом, иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды обладают значительной терапевтической эффективностью в лечении аллергических и неаллергических состояний, таких как астма. Уровень Th2-цитокинов, особенно IL-4 и IL-5, увеличивается в дыхательных путях субъектов, страдающих астмой. Эти цитокины стимулируют важные аспекты астматического воспалительного ответа, включая переключение изотипа IgE, хемотаксис эозинофилов и активацию и рост тучных клеток. Th1-цитокины, особенно IFN-γ и IL-12, могут подавлять образование Th2-клонов и продуцирование Th2-цитокинов. Термин "астма" означает расстройство дыхательной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и повышенной реактивностью дыхательных путей к вдыхаемым агентам. Астма часто, хотя и не всегда, ассоциируется с атопическими или аллергическими симптомами.

"Субъектом, страдающим злокачественной опухолью" является субъект, у которого обнаруживаются злокачественные клетки. Опухоль может быть злокачественной или незлокачественной. Раком или опухолями являются, но не ограничиваются ими, рак желчных путей; рак головного мозга; рак молочной железы; рак шейки матки; хориокарцинома; рак толстой кишки; рак эндометрия, рак пищевода; рак желудка; внутриэпителиальная неоплазма; лимфомы; рак печени; рак легких (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный); меланомы; нейробластомы; рак ротовой полости; рак яичника; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; рак прямой кишки; саркомы; рак кожи; рак яичек; рак щитовидной железы; рак почек, а также другие карциномы и саркомы. В одном из вариантов осуществления изобретения злокачественной опухолью является лейкозный ретикулоэндотелиоз, хронический миелогенный лейкоз, Т-клеточный лейкоз кожи, множественная миелома, фолликулярная лимфома, злокачественная меланома, плоскоклеточная карцинома, почечно-клеточная карцинома, карцинома предстательной железы, карцинома мочевого пузыря или карцинома толстой кишки.

Термин "субъект" относится к человеку или позвоночному животному, включая, но не ограничиваясь ими, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, индейку, курицу, примата, например, обезьяну, и рыб (как вид аквакультуры), например лосося. Таким образом, настоящее изобретение может быть также использовано в целях лечения злокачественных опухолей и опухолей, инфекций и аллергии/астмы у субъектов, не являющихся человеком. Злокачественная опухоль является одной из главных причин смерти домашних питомцев (то есть кошек и собак).

Используемые здесь термины "лечить", "подвергаемый лечению" или "лечение", относящиеся к расстройству, такому как инфекционное заболевание, злокачественная опухоль, аллергия или астма, означают профилактическое лечение, которое способствует повышению резистентности субъекта к развитию заболевания (например, к инфекции, вызываемой патогеном), или, другими словами, способствует снижению вероятности развития у субъекта данного заболевания (например, инфицирования патогеном), а также лечение субъекта после развития у него заболевания для борьбы с указанным заболеванием (например, для ослабления или полного уничтожения инфекции) либо для профилактики прогрессирования данного заболевания.

В случае если указанный CpG-олигонуклеотид вводят вместе с антигеном, то указанный субъект может быть подвергнут воздействию таким антигеном. Используемый здесь термин "подверженный воздействию" относится либо к активной стадии контактирования субъекта с антигеном, либо к пассивному воздействию антигена на субъекта in vivo. Методы активного воздействия антигена на субъекта хорошо известны специалистам. В общих чертах, антиген вводят непосредственно субъекту любыми способами, такими как внутривенное, внутримышечное, пероральное, чрескожное, чресслизистое, интраназальное, внутритрахеальное или подкожное введение. Антиген может быть введен системно или местно. Способы введения антигена и иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида более подробно описаны ниже. Считается, что субъект подвергается пассивному воздействию антигена, если данный антиген становится доступным для взаимодействия с иммунными клетками в данном организме. Субъект может подвергаться пассивному воздействию антигена, например, путем вхождения чужеродного патогена в организм или путем развития опухолевой клетки, экспрессирующей на своей поверхности чужеродный антиген.

Способы, используемые для пассивного воздействия антигена на субъект, могут, в частности, зависеть от времени введения иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида. Так, например, субъекту с риском развития у него злокачественной опухоли, или инфекционного заболевания, или аллергической или астматической реакции могут быть регулярно введены иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды в том случае, если такой риск является наиболее высоким, то есть во время сезонной аллергической реакции или после воздействия агента, вызывающего злокачественную опухоль. Кроме того, иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид может быть введен туристам перед посещением ими других стран, в которых они могут подвергаться заражению инфекционными агентами. Аналогичным образом иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид может быть введен солдатам или гражданским лицам, находящимся в зоне риска в связи с боевыми действиями с применением бактериологического оружия, для индуцирования у них системного иммунного ответа или иммунного ответа в слизистой на действие данного антигена после его введения.

Используемый здесь термин "антиген" означает молекулу, способную стимулировать иммунную реакцию. Антигенами являются, но не ограничиваются ими, клетки, клеточные экстракты, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, полисахаридные конъюгаты, пептидные и непептидные миметики полисахаридов и других молекул, небольшие молекулы, липиды, гликолипиды, углеводы, вирусы и вирусные экстракты и многоклеточные организмы, такие как паразиты и аллергены. В широком смысле термин "антиген" содержит молекулу любого типа, которая распознается иммунной системой хозяина как чужеродная. Антигенами являются, но не ограничиваются ими, раковые антигены, микробные антигены и аллергены.

Используемый здесь термин "раковый антиген" означает соединение, такое как пептид или белок, ассоциированное с клеточной поверхностью опухоли или злокачественной клетки и способное стимулировать иммунный ответ при их экспрессии на поверхности антиген-презентирующей клетки в присутствии молекулы ГКС. Раковые антигены могут быть получены из раковых клеток или из неочищенных экстрактов раковых клеток, например, как описано у Cohen P.A. et al. (1994) Cancer Research 54:1055, либо путем частичной очистки антигенов с применением техники рекомбинантных ДНК, либо путем синтеза известных антигенов de novo. Раковыми антигенами являются, но не ограничиваются ими, рекомбинантно экспрессируемые антигены, их иммуногенная часть или вся опухоль или злокачественная опухоль. Такие антигены могут быть выделены или получены рекомбинантными методами или любыми другими известными методами.

Используемый здесь термин "микробный антиген" означает антиген микроорганизма, и такими антигенами являются, но не ограничиваются ими, вирус, бактерии, паразиты и грибы. Такими антигенами являются интактные микроорганизмы, их природные изоляты, фрагменты или производные, а также синтетические соединения, которые являются идентичными или аналогичными природным антигенам микроорганизма и индуцируют иммунный ответ, специфичный для такого микроорганизма. Соединение является аналогичным природному антигену микроорганизма, если оно индуцирует иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный ответ) на действие природного антигена микроорганизма. Такие антигены находят широкое применение и хорошо известны специалистам.

Примерами вирусов, которые были обнаружены у человека, являются, но не ограничиваются ими: Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1 (также обозначаемые HDTV-III, LAVE, или HTLV-III/LAV или ВИЧ-III; и другие изоляты, такие как ВИЧ-LP); Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита А; энтеровирусы, человеческие вирусы Коксаки, риновирусы, ECHO-вирусы); Calciviridae (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы лошадиного энцефалита, вирусы коревой краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, рабивирусы); Filoviridae (например, вирусы Эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, вирусы Хантаан, буньявирусы, флебовирусы и найровирусы); Arenaviridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита В); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (папиломавирусы, полиомавирусы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), герпесвирусы); Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы) и Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней) и неклассифицированные вирусы (например, агент, вызывающий гепатит дельта (предположительно представляющий собой дефектный сателлит вируса гепатита В), агенты, вызывающие не-А, не-В гепатит (класс 1 = передается внутреннем путем; класс 2 = передается парентерально (то есть гепатит С); вирусы Норуолк и родственные вирусы, и астровирусы).

В качестве антигенов у беспозвоночных животных могут служить как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии. Такими грамположительными бактериями являются, но не ограничиваются ими, бактерии видов Pasteurella, Staphylococcus и Streptococcus. Грамотрицательными бактериями являются, но не ограничиваются ими, бактерии видов Escherichia coli, Pseudomonas и Salmonella. Конкретными примерами инфекционных бактерий являются, но не ограничиваются ими: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (например, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококки группы А), Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробные виды), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.

Примерами грибков являются: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamidia trachomatis, Candida albicans.

Другими инфекционными микроорганизмами (то есть протистами) являются Plasmodium spp., такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax и Toxoplasma gondii. Кровепаразитами и/или тканевыми паразитами являются Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense и Trypanosoma rhodesiense (африканская сонная болезнь), Trypanosoma cruzi (болезнь Чагаса) и Toxoplasma gondii.

Другие важные с медицинской точки зрения микроорганизмы широко описаны в литературе, см. например, работу С.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain, 1983, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Термин "аллерген" означает вещество (антиген), которое может индуцировать аллергический или астматический ответ у восприимчивого субъекта. Список аллергенов является огромным и может содержать пыльцу, яды насекомых, перхоть животных, пыль, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Примерами природных аллергенов животного и растительного происхождения являются, но не ограничиваются ими, белки, специфичные к следующим видам: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (например, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (например, Lolium perenne или Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia {Artemisia vulgaris); Plantago (например, Plantago lanceolata); Parietaria (например, Parietaria officinalis или Parietaria judaica); Blattella (например, Blattella germanica); Apis (например, Apis multiflorum); Cupressus (например, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica и Cupressus macrocarpa); Juniperus (например, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis и Juniperus ashei); Thuya (например, Thuya orientalis); Chamaecyparis (например, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (например, Periplaneta americana); Agropyron (например, Agropyron repens); Secale (например, Secale cereale); Triticum (например, Triticum aestivum); Dactylis (например, Dactylis glomerata); Festuca (например, Festuca elatior); Poa (например, Poa pratensis или Poa compressa); Avena (например, Avena sativa); Holcus (например, Holcus lanatus); Anthoxanthum (например, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius); Agrostis (например, Agrostis alba); Phleum (например, Phleum pratense); Phalaris (например, Phalaris arundinacea); Paspalum (например, Paspalum notatium); Sorghum (например, Sorghum halepensis); и Bromus (например, Bromus inermis).

Используемый здесь термин "в основном, очищенный" относится к полипептиду, который, в основном, не содержит других белков, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он обычно ассоциирован в природе. Каждый специалист может выделить вирусные или бактериальные полипептиды стандартными методами очистки белков. В основном, чистый полипептид часто дает одну главную полосу на невосстанавливающем полиакриламидном геле. В случае частично гликозилированных полипептидов или полипептидов, имеющих несколько старт-кодонов, они могут давать несколько полос на невосстанавливающем полиакриламидном геле, но будут давать картину, характерную для данного полипептида. Чистота вирусного или бактериального полипептида может быть также определена путем проведения анализа амино-концевой аминокислотной последовательности. Настоящее изобретение также содержит и другие типы антигенов, которые не кодируются нуклеиновокислотным вектором, такие как полисахариды, малые молекулы, миметики и т.п.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть введены субъекту вместе с противомикробным агентом. Используемый здесь термин "противомикробный агент" означает природное или синтетическое соединение, способное уничтожать или подавлять инфекционные микроорганизмы. Тип противомикробного агента, подходящего для применения в настоящем изобретении, зависит от типа микроорганизма, которым инфицирован данный субъект или которым рискует быть инфицированным данный субъект. Противомикробными агентами являются, но не ограничиваются ими, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты и противопаразитарные агенты. Такие термины, как "противоинфекционный агент", "антибактериальный агент", "противовирусный агент", "противогрибковый агент", "противопаразитарный агент" и "паразитоцид", имеют значения, хорошо известные специалистам и определенные в общедоступной медицинской литературе. Короче говоря, антибактериальными агентами, которые уничтожают или ингибируют бактерии, являются антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, обладающие аналогичными функциями. Антибиотики представляют собой низкомолекулярные соединения, продуцируемые в виде вторичных метаболитов клетками, такими как микроорганизмы. В общих чертах, антибиотики ингибируют одну или несколько бактериальных функций или структур, которые являются специфичными для данного микроорганизма и которые отсутствуют в клетках-хозяевах. Противовирусные агенты могут быть выделены из природных источников или синтезированы и могут быть использованы для уничтожения или ингибирования вирусов. Противогрибковые агенты используются для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также условно-патогенных и первичных системных грибковых инфекций. Противопаразитарные агенты уничтожают паразитов или подавляют их развитие.

Примерами противопаразитарных агентов, также называемыми паразитоцидами, подходящими для введения человеку, являются, но не ограничиваются ими, альбендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлорохин-HCl, фосфат хлорохина, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, фуроат дилоксанида, эфлорнитин, фуразолидаон, глюкокортикоиды, галофантрин, иодхинол, ивермектин, мебендазол, мефлохин, антимониат меглумина, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, парамомицин, изетионат пентамидина, пиперазин, прациквантел, фосфат примахина, прогуанил, памоат пирантела, пириметанмин-сульфонамиды, пириметанмин-сульфадоксин, хинакрин-HCl, сульфат хинина, глюконат хинидина, спирамицин, стибоглюконат натрия (глюконат натрия-сурьмы), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметроприм-сульфаметоксазол и трипарсамид, некоторые из которых используются отдельно или в комбинации друг с другом.

Антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют рост или функции бактерий. Большим классом антибактериальных агентов являются антибиотики. Антибиотики, которые являются эффективными для уничтожения или ингибирования бактерий широкого ряда, называются антибиотиками широкого спектра действия. Другими типами антибиотиков являются антибиотики, действие которых направлено преимущественно против бактерий, принадлежащих к классу грамположительных или грамотрицательных бактерий. Антибиотики такого типа называются антибиотиками узкого спектра действия. Антибиотики другого типа, которые являются эффективными против одного микроорганизма или заболевания, но неэффективными против бактерий другого типа, называются антибиотиками ограниченного спектра действия. Антибактериальные агенты иногда классифицируют по их основному механизму действия. В общих чертах, антибактериальными агентами являются ингибиторы синтеза клеточных стенок, ингибиторы синтеза клеточных мембран, ингибиторы синтеза белков, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот или функциональные ингибиторы и конкурентные ингибиторы.

Противовирусными агентами являются соединения, предотвращающие инфицирование клеток вирусами или репликацию вируса в этой клетке. Противовирусных лекарственных средств существует гораздо меньше, чем антибактериальных лекарственных средств, поскольку процесс репликации вируса настолько тесно ассоциирован с репликацией ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические противовирусные агенты в большинстве случаев являются токсичными для данного хозяина. Процесс инфицирования вирусом имеет несколько стадий, которые могут быть блокированы или ингибированы противовирусными агентами. Такими стадиями являются присоединение вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулин или связывающие пептиды), утрата вирусом оболочки (например, амантадин), синтез или трансляция вирусной мРНК (например, интерферон), репликация вирусной РНК или ДНК (например, нуклеотидные аналоги), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеазы), а также "бадинг" и высвобождение вируса.

Нуклеотидными аналогами являются синтетические соединения, которые аналогичны нуклеотидам, но имеют неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. После включения нуклеотидных аналогов в клетку они фосфорилируются с образованием трифосфата, который конкурирует с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. После включения трифосфатной формы нуклеотидного аналога в растущую цепь нуклеиновой кислоты происходит необратимое связывание с вирусной полимеразой, в результате чего рост цепи прекращается. Нуклеотидными аналогами являются, но не ограничиваются ими, ацикловир (используемый для лечения заболевания, вызываемого вирусом простого герпеса и ветряной оспы), ганцикловир (используемый для лечения заболевания, вызываемого цитомегаловирусом), идоксуридин, рибавирин (используемый для лечения заболевания, вызываемого респираторно-синцитиальным вирусом), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин и зидовудин (азидотимидин), имихимод и резимихимод.

Интерфероны представляют собой цитокины, которые секретируются вирус-инфицированными клетками, а также иммунными клетками. Интерфероны функционируют посредством связывания со специфическими рецепторами на клетках, смежных с инфицированными клетками, что приводит к изменениях в клетках, которые обеспечивают их защиту от инфицирования вирусом. α- и β-интерфероны также индуцируют экспрессию молекул ГКГ класса I и класса II на поверхности инфицированных клеток, что приводит к повышению уровня презентации антигена для его распознавания иммунными клетками-хозяевами. α- и β-интерфероны являются доступными в рекомбинантных формах и используются для лечения хронического инфекционного гепатита В и С. Но в дозах, эффективных для противовирусной терапии, интерфероны дают серьезные побочные эффекты, такие как лихорадка, общее недомогание и потеря веса.

Противовирусными агентами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, амантадин, интерфероны, нуклеотидные аналоги и ингибиторы протеазы. Конкретными примерами противовирусных агентов являются, но не ограничиваются ими, ацеманнан, ацикловир, ацикловир-натрий, адефовир, аловудин, алфицепт-судотокс, гидрохлорид амантадина, аранотин, арилдон, мезилат атевирдина, авридин, цидофовир, ципамфиллин, гидрохлорид цитарабина, мезилат делавирдина, десцикловир, диданоксин, дизоксарил, эдоксудин, энвираден, энвироксим, фамцикловир, гидрохлорид фамотина, фиацитабин, фиалуридин, фозарилат, фоскарнет-натрий, фосфонет-натрий, ганцикловир, ганцикловир-натрий, идоксуридин, кетоксал, ламивудин, лобукавир, гидрохлорид мемотина, метизазон, невирапин, пенцикловир, пиродавир, рибавирин, гидрохлорид римантадина, мезилат сахинавира, гидрохлорид сомантадина, соривудин, статулон, ставудин, гидрохлорид тилорона, трифлуридин, гидрохлорид валацикловира, видарабин, фосфат видарабина, натрийфосфат видарабина, вироксим, зальцитабин, зидовудин и зинвироксим.

Противогрибковые агенты могут быть использованы для лечения и профилактики инфекционных грибковых заболеваний. Противогрибковые агенты иногда классифицируются по механизму их действия. Некоторые противогрибковые агенты функционируют как ингибиторы синтеза клеточной стенки посредством ингибирования глюкозо-синтазы. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими, базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые агенты функционируют посредством дестабилизации целостности мембраны. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими, имидазолы, такие как клотримазол, сертаконазол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконазол, а также FK 463, амфотерицин В, BAY 38-9502, МК 991, прадимицин, UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые агенты функционируют посредством разрушения хитина (например, хитиназы) или иммуносупрессии (крем 501).

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть объединены с другими терапевтическими агентами, такими как адъюванты, для усиления иммунных ответов. Иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид и другой терапевтический агент могут быть введены одновременно или последовательно. Если другие терапевтические агенты вводят одновременно, то они могут быть введены в одной и той же композиции или в отдельных композициях, но в одно и то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно с другим терапевтическим агентом и с иммуностимулирующим CpG-олигонуклеотидом, если введение других терапевтических агентов и иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида не совпадает по времени. Период времени между введением этих соединений может составлять несколько минут или более. Другими терапевтическими агентами являются, но не ограничиваются ими, адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т.п.

Композиции по настоящему изобретению могут быть также введены в сочетании с адъювантами, не являющимися нуклеиновыми кислотами. Адъювантом, не являющимся нуклеиновой кислотой, может быть любая молекула или соединение за исключением описанных здесь иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов, которые могут стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Адъювантами, не являющимися нуклеиновой кислотой, могут быть, например, адъюванты, продуцирующие депо-эффект, иммуностимулирующие адъюванты и адъюванты, продуцирующие депо-эффект и стимулирующие иммунную систему.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы в качестве адъювантов слизистой. Ранее было обнаружено, что системный иммунный ответ и иммунный ответ, вырабатываемый в слизистой, индуцируются путем введения в слизистую CpG-содержащих нуклеиновых кислот. Таким образом, указанные олигонуклеотиды могут быть введены в комбинации с другими адъювантами слизистой.

Иммунные ответы могут быть также индуцированы или усилены путем совместного введения или совместной экспрессии цитокинов (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997, Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) или ко-стимулирующих молекул В-7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) с иммуностимулирующими CpG-олигонуклеотидами. Используемый здесь термин "цитокин" означает родовое название другой группы растворимых белков и пептидов, которые действуют как регуляторы гуморального ответа в нанопикомолярных концентрациях и которые в нормальных или патологических условиях модулируют функциональную активность отдельных клеток и тканей. Эти белки также опосредуют непосредственное взаимодействие между клетками и регулируют процессы, происходящие вне клетки. Примерами цитокинов являются, но не ограничиваются ими, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерферон-γ (γ-IFN), IFN-α, фактор некроза опухоли (TNF), TGF-β, лиганд FLT-3 и лиганд CD40.

Олигонуклеотиды могут быть также использованы для переориентации иммунного ответа с Th2-ответа на Th1-ответ. Это приводит к вырабатыванию относительно сбаллансированного Th1/Th2-ответа. Переориентация иммунного Th2-ответа на Th1-ответ может быть определена путем измерения уровней цитокинов, продуцируемых в ответ на действие нуклеиновой кислоты (например, путем индуцирования моноцитарных клеток и других клеток, так чтобы они продуцировали Th1-цитокины, включая IL-12, IFN-γ и GM-CSF). Переориентация или смещение равновесия от иммунного Th2-ответа в сторону Th1-ответа являются особенно эффективными для лечения или профилактики астмы. Так, например, эффективным количеством для лечения астмы может быть количество, которое является эффективным для переориентации иммунного ответа типа Th2, который ассоциируется с астмой, на ответ типа Th1 или сбалансированный Th1/Th2-ответ. Уровни Th2-цитокинов, а особенно IL-4 и IL-5, увеличены в дыхательных путях субъектов, страдающих астмой. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды по настоящему изобретению вызывают увеличение уровней Th1-цитокинов, что способствует смещению равновесия в иммунной системе и предотвращению или ослаблению побочных эффектов, ассоциированных с преобладающим иммунным Th2-ответом.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть также использованы для лечения ремоделирования дыхательных путей. Ремоделирование дыхательных путей является результатом пролиферации клеток гладкой мышцы и/или утолщения подслизистой дыхательных путей, что в итоге приводит к сужению дыхательных путей и тем самым к ограничению поступления воздуха. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут предотвращать последующее ремоделирование и могут даже подавлять образование ткани в результате процесса ремоделирования.

Эти олигонуклеотиды могут быть также использованы для стимуляции выживания, дифференцировки, активации и созревания дендритных клеток. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды обладают уникальной способностью стимулировать выживание, дифференцировку, активацию и созревание дендритных клеток.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды также способствуют увеличению цитолитической активности клеток-натуральных киллеров и антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). ADCC может быть достигнута с применением иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в комбинации с антителом, специфичным для клеточной мишени, такой как злокачественная клетка. При введении иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида субъекту в комбинации с антителом иммунная система данного субъекта индуцирует гибель опухолевой клетки. Антителами, используемыми в ADCC-процедуре, являются антитела, которые взаимодействуют с клеткой в организме. Многие такие антитела против клеточных мишеней были описаны в литературе, и многие из них являются коммерчески доступными.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также введены в сочетании с противораковой терапией. Противораковая терапия включает введение противораковых лекарственных средств, лучевую терапию и хирургические операции. Используемый здесь термин "противораковое лекарственное средство" означает агент, который вводят субъекту для лечения злокачественной опухоли. Используемый здесь термин "лечение злокачественной опухоли" означает предупреждение развития злокачественной опухоли, ослабление симптомов злокачественной опухоли и/или ингибирование роста развивающейся злокачественной опухоли. В других аспектах настоящего изобретения противораковые лекарственные средства вводят субъекту с риском развития у него злокачественной опухоли в целях снижения такого риска. В настоящей заявке описаны различные типы лекарственных средств для лечения злокачественной опухоли. В целях описания настоящего изобретения противораковые лекарственные средства классифицируются как химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, противораковые вакцины, средства гормональной терапии и модификаторы биологического ответа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим применение более чем одного противоракового средства вместе с иммуностимулирующими CpG-олигонуклеотидами. В качестве примеров, там, где это необходимо, иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть введены вместе с химиотерапевтическим агентом и с иммунотерапевтическим агентом. Альтернативно термин "противораковое лекарственное средство" может содержать иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину, или химиотерапевтическое средство и противораковую вакцину, или иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину, все из которых вводят одному субъекту в целях лечения субъекта, страдающего злокачественной опухолью, или субъекта с риском развития злокачественной опухоли.

Химиотерапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из метотрексата, винкристина, адриамицина, цисплатина, не содержащих сахар хлорэтилнитрозомочевин, 5-фторурацила, митомицина С, блеомицина, доксорубицина, дакарбазина, таксола, флагилина, мегламина GLA, валрубицина, кармустаина и полиферпозана, ММI270, BAY 12-9566, ингибитора фамезилтрансферазы RAS, ингибитора фамезилтрансферазы, ММР, МТА/LY231514, LY264618/лометексола, гламолека, CI-994, TNP-470, хикамтина/топотекана, PKC412, валсподара/PSC833, новантрона/митроксантрона, метарета/сурамина, батимастата, Е7070, BCH-4556, CS-682, 9-АС, AG3340, AG3433, инцела/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN698, TA2516/мармистата, ВВ2516/мармистата, CDP845, D2163, PD183805, DX8951f, лемонала DP2202, FK317, пицибанила/ОК-432, AD32/валрубицина, метастрона/производного стронция, темодала/темозоломида, эвацета/липосомного доксорубицина, ютаксана/паклитаксела, таксола/паклитаксела, кселоада/капецитабина, фуртулона/доксифлуридина, циклопакса/перорального паклитаксела, перорального таксоида, SPU-077/цисплатина, HMR1275/флавопиридола, СР-358 (774)/EGFR, СР-609 (754)/ингибитора онкогена RAS, BMS-182751/пероральной платины, UFT (тегафлура/урацила), эргамизола/левамизола, энилурацила/776С85/энхансера 5FU, кампто/левамизола, камптозара/иринотекана, тумодекса/ралитрекседа, лейстатина/кладрибина, паксекса/паклитаксела, доксила/липосомного доксорубицина, каэликса/липосомного доксорубицина, флудары/флударабина, фармарубицина/эпирубицина, DepoCyt, ZD1839, LU79553/бис-нафталимида, LU103793/доластатина, каэтикса/липосомного доксорубицина, гемзара/гемцитабина, ZD0473/анормеда, YM116, затравочных кристаллов иода, ингибиторов CDK4 и CDK2, ингибиторов PARP, D4809/дексифозамида, ифеса/мезнекса/ифосамида, вумона/тенипозида, параплатина/карбоплатина, плантинола/цисплатина, вепезида/этопозида, ZD9331, таксотера/доцетаксела, пролекарства арабинозида гуанина, аналога таксана, нитрозомочевин, алкилирующих агентов, таких как мелфелан и циклофосфамид; аминоглутетимида, аспарагиназы, бусульфана, карбоплатина, хлоромбуцила, цитрабин-HCl, дактиномицина, даунорубицина-HCl, натрийфосфата эстрамустина, этопозида (VР16-213), флоксуридина, фторурацила (5-FU), флутамида, гидроксимочевины (гидроксикарбамида), ифосфамида, интерферона альфа-2а, альфа-2b, ацетата лейпролида (аналога LHRH-рилизинг-фактора), ломустина (CCNU), мехлоретамина-HCl (азотного аналога горчичного газа), меркаптопурина, месны, митотана (о.р.'-DDD), митоксантрона-HCl, октреотида, пликамицина, прокарбазина-HCl, стрептозоцина, цитрата тамоксифена, тиогуанина, тиотепы, сульфата винбластина, амсакрина (м-AMSA), азацитидина, эритропоэтина, гексаметилмеламина (НММ), интерлейкина-2, митогуазона (метил-GAG, бис-гуанилгидразона метилглиоксаля, MGBG), пентостатина (2'-дезоксикоформицина), семустина (метил-CCNU), тенипозида (VM-26) и сульфата виндезина, но не ограничивается ими.

Иммунотерапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, онколима, SMART M195, ATRAGEN, оварекса, бексара, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, антитела против VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMab-G2, TNT, Gliomab-H, GHI-250, EMD-72000, LymphoCide, СМА-676, монофарма-С, 4В5, ior egf.r3, ior c5, BABS, антитела против FLK-2, MDX-260, антитела против ANA, антитела против SMART 1D10, антитела против SMART ABL364 и ImmuRAIT-CEA, но не ограничивается ими.

Противораковая вакцина может быть выбрана из группы, состоящей из EGF, антиидиотипических противораковых вакцин, антигена Gp75, вакцины против меланомы GMK, вакцины на основе конъюгата "MGV-ганглиозид", Her2/neu, оварекса, M-Vax, О-Vax, L-Vax, STn-KHL-тератопы, BLP25 (MUC-1), липосомной идиотипической вакцины, мелацина, вакцин на основе пептидных антигенов, вакцин на основе токсина/антигена, вакцины на основе MVA, PACIS, вакцины на основе BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-вируса и ImmuCyst/TheraCys, но не ограничивается ими.

Применение иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов в комбинации с иммунотерапевтическими агентами, такими как моноклональные антитела, может способствовать увеличению продолжительности жизни с помощью ряда механизмов, включая значительное усиление ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности) (как обсуждалось выше), активацию природных киллеров (NK) и увеличение уровней IFN-α. Нуклеиновые кислоты при их применение в комбинации с моноклональными антителами позволяют снижать дозу антитела, необходимую для достижения биологического эффекта.

Используемые здесь термины "раковый антиген" и "опухолевый антиген" являются взаимозаменяемыми и означают антигены, которые дифференциально экспрессируются раковыми клетками, а поэтому они могут быть использованы для нацеливания на раковые клетки. Раковыми антигенами являются антигены, которые могут потенциально стимулировать возможные опухольспецифические иммунные ответы. Некоторые из этих антигенов кодируются, но необязательно экспрессируются нормальными клетками. Эти антигены могут быть охарактеризованы как антигены, которые являются обычно молчащими (то есть не экспрессируются) в нормальных клетках; или как антигены, которые экспрессируются только на конкретных стадиях дифференцировки; или как антигены, которые временно экспрессируются, например, такие как эмбриональные и фетальные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активированный онкоген ras), гены-супрессоры (например, мутант р53) и гибридные белки, образующиеся в результате внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Другие раковые антигены могут кодироваться вирусными генами, например, такие как антигены, присутствующие на опухолевых РНК- и ДНК-вирусах.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы для лечения и профилактики аутоиммунного заболевания. Аутоиммунное заболевание представляет собой класс заболеваний, при которых собственные антитела субъекта реагируют с тканью хозяина или при которых иммунные эффекторные Т-клетки обладают аутореактивностью по отношению к собственным эндогенным пептидам и вызывают деструкцию ткани. В этом случае иммунный ответ направлен против собственных антигенов субъекта, называемых аутоантигенами. Аутоиммунными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, системная красная волчанка (СКВ), аутоиммунный энцефаломиелит, тяжелая миастения (ТМ), тироидит Хашимото, синдром Гудпасчера, пузырчатка (например, вульгарная пузырчатка), болезнь Грейвса, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ассоциированная с антителами против коллагена, смешанное заболевание соединительных тканей, полимиозит, перниционная анемия, идиопатическая болезнь Аддиссона, бесплодие, ассоциированное с аутоиммунным заболеванием, гломерулонефрит (например, серповидный гломерулонефрит, пролиферативный гломерулонефрит), буллезный пемфигоид, синдром Шегрена, инсулинорезистентность и аутоимунный сахарный диабет.

Используемый здесь термин "аутоантиген" означает антиген нормальной ткани хозяина. Нормальная ткань хозяина не содержит раковых клеток. Таким образом, в случае аутоиммунного заболевания иммунный ответ, вырабатываемый против аутоантигена, является нежелательным иммунным ответом и приводит к деструкции и поражению нормальной ткани, тогда как иммунный ответ, вырабатываемый против ракового антигена, является желательным иммунным ответом и приводит к деструкции опухоли или раковой опухоли. Таким образом, в некоторых аспектах настоящего изобретения, относящихся к лечению аутоиммунных заболеваний, не рекомендуется вводить иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды вместе с аутоантигенами, а в частности, с тем антигенами, которые являются мишенями при аутоиммунном расстройстве.

В других случаях иммуностимулирующие CpG-содержащие нуклеиновые кислоты могут быть доставлены с малыми дозами аутоантигенов. В исследованиях на ряде животных было продемонстрировано, что введение в слизистую малых доз антигена может приводить к устойчивой иммунной гипореактивности или "толерантности". Очевидно, что в данном случае активным механизмом является опосредованное цитокином отклонение от иммунного Th1-ответа преимущественно в сторону Th2- и Th3-ответа (то есть с преобладанием TGF-β-ответа). Активная супрессия с доставкой низкой дозы антигена может также подавлять нерелевантный иммунный ответ (супрессия "свидетеля"), который представляет собой особый интерес при лечении аутоиммунных заболеваний, например ревматоидного артрита и СКВ. Супрессия "свидетеля" предусматривает секрецию Th1-контррегуляторных супрессорных цитокинов в локальном окружении, где провоспалительные и Th1-цитокины высвобождаются по антигенспецифическому или антиген-неспецифическому механизму. Этот феномен определяется используемым здесь термином "толерантность". Действительно, пероральная толерантность является эффективной при лечении ряда аутоиммунных заболеваний у животных, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), экспериментальную аутоиммунную тяжелую миастению, индуцированный коллагеном артрит (ИКА) и инсулинзависимый сахарный диабет. В этих моделях предупреждение и подавление аутоиммунных заболеваний ассоциируется со сдвигом антигенспецифического гуморального и клеточного ответов от Th1 к Th2/Th3-ответу.

Настоящее изобретение также относится с способу индуцирования антиген-неспецифической активации природной иммунной системы и резистентности широкого спектра к инфекционной стимуляции с применением иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов. Используемый здесь термин "антиген-неспецифическая активация природной иммунной системы" означает активацию иммунных клеток, не являющихся В-клетками, и он может, например, содержать активацию NK-клеток, Т-клеток или других иммунных клеток, которые могут отвечать антиген-зависимым способом, или комбинацию этих клеток. Индуцирование резистентности к инфекциям широкого спектра происходит вследствие того, что иммунные клетки присутствуют в активной форме и примированы для ответа на любое инвазивное соединение или инвазивный микроорганизм. Эти клетки не должны быть специфически примированы против конкретного антигена. Это особенно важно в случае бактериологической войны и в других случаях, описанных выше, например, при путешествиях.

Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотидам, имеющим хиральные межнуклеотидные связи. Как описано выше, мягкие и полумягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут иметь фосфодиэфироподобные связи между С и G. Одним из примеров фосфодиэфироподобной связи является фосфортиоатная связь в конформации Rp.

По крайней мере, в одном исследовании было проанализировано влияние п-хиральности на иммуностимулирующие эффекты CpG-олигонуклеотидов. Yu et al. провели сравнение стерео-обогащенных (не стерео-чистых) фосфортиоатных (ФТ)-олигонуклеотидов на их способность индуцировать пролиферацию клеток селезенки (Yu et al., 2000). В этом исследовании было обнаружено, что 19-мерная последовательность, содержащая один мотив CpG, индуцирует высокие уровни пролиферации клеток селезенки мышей, если указанный олигонуклеотид был синтезирован с рандомизированной п-хиральностью или обогащен межнуклеотидными Sp-связями, однако эта пролиферация заметно снижалась в том случае, когда указанный олигонуклеотид был обогащен межнуклеотидными Rp-связями (Yu et al., 2000). Однако в этом исследовании не оценивалась специфическая роль п-хиральности динуклеотида CpG, а также не было определено, обладают ли Rp-CpG-олигонуклеотиды активностью в анализах на кратковременную стимуляцию.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что п-хиральность олигонуклеотида может, очевидно, оказывать противоположное действие на иммунную активность CpG-олигонуклеотида в зависимости от времени измерения активности. В раннее время, через 40 минут, фосфорилирование JNK в клетках мышиной селезенки индуцировал Rp-стереоизомер, а не Sp-стереоизомер фосфортиоатного CpG-олигонуклеотида (как обсуждается в примерах). В противоположность этому при анализе в более позднее время, через 44 часа, активным стимулятором пролиферации клеток селезенки был Sp-стереоизомер, а не Rp-стереоизомер. Авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что такое различие в кинетике и в биологической активности Rp- и Sp-стереоизомеров не было обусловлено каким-либо различием в их поглощении клетками, а по всей вероятности, это было обусловлено двумя противоположными биологическими механизмами п-хиральности. Во-первых, повышенная активность Rp-стереоизомера по сравнению с Sp-стереоизомером в стимуляции иммунных клеток на раннем этапе времени указывает на то, что Rp может быть более эффективным при взаимодействии с CpG-рецептором, TLR9 или при индуцировании последующих путей передачи сигнала. С другой стороны, более быстрая деградация Rp-PS-олигонуклеотидов по сравнению с Sp-олигонуклеотидами приводит к значительному сокращению времени передачи сигнала, а поэтому, вероятно, что Sp-PS-олигонуклеотиды обладают большей биологической активностью при их тестировании в более позднее время.

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что сообщаемое ранее относительное отсутствие иммунной стимуляции Rp-PS-олигонуклеотидами обусловлено лишь их чувствительностью к нуклеазе, а не присущей им неспособностью стимулировать CpG-рецептор и последующие пути передачи сигнала. При тестировании на их способность стимулировать фосфорилирование JNK, которое указывает на активность этого митоген-активированного протеинкиназного пути, Rp-олигонуклеотид оказался наиболее активным, а за ним следует стерео-рандомизированный олигонуклеотид, тогда как Sp-олигонуклеотид не обладал какой-либо детектируемой активностью. Однако при сравнении этих олигонуклеотидов на способность активировать NF-kB-путь, которая была оценена посредством деградации ингибирующего белка IkB-α, было обнаружено, что все CpG-олигонуклеотиды были активными, хотя контрольный олигонуклеотид, не содержащий CpG, не индуцировал деградацию IkB-α. Таким образом, Sp-олигонуклеотид все еще оставался биологически активным. Такое отсутствие индуцирования JNK-пути может быть обусловлено различиями в кинетике активации JNK- и NF-kB-путей, но из-за ограниченных количеств стереоспецифического олигонуклеотида, необходимых для тестирования, авторы настоящего изобретения не смогли подтвердить эту гипотезу.

В экспериментах, описанных в примерах, был неожиданно обнаружен сильный эффект п-хиральности самого динуклеотида CpG. По сравнению со стерео-рандомизированным CpG-олигонуклеотидом, другой олигонуклеотид того же типа, в котором один динуклеотид CpG имеет Rp-связь был несколько более активным, тогда как олигонуклеотид того же типа, но содержащий Sp-связь, был почти неактивным в индуцировании пролиферации клеток селезенки. Потеря активности Sp-аналогом подтверждает гипотезу авторов настоящего изобретения, что рецептор TLR9 может не быть инертным по отношению к хиральности динуклеотида CpG в ДНК, с которым он взаимодействует, но фактически он может лучше стимулироваться Rp-стереоизомером. Таким образом, стимулирующий эффект стерео-рандомизированного олигонуклеотида, вероятно, обусловлен не только присутствием 50% Sp-связей, которые замедляют деградацию, но также и тем фактором, что половина олигонуклеотидных молекул будет иметь Rp-хиральность в динуклеотиде CpG, что, очевидно, будет приводить к усилению иммуностимулирующих эффектов.

Чувствительность Rp-PS-связей к расщеплению нуклеазой имеет важное значение для интерпретации фармакокинетических (ФК) исследований и исследований метаболизма PS-олигонуклеотидов у человека или животных. Известно, что преобладающей активностью сывороточной нуклеазы является активность 3'-экзонуклеазы. Предполагается, что в типичном растворе стерео-рандомизированного PS-олигонуклеотида последняя межнуклеотидная 3'-связь представляет Rp-хиральность в одной половине данных молекул. Поэтому у этих 50% PS-олигонуклеотидных молекул концевое 3'-основание будет достаточно быстро отщепляться после i.v.-вливания. Вторая от 3'-конца межнуклеотидная связь должна представлять Rp-хиральность в одной половине этих молекул, а поэтому можно предположить, что у 25% исходных PS-олигонуклеотидных молекул 3'-конец может быть относительно быстро укорочен на два основания. Можно предположить, что этот процесс in vivo отщепления основания, включая межнуклеотидные 3'-Rp-связи, будет продолжаться до тех пор, пока межнуклеотидная 3'-связь не приобретет Sp-конфигурацию. Поэтому, если PS-олигонуклеотиды были синтезированы так, чтобы они содержали 3'-концевую Sp-связь, то они должны быть подвержены гораздо более медленной деградации и иметь другой РК-профиль по сравнению со стерео-рандомизированными PS-олигонуклеотидами. Это позволило бы использовать несколько более короткие олигонуклеотиды для in vivo применения. При конструировании оптимизированных олигонуклеотидов для получения антисмысловых структур усиление связывания Rp-стереоизомера с РНК будет указывать на необходимость использовать по возможности только внутреннюю часть олигонуклеотида в Rp-конфигурации. С другой стороны, оптимизированным CpG-олигонуклеотидом, используемым для иммуностимуляции, может быть один из олигонуклеотидов, в которых все межнуклеотидные связи за исключением CpG должны представлять Sp-хиральность.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть непосредственно доставлены субъекту, либо они могут быть введены в комбинации с комплексом для доставки нуклеиновой кислоты. Комплекс для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, ассоциированную с нацеливающим средством для доставки (например, связанную с этим средством ионной или ковалентной связью, или инкапсулированную в этом средстве), например, с молекулой, которая обеспечивает более высокую аффинность связывания с клеткой-мишенью. Примерами комплексов для доставки нуклеиновой кислоты являются нуклеиновые кислоты, ассоциированные со стерином (например, с холестерином), липидом (например, с катионным липидом, с виросомой или с липосомой) или агентами, специфически связывающимися с клеткой-мишенью (например, с лигандом, распознаваемым рецептором клеточной поверхности). Предпочтительными комплексами могут быть комплексы, достаточно стабильные in vivo, что позволяет избежать продуцирования значительных уровней несвязанной нуклеиновой кислоты перед ее интернализацией клеткой-мишенью. Однако указанный комплекс может расщепляться в соответствующих условиях внутри клетки, в результате чего нуклеиновая кислота будет высвобождаться в функциональной форме.

Носители для доставки или устройства для доставки антигенов и олигонуклеотидов на поверхности были описаны в литературе. Иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид и/или антиген и/или другие терапевтические средства могут быть введены отдельно (например, в физиологическом растворе или в буфере) или с применением любых носителей для доставки, известных специалистам. Так, например, были описаны следующие носители для доставки: кохлеаты (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996), эмульсомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1999, Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); липосомы (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b), живые бактериальные векторы (например, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); живые вирусные векторы (например, вирус коровьей оспы, аденовирус, вирус простого герпеса) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Morrow et al., 1999); микросферы (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); нуклеиновокислотные вакцины (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); полимерные кольца (Wyatt et al., 1998); протеосомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); фторид натрия (Hashi et al., 1998); трансгенные растения (Tacket et al., Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); виросомы (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); вирусоподобные частицы (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Специалистам известны и другие носители для доставки, и некоторые дополнительные примеры описаны ниже в обсуждении векторов.

Используемый здесь термин "эффективное количество иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида" означает количество, необходимое или достаточное для достижения нужного биологического эффекта. Так, например, эффективное количество иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида, вводимого вместе с антигеном для индуцирования иммунного ответа, продуцируемого в слизистой, означает количество, необходимое для вырабатывания IgA в ответ на воздействие антигена, тогда как количество, необходимое для индуцирования системного иммунного ответа, означает количество, необходимое для продуцирования IgG в ответ на воздействие указанного антигена. Путем комбинирования с описанными здесь способами и путем выбора конкретного соединения из различных активных соединений с учетом таких важных факторов, как их эффективность, относительная биологическая доступность, масса тела пациента, тяжесть негативных побочных эффектов и предпочтительная схема введения, может быть разработана эффективная схема профилактического или терапевтического лечения, которое не будет вызывать значительных токсических эффектов и также будет абсолютно эффективным для лечения конкретного субъекта. Эффективное количество соединения для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как конкретное заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретно вводимый иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид, масса субъекта или тяжесть его заболевания или состояния. Каждый специалист может эмпирически определить эффективное количество конкретного иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида и/или антигена и/или другого терапевтического агента без излишнего экспериментирования.

Дозы описанных здесь соединений для доставки через слизистую или для местной доставки субъекту обычно составляют в пределах от 0,1 мкг до 10 мг на одно введение в зависимости от частоты введения, которое может быть осуществлено ежедневно, один раз в неделю или один раз в месяц или через другие интервалы времени. В большинстве случаев дозы для введения через слизистую или для местного введения составляют в пределах примерно от 10 мкг до 5 мг на одно введение, а в основном примерно от 100 мкг до 1 мг, и такое введение может быть осуществлено 2-4 раза через промежутки времени в несколько дней или недель. В основном дозы иммуностимулирующего средства составляют в пределах от 1 мкг до 10 мг на одно введение, а в большинстве случаев, в пределах от 10 мкг до 1 мг ежедневно или один раз в неделю. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки субъекту в целях индуцирования у него ангигенспецифического иммунного ответа, где указанное соединение вводят вместе с антигеном, но не с другим терапевтическим агентом, обычно в 5-10000 раз выше, в основном в 10-1000 раз выше, а в большинстве случаев в 20-100 раз выше, чем эффективная доза вакцинного адъюванта или иммуностимуляторов, доставляемых через слизистую. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки в целях индуцирования у субъекта природного иммунного ответа, либо для усиления ADCC, либо для индуцирования антигенспецифического иммунного ответа при введении иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов в комбинации с другими терапевтическими агентами или в специальных носителях для доставки, обычно составляют примерно от 0,1 мкг до 10 мг на одно введение в зависимости от схемы введения, которое может быть осуществлено ежедневно, один раз в неделю или один раз в месяц или через другие промежутки времени. В большинстве случаев парентеральные дозы для таких целей составляют примерно от 10 мкг до 5 мг на одно введение, а в основном примерно от 100 мкг до 1 мг, где такое введение может быть осуществлено 2-4 раза через промежутки времени в несколько дней или недель. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения парентеральные дозы, вводимые в этих целях, могут в 5-10000 раз превышать типичные дозы, описанные выше.

Для любого описанного здесь соединения терапевтически эффективное количество может быть сначала определено с применением животных-моделей. Терапевтически эффективная доза может быть также определена исходя из данных, полученных для человеческих CpG-олигонуклеотидов, которые были протестированы у человека (были проведены клинические испытания с участием человека) и для соединений, о которых известно, что они обладают аналогичными фармакологическими активностями, например, таких как другие адъюванты, например, LT и другие антигены, используемые для вакцинации. Для парентерального введения требуются более высокие дозы. Вводимая доза может быть скорректирована исходя из относительной биологической доступности и эффективности вводимого соединения. Корректировка дозы для достижения максимальной эффективности методами, описанными выше, и другими известными методами, хорошо известными специалистам, может быть осуществлена любым специалистом.

Композиции по настоящему изобретению вводят в фармацевтически приемлемые растворы, которые обычно содержат фармацевтически приемлемые концентрации солей, забуферивающих агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов.

Для терапевтического применения эффективное количество иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида может быть введено субъекту любым способом, позволяющим осуществлять доставку указанного олигонуклеотида на нужную поверхность, например слизистую, или системную доставку. Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлено любым способом, известным специалистам. Предпочтительными способами введения являются, но не ограничиваются ими, пероральное введение, внутримышечное введение, интраназальное введение, подъязычное введение, внутритрахеальное введение, введение путем ингаляции, внутриглазное введение, вагинальное и ректальное введение.

Для перорального введения соединения (то есть иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды, антигены и другие терапевтические агенты) могут быть легко приготовлены путем объединения активного(ных) соединения(й) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными специалистам. С применением таких носителей можно получать соединения по настоящему изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема субъектом, подвергаемым лечению. Фармацевтические препараты для перорального введения могут быть получены в твердом наполнителе путем необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления, если это необходимо, подходящих добавок с получением сердцевины таблеток или драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий-замещенная карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). Если необходимо, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как структурированный поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или их соль, такая как альгинат натрия. Композиции для перорального введения могут быть также получены, но необязательно, в физиологическом растворе или в буферах для нейтрализации внутренней кислотности, либо они могут быть введены без каких-либо носителей.

Также конкретно рассматриваются пероральные лекарственные средства, содержащие вышеуказанный(е) компонент или компоненты. Такой компонент или компоненты могут быть химически модифицированы для достижения эффективной пероральной доставки указанного производного. В общих чертах, такая химическая модификация заключается в том, что к самой молекуле-компоненту присоединяют, по крайней мере, одну составляющую часть, которая (а) позволяет ингибировать протеолиз и (b) способствует поступлению указанной молекулы в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно увеличение общей стабильности данного компонента или компонентов и увеличение времени их циркуляции в организме. Примерами такой составляющей части являются полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. Abuchowski & Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", Enzymes as Drugs, Hocenberg & Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp.367-383; Newmark et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Другими полимерами, которые могут быть использованы в этих целях, являются поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-триоксолан. Как указывалось выше, предпочтительными для фармацевтического применения являются соединения полипропиленгликоля.

Местом высвобождения компонента (или производного) может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалистам известны композиции, которые не растворяются в желудке, а высвобождают активный материал в двенадцатиперстную кишку или в какой-либо другой участок кишечника. При этом предпочтительно, чтобы такое высвобождение не вызывало негативного воздействия на желудочную среду, что может быть достигнуто либо путем защиты олигонуклеотида (или производного), либо путем высвобождения биологически активного вещества вне желудочной среды, например, в кишечнике.

Для обеспечения полной резистентности к желудочной среде покрытие должно быть в основном непроницаемым, по крайней мере, при рН 5,0. Примерами наиболее распространенных инертных ингредиентов, которые обычно используются в качестве энтеросолюбильных покрытий, являются ацетат-тримеллитат целлюлозы (САТ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинилацетатфталат (ПВАФ), эвдрагит L30D, гидратированный; ацетат-фталат целлюлозы (САР), эвдрагит L, эвдрагит S и шеллак. Эти покрытия могут быть использованы в качестве смешанных пленок.

На таблетки могут быть также нанесены покрытия или смесь для покрытия, которые не предназначены для защиты от действия желудочной среды. Такими покрытиями могут быть сахарные покрытия или покрытия, которые облегчают проглатывание таблетки. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой как желатин) для доставки сухого терапевтического вещества, то есть порошка; а для жидких форм может быть использована мягкая желатиновая оболочка. Для облаток материалом для оболочки может быть густой крахмал или другая съедобная бумага. Для изготовления пилюль, таблеток в форме лепешки, сформованных таблеток или тритурата для таблеток может быть использована техника мокрого растирания.

Терапевтическое средство может быть включено в композицию в виде множества макрочастиц в форме гранул или шариков из частиц размером в 1 мм. Композиция, состоящая из материала для введения в виде капсул, может быть приготовлена в виде порошка, слегка спрессованного брикета или даже таблеток. Терапевтическое средство может быть получено путем прессования.

Могут быть включены красители или ароматизирующие агенты. Так, например, олигонуклеотид (или производное) может быть получен (например, путем инкапсулирования в липосому или микросферу), а затем его вводят в пищевой продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий красители или ароматизирующие агенты.

Терапевтическое средство может быть разбавлено, либо его объем может быть увеличен за счет добавления инертного материала. Такими разбавителями могут быть углеводы, а в частности маннит, α-лактоза, безводная лактоза, целлюлоза, сахароза, модифицированные декстраны и крахмал. В качестве наполнителей могут быть также использованы некоторые неорганические соли, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторыми коммерчески доступными разбавителями являются Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell.

В терапевтическую композицию в твердой лекарственной форме могут быть включены дезинтеграторы. Материалами, используемыми в качестве дезинтеграторов, являются, но не ограничиваются ими, крахмал, включая коммерчески доступный дезинтегратор на основе крахмала, Explotab. Могут быть использованы натрийгликолят крахмала, амберлит, натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновая кожура, кислая карбоксиметилцеллюлоза, природные губки и бентонит. Другой формой дезинтегрирующих агентов являются нерастворимые катионообменные смолы. В качестве дезинтегрирующих агентов и связующих веществ могут быть использованы измельченные в порошок смолы, и такими смолами могут быть агар, камедь карайи и трагакантовая камедь. В качестве дезинтегрирующих агентов может быть также использована альгиновая кислота и ее натриевая соль.

Связующие вещества могут быть использованы для скрепления терапевтического агента вместе с другими компонентами с образованием твердой таблетки, и такими веществами являются материалы из натуральных продуктов, таких как аравийская камедь, трагакантовая камедь, крахмал и желатин. Другими связующими агентами являются метилцеллюлоза (МЦ), этилцеллюлоза (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ). Для гранулирования терапевтического вещества могут быть использованы поливинилпирролидон (ПВП) и гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ) в спиртовых растворах.

Для предотвращения слипаний в процессе приготовления терапевтической композиции в эту композицию может быть включено антифрикционное средство. В качестве слоя между терапевтическим материалом и непроницаемой стенкой могут быть использованы замасливатели, и такими замасливателями являются, но не ограничиваются ими, стеариновая кислота, включая ее соли магния и кальция, политетрафторэтилен (ПТФЭ), вазелиновое масло, растительные масла и воски. Могут быть также использованы и растворимые замасливатели, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль с различными молекулярными массами, карбовакс 4000 и 6000.

Для облегчения изменения формы в процессе прессования могут быть добавлены вещества, усиливающие скольжение и улучшающие текучесть лекарственного средства в процессе приготовления композиции. Такие усиливающие скольжение вещества могут содержать крахмал, тальк, пирогенная двуокись кремния и гидратированный силикоалюминат.

Для облегчения растворения терапевтического средства в водной среде может быть добавлено поверхностно-активное вещество в качестве смачивающего агента. Такими поверхностно-активными веществами являются анионогенные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия. Могут быть использованы катионогенные детергенты, которые содержат хлорид бензалкония или хлорид бензэтония. Возможными неионогенными детергентами, которые могут быть включены в композицию в качестве поверхностно-активного вещества, являются лауромакрогол 400, полиоксилстеарат 40, полиокиэтилированное гидрогенизированное касторовое масло 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 40, 60, 65 и 80, эфир жирной кислоты и сахарозы, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностно-активные вещества могут присутствовать в композиции олигонуклеотида или его производного либо отдельно, либо в смеси в различных соотношениях.

Фармацевтическими препаратами, которые могут быть использованы для перорального введения, являются пуш-фит-капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметично запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Пуш-фит-капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими агентами, такими как крахмалы, и/или замасливателями, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло иди жидкие полиэтиленгликоли. Помимо этого могут быть добавлены стабилизаторы. Могут быть также использованы микросферы для перорального введения. Такие микросферы хорошо известны специалистам. Все композиции для перорального введения должны быть приготовлены в дозах, подходящих для такого введения.

Для трансбуккального введения композиции могут быть получены в форме таблеток или пастилок, изготовленных стандартным способом.

Для введения путем ингаляции соединения по настоящему изобретению могут быть легко доставлены в виде аэрозольного спрея, подаваемого из аэрозольной упаковки или ингалятора с применением подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае применения аэрозольной упаковки под давлением стандартная лекарственная доза может быть определена с помощью дозирующего клапана, используемого для доставки определенного количества лекарственного средства. Могут быть получены капсулы и картриджи, например, из желатина, используемые в ингаляторе или в инсуффляторе и содержащие порошкообразную смесь указанного соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

В настоящем изобретении также рассматривается пульмональная доставка олигонуклеотидов (или их производных). Олигонуклеотид (или производное) доставляется в легкие млекопитающего путем вдыхания, и через эпителиальную выстилку легких он поступает в кровоток. Другие описания молекул, которые могут быть введены путем ингаляции, приводятся в работах Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceuticals, 63:135-144 (ацетат лейпролида); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl.5); 143-146 (эндотелин-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol.III, pp.206-212 (a1-антитрипсин); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (а-1-протеиназа); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March (рекомбинантный человеческий гормон роста); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (интерферон-γ и фактор некроза опухоли-альфа) и Platz et al., патент США № 5284656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Метод и композиция для пульмональной доставки лекарственных средств в целях продуцирования системного эффекта описаны в патенте США № 5451569, выданном 19 сентября 1995, Wong et al.

Для осуществления настоящего изобретения предусматривается применение механических устройств широкого ряда, предназначенных для пульмональной доставки терапевтических продуктов, включая, но не ограничиваясь ими, распылители, ингаляторы с дозирующим клапаном и инсуффляторы, и все эти устройства известны специалистам.

Некоторыми конкретными примерами коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения, являются распылитель Ultravent, изготовленный Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; распылитель Acorn II, изготовленный Marquest Medical Products, Engelwood, Colorado; ингалятор с дозирующим клапаном Ventolin, изготовленный Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, и инсуффлятор Spinhaler, изготовленный Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Все указанные устройства требуют применения композиций, подходящих для дозирования олигонуклеотида (или производного). Обычно для каждого конкретного типа устройства используется конкретная композиция, которая помимо обычных разбавителей, адъювантов или носителей, используемых в терапии, может содержать соответствующий пропеллент. Кроме того, предусматривается также применение липосом, микрокапсул или микросфер, включая их комплексы, или другие типы носителей. Химически модифицированный олигонуклеотид может быть также получен в виде различных композиций в зависимости от типа химической модификации или от типа используемого устройства.

Композиции, подходящие для применения с применением распылителей, либо струйных, либо ультразвуковых, обычно содержат олигонуклеотид (или производное), растворенный в воде в концентрации примерно 0,1-25 мг биологически активного олигонуклеотида на мл раствора. Указанная композиция может также содержать буфер и простой сахар (например, для стабилизации олигонуклеотида и регуляции осмотического давления). Для снижения индуцированной на поверхности агрегации олигонуклеотида, вызываемой распылением раствора при образовании аэрозоля, композиция для распылителей может также содержать поверхностно-активное вещество.

Композиции, предназначенные для применения в ингаляторе с дозирующим клапаном, обычно содержат тонко измельченный порошок, содержащий олигонуклеотид (или производное), суспендированный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Таким пропеллентом может быть любое стандартное вещество, используемое в этих целях, например, такое как хлорфторуглерод, хлорфторуглеводород, фторуглеводород или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,2,2-тетрафторэтан или их комбинации. Подходящими поверхностно-активными веществами являются сорбитантриолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может быть также использована олеиновая кислота.

Композиции для дозированной доставки с применением инсуффлятора могут содержать тонко измельченный порошок, содержащий олигонуклеотид (или производное) и могут также содержать вещество, увеличивающее объем, такое как лактоза, сорбит, сахароза или маннит в количествах, облегчающих распыление порошка из данного устройства, например в количестве 50-90% по массе композиции. Для наиболее эффективной доставки в дистальные области легкого олигонуклеотид (или производное) должен быть предпочтительно приготовлен в форме частиц со средним размером менее чем 10 мм (или микрон), а более предпочтительно размером 0,5-5 мм.

Кроме того, предусматривается и интраназальная доставка фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Интраназальная доставка обеспечивает поступление фармацевтической композиции по настоящему изобретению в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос без осаждения данного продукта в легких. Композиции для интраназальной доставки содержат декстран или циклодекстран.

Для интраназального введения подходящим устройством является небольшой жесткий сосуд, к которому подсоединен распылитель с дозирующим клапаном. В одном из вариантов осуществления изобретения определенная доза доставляется путем подачи раствора фармацевтической композиции по настоящему изобретению в камеру определенного объема, которая имеет апертуру размером, обеспечивающим разбрызгивание аэрозоля и аэрольной композиции путем образования спрея при сжатии жидкости в этой камере. Для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению камера подвергается сжатию. В конкретном варианте эта камера представляет собой поршневое устройство. Описанные устройства являются коммерчески доступными.

Альтернативно пластиковый сосуд под давлением с апертурой или отверстием обеспечивает разбрызгивание аэрольной композиции путем образования спрея под давлением. Это отверстие обычно находится в верхней части сосуда, и эта верхняя часть сосуда обычно конусообразно сужается, что позволяет ей частично проходить в носовые ходы для эффективного введения аэрозольной композиции. Предпочтительно, чтобы ингалятор для интраназального введения обеспечивал подачу дозируемого количества аэрозольной композиции для введения нужной дозы лекарственного средства.

Соединения, предназначенные для системной доставки, могут быть приготовлены в виде композиции для парентерального введения путем инъекции, например путем инъекции ударной дозы или путем непрерывного вливания. Композиции для инъекции могут быть получены в виде стандартной лекарственной формы, например в ампулах или во флаконах для многократного введения с добавлением консервантов. Эти композиции могут быть также приготовлены в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и они могут содержать технологические агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения содержат водные растворы активных соединений, полученных в водорастворимой форме. Кроме того, если это необходимо, то суспензии активных соединений могут быть получены в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящими липофильными растворами или носителями являются жирные масла, такие как кунжутное масло; или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость данной суспензии, такие как натрий-замещенная карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Данная суспензия может также содержать, но необязательно, подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы.

Альтернативно активные соединения могут быть получены в порошкообразной форме, которая перед ее применением может быть разведена подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой.

Указанные соединения могут быть также приготовлены в виде композиций для ректального или вагинального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, содержащие, например, стандартные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Помимо композиций, описанных ранее, данные соединения могут быть также приготовлены в виде депо-препарата. Такие препараты пролонгированного действия могут быть получены с применением подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в подходящем масле), или ионообменных смол, или в виде слаборастворимых производных, например, слаборастворимой соли.

Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые или гелевые носители или наполнители. Примерами таких носителей или наполнителей являются, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Подходящими формами жидких или твердых фармацевтических препаратов являются, например, водные или физиологические растворы для ингаляций, микроинкапсулированные препараты, препараты в виде кохлеата; препараты, нанесенные на микроскопические золотые частицы; препараты, содержащиеся в липосомах, в ингаляторах и аэрозолях; таблетки для имплантации в кожу, или препараты, высыхаемые на поврежденном участке с проникновением в кожу. Фармацевтическими композициями могут быть также гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытиями, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных соединений, в которых используются стандартные наполнители и добавки и/или вспомогательные вещества, описанные выше, такие как дезинтеграторы, связующие вещества, вещества для нанесения покрытия, вещества, способствующие набуханию, замасливатели, отдушки, подсластители и солюбилизирующие агенты. Указанные фармацевтические композиции являются подходящими для применения в ряде систем для доставки лекарственных средств. Краткий обзор методов доставки лекарственных средств приводится в работе Langer, Science 249:1527-1533, 1990, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды и необязательно другие терапевтические средства и/или антигены могут быть введены per se (в чистом виде) либо в форме фармацевтически приемлемой соли. Если эти соли используются в медицине, то они должны быть фармацевтически приемлемыми, но для получения таких фармацевтически приемлемых солей обычно используются соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми. Такими солями являются, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфоновой, винной, лимонной, метансульфоновой, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфоновой и бензолсульфоновой кислот. Кроме того, такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, таких как натриевые, калиевые или кальциевые соли карбоновых кислот.

Подходящими забуферивающими агентами являются уксусная кислота и соль (1-2% мас./об.); лимонная кислота и соль (1-3% мас./об.); борная кислота и соль (0,5-2,5% мас./об.) и фосфорная кислота и соль (0,8-2% мас./об.). Подходящими консервантами являются хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимерозал (0,004-0,02% мас./об.).

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат эффективное количество иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида и необязательно антигены и/или другие терапевтические агенты, необязательно включенные в фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или веществ, способствующих инкапсуляции, которые являются подходящими для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин "носитель" означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым может быть объединен активный ингредиент для облегчения введения. Компоненты фармацевтических композиций также должны быть такими, чтобы при смешивании с соединениями по настоящему изобретению или друг с другом они не вступали во взаимодействие друг с другом и не оказывали значительного негативного влияния на желаемую фармацевтическую эффективность.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение изобретения. Полное содержание всех указанных работ (включая литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно рассматриваемые заявки), цитируемых в данной заявке, вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Олигодезоксинуклеотиды (ODN)

Все ODN были закуплены у Biospring (Frankfurt, Germany) или Sigma-Ark (Darmstadt, Germany) и были проконтролированы на идентичность и чистоту фирмой Coley Pharmaceuticals GmbH (Langenfeld, Germany). ODN разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (Sigma, Germany) и хранили при -20°С. Все разведения проводили с применением апирогенных реагентов.

Очистка клеток

Препараты лейкоцитарной пленки периферической крови, взятые у здоровых доноров, мужчин и женщин, были получены из банка крови Дюссельдорфского университета (Германия), и из этих препаратов выделяли МКПК путем центрифугирования на Фиколле-Гипаке (Sigma). Очищенные МКПК либо применяли в свежем виде (для большинства анализов), либо суспендировали в замораживающей среде и хранили при -70°С. При необходимости, аликвоты этих клеток оттаивали, промывали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 (BioWhittaker, Belgium), в которую было добавлено 5% (об./об.) термоинактивированной человеческой сыворотки АВ (BioWhittaker, Belgium) или 10% (об./об.) термоинактивированной FCS, 2 мМ L-глутамина (BioWhittaker), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen (Karlsruhe, Germany)).

Детекция цитокинов

Оттаянные или свежие МКПК высевали на 48-луночные плоскодонные планшеты или на 96-луночные круглодонные планшеты, и инкубировали с ODN в указанных концентрациях в инкубаторе с повышенной влажностью при 37°С. Супернатанты культур собирали, и либо применяли непосредственно, либо хранили в замороженном виде при -20°С до применения. Количество цитокинов в супернатантах оценивали с применением коммерчески доступных ELISA-наборов (Diaclone, USA) или лабораторных ELISA-наборов, разработанных с применением коммерчески доступных антител (от Becton Dickinson/Pharmingen или PBL).

Культуры для проточного цитометрического анализа на активацию NK-клеток

Конъюгированные с флуорохромом моноклональные антитела против CD3 (Т-клеточный маркер), CD56 (NK-клеточный маркер) и CD69 (маркер ранней активации на NK-клетках и Т-клетках) закупали у Becton Dickinson. МКПК инкубировали в течение 24 часов с добавлением или без добавления различных концентраций ODN в 96-луночные круглодонные планшеты. NK-клетки идентифицировали как CD56-положительные и CD3-отрицательные с помощью проточного цитометрического анализа. Данные проточного цитометрического анализа получали на устройстве FACSCalibur (Becton Dickinson). Эти данные анализировали с применением компьютерной программы CellQuest (Becton Dickinson).

Проточный цитометрический анализ маркеров активации клеточной поверхности

Для измерения экспрессии костимулирующей молекулы CD86 в качестве маркера активации на В-клетках МКПК инкубировали в течение 48 часов с ODN в указанных концентрациях и клетки окрашивали mAb против CD19 и CD86 (Pharmingen, Germany). Экспрессию CD86 на CD19-положительных В-клетках оценивали с помощью проточной цитометрии.

Для измерения степени экспрессии костимулирующей молекулы CD80 в качестве маркера активации на моноцитах МКПК инкубировали в течение 48 часов с ODN в указанных концентрациях и клетки окрашивали mAb против CD14, CD19 и CD80 (Pharmingen, Germany). Экспрессию CD80 на CD14-положительных и CD19-отрицательных моноцитах оценивали с помощью проточной цитометрии. Результаты этих измерений даны как средняя интенсивность флуоресценции (MFI).

Пример 1

Уровни интерферона-альфа (IFN-α), IFN-γ, IL-10, IL-6 и TNF-α, секретируемые из человеческих МКПК после обработки этих клеток описанными здесь CpG-олигонуклеотидами, указаны на прилагаемых фиг. 1-5. Тестируемые олигонуклеотиды обозначены на этих графиках ▴. Олигонуклеотид, который служит в качестве позитивного контроля, обозначен . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 1А, 2А, 3А, 4А и 5А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг. 1В, 2В, 3В, 4В и 5В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения исходных точек на графике, отложена по оси Х (мкМ). Ниже графиков указаны уровни цитокина, секретируемого клетками, обработанными негативным контролем (средой), а в некоторых случаях ЛПС, как указано для каждого эксперимента.

Как продемонстрировано на фиг. 1-5, олигонуклеотиды, тестируемые в данных анализах, способны индуцировать секрецию цитокинов приблизительно на эквивалентных или более высоких уровнях, чем уровни, индуцируемые олигонуклеотидами позитивного контроля, имеющими полностью фосфортиоатную основную цепь. Негативный контроль стимулировал продуцирование значительно меньших уровней цитокинов.

Пример 2

Была проведена оценка уровней экспрессии CD69 (MFI) на NK-клетках в ответ на обработку этих клеток тестируемыми олигонуклеотидами по сравнению с контрольными олигонуклеотидами. Экспрессия CD69 является индикатором активации Т-клеток и NK-клеток. Эти клетки обрабатывали тестируемыми олигонуклеотидами, обозначенными ▴ на фиг.6, или олигонуклеотидом позитивного контроля, обозначенным . Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.6А, являются SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 и SEQ ID NO:324. Тестируемыми олигонуклеотидами, показанными на фиг.6В, являются SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327 и SEQ ID NO:328. Олигонуклеотидом позитивного контроля, используемым в этих исследованиях, является SEQ ID NO:329. Ниже графиков указаны уровни экспрессии CD69 на Т- и NK-клетках, обработанных негативным контролем (средой) и ЛПС, для каждого эксперимента.

Как показано на фиг.6, олигонуклеотиды, тестируемые в данных анализах, способны индуцировать экспрессию CD69 приблизительно на эквивалентных или более высоких уровнях, чем уровни, индуцируемые олигонуклеотидами позитивного контроля, имеющими полностью фосфортиоатную основную цепь. Негативный контроль стимулировал продуцирование значительно меньших уровней CD69.

Пример 3

Уровни интерферона-альфа (IFN-α) и IL-10, секретируемые человеческими МКПК после обработки этих клеток описанными здесь CpG-олигонуклеотидами, показаны на прилагаемых фиг. 7-12 и 17. На этих графиках тестируемые олигонуклеотиды обозначены . Олигонуклеотид, который служит в качестве позитивного контроля, SEQ ID NO:242, обозначен ●. Олигонуклеотид, который служит в качестве негативного контроля, SEQ ID NO:330, обозначен . Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 7А и 7В, является SEQ ID NO:313. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 8А и 8В, является SEQ ID NO:314. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 9А и 9В, является SEQ ID NO:319. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 10А и 10В, является SEQ ID NO:316. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 11А и 11В, является SEQ ID NO:317. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 12А и 12В, является SEQ ID NO:320. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 17А и 17В, является SEQ ID NO:321. Концентрация олигонуклеотида, используемая для получения исходных точек на графике, отложена по оси Х (мкМ).

Как показано на фиг. 7-12 и 17, каждый из олигонуклеотидов, тестируемых в данных анализах, способен индуцировать различные уровни и характер секреции цитокинов. Так, например, большинство тестируемых ODN, взятых примерно при эквивалентных или более низких концентрациях, обнаруживало лучшее индуцирование одного или нескольких цитокинов, чем олигонуклеотид позитивного контроля, имеющий полностью фосфортиоатную основную цепь. Негативный контроль индуцировал продуцирование значительно меньших уровней цитокинов.

После инкубирования с SEQ ID NO:313 МКПК секретировали такие же уровни интерферона-альфа (IFN-α) и интерлейкина-10 (IL-10), как и после инкубирования с SEQ ID NO:242. SEQ ID NO:314 индуцировал такие же уровни секреции IL-10 из человеческих МКПК, как и SEQ ID NO:242, но гораздо более высокие уровни секреции IFNα. В отличие от SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:319 индуцировал лишь небольшие уровни секреции IFN-α из человеческих МКПК, но уровни секреции IL-10, индуцируемые этими двумя олигонуклеотидами, были аналогичными. SEQ ID NO:316 способен индуцировать в несколько раз более высокие уровни IFNα из человеческих МКПК, чем SEQ ID NO:242. Также наблюдалось увеличение общего количества секретированного IL-10. SEQ ID NO:317 продемонстрировал свойства, аналогичные свойствам SEQ ID NO:316, однако он индуцировал значительно более высокие уровни секреции IFN-α из человеческих МКПК, чем SEQ ID NO:242. Уровни секреции IL-10 были слегка повышенными. Хотя SEQ ID NO:320 и индуцировал секрецию IFNα и IL-10 из человеческих МКПК, однако этот уровень индуцирования был ниже, чем для SEQ ID NO:242. SEQ ID NO:321 способен индуцировать уровни IFN-α из человеческих МКПК, которые более чем в десять раз превышают уровни IFNα из человеческих МКПК, индуцированные олигонуклеотидом SEQ ID NO:242 (фиг.17А). По сравнению с SEQ ID NO:242 секреция IL-10 из человеческих МКПК, индуцированная SEQ ID NO:321, была несколько выше при более высоких концентрациях этого олигонуклеотида (фиг.17В).

Пример 4

Уровни активации В-клеток и моноцитов после обработки этих клеток описанными здесь CpG-олигонуклеотидами, показаны на прилагаемых фиг. 13-15, 16 и 18-20. На этих графиках, тестируемые олигонуклеотиды обозначены . Олигонуклеотид, который служит в качестве позитивного контроля, SEQ ID NO:242, обозначен ●. Олигонуклеотид, который служит в качестве негативного контроля, SEQ ID NO:330, обозначен . Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 13А и 13В, является SEQ ID NO:313. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 14А и 14В, является SEQ ID NO:314. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 15А и 15В, является SEQ ID NO:319. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 16А и 16В, является SEQ ID NO:316. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 18А и 18В, является SEQ ID NO:321. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 19А и 19В, является SEQ ID NO:317. Тестируемым олигонуклеотидом, показанным на фиг. 20А и 20В, является SEQ ID NO:320. Концентрация олигонуклеотида, используемая для получения исходных точек на графиках, отложена по оси Х (мкМ).

Как продемонстрировано на фиг. 13-15, 16 и 18-20, каждый из олигонуклеотидов, тестируемых в данных анализах, способен индуцировать различные уровни и характер экспрессии маркера клеточной поверхности. Так, например, большинство тестируемых ODN, взятых примерно при эквивалентных или более низких концентрациях, обнаруживали лучшее индуцирование маркеров клеточной поверхности, чем олигонуклеотид позитивного контроля, имеющий полностью фосфортиоатную основную цепь.

Уровень экспрессии CD86 на В-клетках и экспрессии CD80 на моноцитах, индуцированный SEQ ID NO:313, был аналогичен уровню, индуцированному SEQ ID NO:242. В отличие от SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:313 стимулировал клетки при более низких концентрациях, чем SEQ ID NO:242, что дает основание предположить о его более высокой активности. Уровни экспрессии CD86 на В-клетках и экспрессии CD80 на моноцитах, индуцированные SEQ ID NO:314, были аналогичными. Эффект SEQ ID NO:314 наблюдался при его применении в более низких концентрациях, чем SEQ ID NO:242, что свидетельствовало о повышенной активности SEQ ID NO:314. Экспрессия CD86 на поверхности В-клеток сильно активировалась SEQ ID NO:319, при этом уровень сигнала был сравним с уровнем сигнала, индуцируемого SEQ ID NO:242. Что касается уровней экспрессии CD80 на моноцитах, то в этом случае могло быть детектировано лишь слабое их увеличение, индуцированное SEQ ID NO:319. Эффективность SEQ ID NO:319 в индуцировании активации CD86 на В-клетках была немного ниже по сравнению с эффективностью SEQ ID NO:242. По сравнению с SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:316 индуцировал более высокие уровни маркера активации CD86 на В-клетках (фиг.16А) и маркера активации CD80 на моноцитах (фиг.16В). В-клетки сильно активировались после инкубирования человеческих МКПК с SEQ ID NO:321, на что указывала экспрессия CD86 (фиг.18А). Уровень CD86 превышал уровень, индуцированный SEQ ID NO:242. Активация моноцитов, индуцированная SEQ ID NO:321, как было определено по экспрессии CD80, также была сильнее, чем активация, индуцированная SEQ ID NO:242 (фиг.18В). SEQ ID NO:317 индуцировал такие же уровни экспрессии CD86 на В-клетках, как и SEQ ID NO:242 (фиг.19А), тогда как уровни экспрессии маркера активации CD80 на моноцитах были выше, чем уровни активации, индуцированные SEQ ID NO:242 (фиг.19В). SEQ ID NO:320 индуцировал такие же уровни экспрессии CD86 на В-клетках, как и SEQ ID NO:242 (фиг.20А).

Пример 5

Полумягкие олигонуклеотиды обладают иммуностимулирующим действием на человеческие МКПК in vitro.

В этом примере полумягкие олигонуклеотиды анализировали на их способность индуцировать цитокины и хемокины in vitro. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получали от трех здоровых людей-доноров и культивировали в присутствии различных концентраций (0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 5,0 мкМ) полностью стабилизированного CpG SEQ ID NO:242 или полумягкого SEQ ID NO:241. Через 6, 16 или 48 часов супернатанты культур собирали и уровни различных цитокинов (IFN-α, TNF-α, IL-10) и хемокина IP-10 в супернатантах измеряли с помощью ELISA. При низких концентрациях олигонуклеотида полумягкие и полностью стабилизированные олигонуклеотиды индуцировали одинаковые уровни IFN-α в культуре через 16 или 48 часов. Однако максимальное индуцирование IFN-α олигонуклеотидом ODN 5476 достигалось примерно при половинной концентрации этого олигонуклеотида, необходимой для SEQ ID NO:242. При промежуточных концентрациях SEQ ID NO:242 индуцировал большие уровни IFN-α, чем SEQ ID NO:241, а при более высоких концентрациях ни один из SEQ ID NO:242 и SEQ ID NO:241 не индуцировал значительных уровней IFN-α. Хемокин IP-10 стимулировался полумягкими и полностью стабилизированными олигонуклеотидами на аналогичном уровне и с аналогичной зависимостью от их концентраций. В обоих случаях при более низких концентрациях олигонуклеотида наблюдалось примерно 700 пг/мл IP-10, а при более высоких концентрациях олигонуклеотида было индуцировано меньшее количество IP-10. Характер индуцирования IP-10 был аналогичен характеру индуцирования цитокина IL-10 за исключением того, что полумягкий олигонуклеотид при 0,05 мкМ индуцировал значительное количество IL-10, тогда как полностью стабилизированный олигонуклеотид при 0,05 мкМ индуцировал незначительное количество IL-10, или вообще не индуцировал IL-10. Полумягкий и полностью стабилизированный олигонуклеотиды обладали аналогичной способностью индуцировать TNF-α, то есть олигонуклеотиды обоих типов сильно индуцировали TNF-α, особенно при высоких концентрациях.

Таблица 1

Цитокины и хемокин (пг/мл)¹, индуцированные олигонуклеотидами (мкМ)

¹ Величины даны как среднее (стандартное отклонение)

Пример 6

Стимуляция мышиных макрофагов in vitro полумягким SEQ ID NO:241 по сравнению с полностью стабилизированным ODN.

Клеточную линию мышиных макрофагов (RАW264) инкубировали в течение 16 часов с полумягким олигонуклеотидом SEQ ID NO:241, с полностью стабилизированным олигонуклеотидом SEQ ID NO:242, с полностью стабилизированным ODN 1826, с липополисахаридом (ЛПС) или с PBS. Полумягкий ODN и полностью стабилизированные ODN оценивали при концентрациях 0,02; 0,05 и 0,1 мкМ. Супернатанты собирали и субъединицу р40 IL-12 (IL-12р40, пг/мл) измеряли с помощью ELISA. Результаты приводятся в таблице 2. Полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 был значительно более активным в индуцировании секреции IL-12р40 макрофагами, чем любой из полностью стабилизированных ODN.

Таблица 2

Секреция IL-12р40 мышиными макрофагами, стимулированными полумягким олигонуклеотидом SEQ ID NO:241

Пример 7

Полумягкие олигонуклеотиды В-класса с последовательностью, оптимизированной для стимуляции человеческих иммунных клеток, являются сильными иммуностимуляторами мышиных иммунных клеток.

Сообщалось, что человеческие и мышиные иммунные клетки отвечают на действие различных CpG-ODN. Полностью стабилизированный CpG SEQ ID NO:242 рассматривался как "оптимальный" для стимуляции человеческих иммунных клеток, но не считался "оптимальным" для стимуляции мышиных иммунных клеток. И наоборот, полностью стабилизированный CpG-ODN 5890 (5' T*C*A*A*C*G*T*T3') считался "оптимальным" для стимуляции мышиных иммунных клеток, но не рассматривался как "оптимальный" для стимуляции человеческих иммунных клеток. Сообщалось, что как человеческие, так и мышиные В-клетки экспрессируют TLR9. TLR9-экспрессирующие мышиные спленоциты НЕК293 культивировали в присутствии различных концентраций полностью стабилизированного CpG SEQ ID NO:242, полностью стабилизированного CpG-ODN 5890 или полумягкого SEQ ID NO:241, и активацию TLR9 измеряли как описано ниже. Клетки, используемые для этого анализа, экспрессировали мышиный TLR9 и содержали конструкцию репортерного гена. Клетки инкубировали с ODN в течение 16 часов при 37°С в инкубаторе с повышенной влажностью. Каждую экспериментальную точку получали с тремя повторениями. Клетки подвергали лизису и анализировали на активность репортерного гена. Индексы стимуляции вычисляли по отношению к активности репортерного гена в среде без добавления ODN. Полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 и полностью стабилизированный олигонуклеотид SEQ ID NO:242 имели идентичную нуклеотидную последовательность. Результаты приводятся в таблице 3. При самых низких концентрациях SEQ ID NO:241 и SEQ ID NO:242 обладали минимальным иммуностимулирующим действием. Однако по мере увеличения концентрации до 14 нМ и выше SEQ ID NO:241 обладал явно более высоким иммуностимулирующим действием, чем SEQ ID NO:242. При самых высоких концентрациях, исследуемых в данном эксперименте, SEQ ID NO:241 обладал, по крайней мере, такой же стимулирующей активностью, как и оптимизированный для мышей полностью стабилизированный олигонуклеотид ODN 5890.

Таблица 3

Индекс стимуляции мышиных TLR9-экспрессирующих клеток НЕК293 полумягким ODN с последовательностью, оптимизированной для человеческих клеток

Примеры 8-9

Полумягкие олигонуклеотиды индуцируют активацию NK-клеток.

Полумягкие и полностью стабилизированные олигонуклеотиды также сравнивали с точки зрения их способности стимулировать активацию NK-клеток. С применением стандартного анализа на высвобождение хрома, 10×10⁶ клеток селезенки мышей BALB/c культивировали в течение 48 часов в 2 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS (термоинактивированной до 65°С в течение 30 минут), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамата с добавлением либо полумягкого SEQ ID NO:241, либо полностью стабилизированного SEQ ID NO:242, причем каждый ODN добавляют до конечной концентрации 1, 3 или 10 мкг/мл, или без добавления указанных олигонуклеотидов. Клетки промывали, а затем применяли в качестве эффекторных клеток в кратковременном анализе на высвобождение ⁵¹Cr с применением YAC-1 и 2С11, двух NK-чувствительных клеточных линий-мишеней (Ballas Z.K. et al. (1993) J. Immunol., 150:17-30). Эффекторные клетки в различных концентрациях добавляли к 10⁴⁵¹Cr-меченных клеток-мишеней в 0,2 мл, в микротитрационных планшетах с V-образным дном и инкубировали в 5% СО₂ в течение 4 часов при 37°С. Исследуемые отношения "эффекторная клетка : клетка-мишень (Е:Т) составляли 6,25:1, 25:1, 50:1 и 100:1. Затем планшеты центрифугировали и аликвоты супернатанта подсчитывали на радиоактивность. Процент специфического лизиса определяли путем вычисления отношения ⁵¹Cr, высвобождаемого в присутствии эффекторных клеток, минус ⁵¹Cr, высвобождаемый при культивировании только с клетками-мишенями, к общему количеству, высвобождаемому после клеточного лизиса в 2% уксусной кислоте (100-процентный лизис) минус ⁵¹Cr (им/мин), высвобождаемый при культивировании только одних клеток. Результаты представлены ниже в таблице 5. В целом полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 и полностью стабилизированный SEQ ID NO:242 индуцировали в основном сравнимые уровни активации NK-клеток при всех концентрациях ODN и при всех проанализированных отношениях Е:Т.

Таблица 5

Специфический лизис, опосредованный NK-клетками

Пример 10

Полумягкие олигонуклеотиды обладают в основном большей иммуностимулирующей активностью, чем полностью фосфортиоатные олигонуклеотиды с той же самой или аналогичной последовательностью.

Все тестируемые полумягкие варианты являются более активными в анализе на человеческий TLR9, чем соответствующая молекула с однородной фосфортиоатной основной цепью (таблица 6). Средний индекс стимуляции вычисляли по экспериментальным точкам, полученным для четырех концентраций (0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 2 мкМ и 8 мкМ). В этой таблице U представляет собой 2'-дезоксиурацил.

Таблица 6

Относительные средние индексы стимуляции полумягких олигонуклеотидов по сравнению с полностью фосфортиоатными олигонуклеотидами, имеющими ту же самую или аналогичную последовательность

Пример 11

Повышенная in vitro активность полумягких вариантов полностью стабилизированных олигонуклеотидов со слабой иммуностимулирующей способностью.

(T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T, SEQ ID NO:244) представляет собой полностью стабилизированный, полностью фосфортиоатный CpG-олигонуклеотид, обладающий низкой иммуностимулирующей активностью по сравнению с SEQ ID NO:242. Родственные полумягкие олигонуклеотиды (T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*Т, SEQ ID NO:258) и (T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*Т, SEQ ID NO:243) были во много раз более активными, чем SEQ ID NO:244 и даже более активными, чем SEQ ID NO:242.

Таблица 7

Повышенная иммуностимулирующая активность полумягких вариантов полностью стабилизированного олигонуклеотида со слабой иммуностимулирующей способностью

Пример 12

Полумягкие олигонуклеотиды с меньшей длиной обладают иммуностимулирующей активностью in vitro.

Полумягкий 16-мер, SEQ ID NO:283, 16-мер, SEQ ID NO:245, 17-мер, SEQ ID NO:284 и 24-мер, SEQ ID NO:241 сравнивали с полностью стабилизированными ODN, 24-мером, SEQ ID NO:242, и 18-мером, SEQ ID NO:285 с точки зрения их способности стимулировать передачу сигнала TLR9. К клеткам HEK293, трансфецированным человеческим TLR9, добавляли каждый из олигонуклеотидов и конструкцию репортерного гена при концентрациях 1, 6, 12 или 24 мкг/мл, после чего определяли уровень активации TLR9, как описано выше.

18-мерный полностью стабилизированный олигонуклеотид ODN SEQ ID NO:285 обладал меньшей иммуностимулирующей активностью, чем 24-мерный полностью стабилизированный олигонуклеотид SEQ ID NO:242 при всех оцениваемых концентрациях, а 16-мерный и 17-мерный полумягкие олигонуклеотиды обладали, по крайней мере, такой же стимулирующей активностью, как и 24-мер SEQ ID NO:242 при концентрациях 6 мкг/мл и выше. Кроме того, 16-мерный и 17-мерный полумягкие олигонуклеотиды обладали почти такой же иммуностимулирующей активностью, как и 24-мерный полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241.

Таблица 8

Иммуностимулирующая активность коротких полумягких олигонуклеотидов по сравнению с короткими и длинными полностью стабилизированными и полумягкими олигонуклеотидами

Пример 13

Полумягкие олигонуклеотиды обладают иммуностимулирующей активностью in vivo.

Мышей BALB/c разделяли на группы и подкожно вводили 400 мкг полумягкого олигонуклеотида SEQ ID NO:241, полностью стабилизированного иммуностимулирующего олигонуклеотида SEQ ID NO:242, полностью стабилизированного олигонуклеотида негативного контроля (TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT, SEQ ID NO:286) или эквивалентный объем забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Через 3 часа после инъекции у животных брали кровь и определяли уровни IP-10, IFN-γ и TNF-α в сыворотке с помощью соответствующего цитокин-специфического ELISA-анализа. Уровни IP-10 в сыворотке животных, которым вводили полумягкий SEQ ID NO:241 (8000-12000 пг/мл), были приблизительно в два раза выше, чем уровни IP-10 у животных, которым вводили полностью стабилизированный иммуностимулирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:242 (3500-8000 пг/мл). Уровни IP-10 в сыворотке животных, которым вводили контрольный SEQ ID NO:286, были такими же низкими, как и у животных, которым вводили PBS. Полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 и полностью стабилизированный иммуностимулирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:242 индуцировали аналогичные количества IFN-γ приблизительно 150 пг/мл. Полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 индуцировал TNF-α на 30-45% больше, чем полностью стабилизированный иммуностимулирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:242 (приблизительно 1550 пг/мл по сравнению примерно с 1175 пг/мл в одном эксперименте и примерно 710 пг/мл по сравнению с 490 пг/мл в другом эксперименте).

В другой серии in vivo-экспериментов полумягкие и полностью стабилизированные олигонуклеотиды были оценены на их способность к уничтожению опухолей у мышей BALB/c. Мышам BALB/c трех групп инъецировали i.p. спонтанные клетки мышиной почечной аденокарциномы (Renca) с применением модели развивающейся опухоли. Salup R.R. et al. (1985) J. Immunopharmacol 7:417-36. Мышам каждой группы также вводили либо 100 мг полумягкого олигонуклеотида SEQ ID NO:241, либо 100 мг полностью стабилизированного иммуностимулирующего олигонуклеотида SEQ ID NO:242, либо эквивалентный объем PBS. Затем наблюдали за выживаемостью мышей и после их гибели определяли размер опухоли. У мышей, обработанных PBS в качестве контроля, время выживания составляло в среднем 44 дня, а у 20% мышей оно составляло 50 дней. В противоположность этому у мышей, которым вводили полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241, выживаемость через 50 дней составляла 80%, а у мышей, которым вводили полностью стабилизированный иммуностимулирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:242, выживаемость через 50 дней составляла 70%. Что касается размеров опухоли (в кубических миллиметрах), то через 52 дня у мышей, которым вводили PBS, объемы опухоли составляли почти 1200 мм³, а у мышей, которым вводили полумягкий олигонуклеотид SEQ ID NO:241 или полностью стабилизированный иммуностимулирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:242, объемы опухолей составляли примерно 250 мм³ и 180 мм³ соответственно. Таким образом, как полумягкий олигонуклеотид, так и полностью стабилизированный олигонуклеотид были в высокой степени эффективными в отношении снижения массы опухоли и увеличения продолжительности жизни у этих экспериментальных моделей.

Пример 14

Мягкие или полумягкие олигонуклеотиды обладают пониженной нефротоксичностью.

Было отмечено, что введение полностью стабилизированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов обезьянам может быть ассоциировано с развитием гломерулонефрита, то есть воспаления почек. Диагностика и наблюдение развития гломерулонефрита могут быть осуществлены по присутствию эритроцитов и белка в моче, которое часто сопровождается снижением скорости клубочковой фильтрации (азотемией), удерживанием воды и соли, гипертензией и отеками. Обычно моча в основном не содержит клеток крови и белков плазмы. Диагноз может быть также установлен путем гистологического анализа почечной ткани. Известно, что почечная ткань богата нуклеазами, а поэтому ожидается, что большей активностью будут обладать мягкие олигонуклеотиды, чем полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

Обезьян разделяли на две группы, при этом одной группе вводили мягкие олигонуклеотиды, а другой группе вводили полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды. Мягкие олигонуклеотиды и полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют идентичные последовательности и отличаются лишь межнуклеотидными связями. Обезьянам обеих групп вводили одинаковые дозы иммуностимулирующего олигонуклеотида. Предварительная (базовая) обработка и периодические измерения во время обработки позволяли получить, по крайней мере, один параметр, используемый для анализов на наличие гломерулонефрита, включая например, развернутый анализ мочи на протеинурию и/или гематурию, микроскопический анализ мочи на наличие эритроцитов и/или цилиндрических эритроцитов, анализ на концентрацию белка в моче, на азот мочевины крови (BUN) и креатинин сыворотки, измерение кровяного давления, определение массы тела, и биопсия почек на оптическом и/или электронном микроскопе для анализа тканей. Клинические данные коррелировали с типом иммуностимулирующего олигонуклеотида, вводимого каждой обезьяне, и результаты, полученные для каждой группы, сравнивали в целях оценки статистической значимости.

Кроме того, но необязательно для оценки результатов в зависимости от дозы олигонуклеотидов в исследования были включены дополнительные пары групп обезьян, которым вводили либо мягкие или полумягкие олигонуклеотиды, либо полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды, как описано выше, но в более высоких или в более низких дозах.

Обезьяны, которым вводили мягкие олигонуклеотиды, были значительно меньше подвержены развитию гломерулонефрита, чем обезьяны, которым вводили полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

Пример 15

Мягкие олигонуклеотиды обладают повышенной иммуностимулирующей активностью при высоких концентрациях.

Мягкие олигонуклеотиды сравнивали с SEQ ID NO:242 с точки зрения их способности индуцировать TLR9-активность. Мягкий ODN и контрольный SEQ ID NO:242 сравнивали при каждой из четырех концентраций: 1, 6, 12 и 24 мкг/мл. Отношения уровня активации каждым мягким олигонуклеотидом по сравнению с активацией олигонуклеотидом SEQ ID NO:242, при каждой концентрации, представлены ниже в таблице 9. Эти результаты указывают на то, что, при более высоких тестируемых концентрациях мягкие олигонуклеотиды обладают большей иммуностимулирующей активностью, чем SEQ ID NO:242.

Таблица 9

Относительная активность мягких олигонуклеотидов по сравнению с олигонуклеотидом SEQ ID NO:242 при каждой концентрации

Пример 16

Стабильность олигонуклеотидов в сыворотке и в тканях

Мышам подкожно инъецировали 25 мг/кг полумягкого олигонуклеотида SEQ ID NO:241, мягкого олигонуклеотида (T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T; SEQ ID NO:294) или полностью стабилизированного олигонуклеотида SEQ ID NO:242. Образцы тканей и сыворотки брали через определенное количество времени (часов) и анализировали на присутствие интактного олигонуклеотида и его фрагментов.

В образцы ткани или сыворотки вводили шприцем известное количество внутреннего стандартного ODN (1,25 мкг polyT) и ODN выделяли из образцов ткани и плазмы методами твердофазной экстракции (SPE), описанными ниже. Полученные растворы, содержащие аналит, метаболиты и внутренний стандарт, анализировали с помощью электрофореза в капиллярном геле (CGE), а также методами MALDI-TOF, описанными ниже. Затем определяли общие количества выделенного ODN (то есть аналита плюс метаболитов) из образцов почек, печени, селезенки и сыворотки, проанализированных с помощью CGE. Вычисляли стандартное отклонение. Для каждого метаболита определяли относительное количество, выраженное в процентах от общей площади пика.

SPE. Для выделения ODN из сыворотки в 100 мкг образца вводили 1,25 мкг внутреннего стандарта ODN, смешивали и растворяли в 5 мл SAX-буфера. Этот раствор наносили на анионообменную колонку (SAX, Agilent), затем колонку промывали и ODN элюировали буфером с повышенной ионной силой. Полученный элюат обессоливали на обращенно-фазовой (ОФ) колонке (Glen Research) или на аналогичной колонке (HLB, Waters). Элюаты с ОФ-колонки, содержащие только воду и ацетонитрил, сушили и солюбилизировали в той же самой пробирке в 60 мкл деионизованной воды. Для дальнейшего обессоливания образцов проводили мембранный диализ. Образцы анализировали непосредственно с помощью электрофореза в капиллярном геле. Для MALDI-TOF MS образцы применяли либо в неразбавленном виде, либо в концентрированном виде, то есть 50 мкл образца ODN сушили в вакууме и растворяли в деионизованной воде, а затем анализировали, как описано ниже.

ODN выделяли из тканей в соответствии с аналогичным протоколом SPE. 100 мг ткани гомогенизировали с применением устройства FastPrep. Затем добавляли протеиназу К и белки гидролизовали в течение 2 ч. В методе SPE, описанном выше, экстракцию фенолом осуществляли перед пропусканием водорастворимой фракции.

CGE. Обессоленные образцы, содержащие аналит, его метаболиты и определенное количество внутреннего стандарта ODN, электрокинетически инъецировали в заполненные гелем капилляры (нейтральный, 30 см, ДНК-капилляр еСАР, Beckman # 477477) на стороне пробы с предварительной инъекцией воды. При этом подавали напряжение 300 В/см, и непрерывно проводили детекцию при 260 нм. Разделение осуществляли при 25°С в буфере трис/борная кислота/EDTA, содержащем 7М мочевину. Аналит идентифицировали по относительному времени его миграции (МТ_олиго/МТ_{внут.ст.}), то есть по отношению ко времени миграции стандарта, полученного аналогичным образом и одновременно проанализированного. Были зарегистрированы относительное время миграции и относительный процент площади любого электрофоретического пика, который составлял >3× отношение сигнал:шум (S:N). Количественная оценка высоты пиков между 3× и 10× отношениями сигнал:шум не проводилась.

% Олиго=(площадь пика/общая площадь пика>3× S:N) × 100%

MALDI-TOF. Обессоленные образцы, содержащие аналит и его метаболиты, были проанализированы на масс-спектрометре Apllied Biosystems MALDI-TOF, снабженном источником замедленной экстракции, азотным лазером, работающим на длине волны 337 нм, и электронно-лучевой трубкой с 1,2-метровой длиной пролета. При этом использовали следующие инструментальные параметры: напряжение 25 кВ; напряжение на сетке, 95,4%; на волноводе, 0,1%; время запаздывания 1200 нсек. В качестве матрицы применяли 3-гидроксипиколиновую кислоту, содержащую диаммонийцитрат. Спектры ODN-образцов подвергали внешней калибровке на том же самом планшете при идентичных условиях с применением серии стандартных ODN с известной молекулярной массой.

Результаты, полученные за 48 часов, представлены на фиг.20. На фиг.20 показано, что в почках уровни полумягкого SEQ ID NO:241 и мягкого ODN SEQ ID NO:294 были гораздо ниже (на 93% и 87% соответственно), чем уровни полностью фосфортиоатного олигонуклеотида SEQ ID NO:242.

Пример 17

Олигонуклеотиды С обладают иммуностимулирующей активностью in vitro.

Были получены полумягкие олигонуклеотиды С-класса с фосфодиэфирными связями в 5'-непалиндромной области (ODN SEQ ID NO:225), в 3'-палиндромной области (ODN SEQ ID NO:251) и в обеих 5'-непалиндромной и 3'-палиндромной областях (ODN SEQ ID NO:295). Кроме того, был получен ODN SEQ ID NO:252 с такими же связями, как и в ODN SEQ ID NO:295, но с 2'-О-Ме-рибозными сахарами в нуклеотидах, составляющих 3'-палиндромную часть (в приведенной ниже последовательности, подчеркнута). Затем эти олигонуклеотиды оценивали с применением анализа на TLR9, описанного выше.

Олигонуклеотиды С-класса с полностью стабилизированными основными цепями обычно обладают относительно низкой TLR9-активностью по сравнению с олигонуклеотидами В-класса. Как показано ниже в таблице 10, включение полумягкой последовательности именно в 5'-непалиндромную область (ODN SEQ ID NO:255) приводило к значительному увеличению TLR9-активности по сравнению с включением полумягкой последовательности именно в 3'-палиндромную область (ODN SEQ ID NO:251). Включение полумягкой последовательности в обе - 5'-непалиндромную область и в 3'-палиндромную область (ODN SEQ ID NO:295) приводило к усилению TLR9-активности по сравнению с включением полумягкой последовательности только в 3'-палиндромную область (ODN SEQ ID NO:251).

Таблица 10

TLR9-стимуляция полумягкими олигонуклеотидами С-класса

Полумягкие олигонуклеотиды С-класса не только сохраняют свою способность индуцировать IFN-α человеческими МКПК, но они также обладают гораздо большей активностью при низких концентрациях. Повышенная активность была наиболее явно выражена у тех олигонуклеотидов С-класса, которые включали полумягкую последовательность в 5'-непалиндромной области (ODN SEQ ID NO:255 и ODN SEQ ID NO:295). ODN SEQ ID NO:255, ODN SEQ ID NO:251 и ODN SEQ ID NO:295 анализировали с помощью ELISA и сравнивали с SEQ ID NO:242, то есть полностью стабилизированной формой этих трех полумягких олигонуклеотидов, а также с олигонуклеотидом С-класса, являющимся сильным индуктором IFN-α. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11

Индукция IFN-α (пг/мл) полумягкими вариантами олигонуклеотида С-класса

Пример 18

Физико-химические характеристики SEQ ID NO:313

Методы:

Порошковая рентгеновская дифрактометрическая картина, полученная для SEQ ID NO:313, обнаруживала гало, характерное для аморфной фазы. Анализ на поглощение паров воды показал, что SEQ ID NO:313 является в высокой степени гигроскопичным. Тенденция лекарственного средства к изменению влажности может приводит к колебаниям количества влаги в зависимости от влажности окружающей среды. Указанное соединение обладает высокой водорастворимостью (>100 мг/мл), а поэтому имеет адекватную растворимость при всех используемых интервалах рН. Анализ водных растворов лекарственного средства, проводимый при повышенной температуре, показал, что они быстро разлагаются в слабокислотной и кислотной среде, тогда как растворы, забуференные до значения рН, превышающего 6, имели адекватную стабильность в растворе.

Результаты:

Было установлено, что SEQ ID NO:313 по своей природе является аморфным и в высокой степени гигроскопичным. Указанное соединение обладает высокой водорастворимостью (>100 мг/мл), а поэтому имеет адекватную растворимость при всех используемых интервалах рН. Этот ODN быстро разлагается в слабокислотной и кислотной среде. Растворы, забуференные до значения рН, превышающего 6, имели адекватную стабильность в растворе.

Пример 19

Стимуляция TLR9-трансфицированных клеток in vitro

Методы:

Клетки НЕК 293, трансфицированные человеческим TLR9, инкубировали с SEQ ID NO:313 или SEQ ID NO:329 в течение 16 часов. Уровень сигнала определяли путем считывания данных для лициферазы.

Результаты:

По сравнению с SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:313 был более сильным стимулятором рецептора-мишени TLR9.

Пример 20

Стимуляция человеческих иммунных клеток in vitro

Методы:

Мононуклеарные клетки периферической крови человека, взятые у 6 доноров, инкубировали с SEQ ID NO:313 или с SEQ ID NO:329 в течение 24 или 48 часов. Затем измеряли секрецию цитокинов.

Результаты:

Результаты представлены на фиг.23. По сравнению с SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:313 обнаруживал повышенную или, по крайней мере, аналогичную эффективность и/или активность как индуктор TLR9-ассоциированных цитокинов IL-6, IL-10, IFNα и IP-10.

Пример 21

Стимуляция мышиных спленоцитов in vitro

Методы:

Мышиные (BALB/c) спленоциты инкубировали с SEQ ID NO:313 или с SEQ ID NO:329 в течение 48 часов. Затем измеряли секрецию цитокинов и IP-10.

Результаты:

По сравнению с SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:313 обнаруживал повышенную или, по крайней мере, аналогичную эффективность и/или активность как индуктор цитокинов IL-6, IL-10, IL-12р40, IFNα, TNFα и IP-10. Данные представлены на фиг.24. Эти данные продемонстрировали, что активность SEQ ID NO:13 по отношению к мышиным иммунным клеткам сравнима с его активностью по отношению к человеческим клеткам (см. выше) и также коррелирует с активацией посредством TLR9.

Пример 22

Индукция гена цитокина у мышей in vivo

Методы:

В этом исследовании оценивали экспрессию цитокинов в легких мышей после введения в дыхательные пути дозы SEQ ID NO:313. Для исследования их воздействия на почки также оценивали индукцию тех же самых цитокинов (как описано в примерах 10 и 21) в этом органе. Мышам (самцам BALB/c) вводили дозу SEQ ID NO:313 или SEQ ID NO:329 (каждого по 1 мг/кг) либо путем интраназальной инстилляции, либо путем введения внутривенной ударной дозы. Через 8 или 15 часов после введения дозы легкие и почки удаляли. Затем экстрагировали РНК, которую подвергали обратной транскрипции в кДНК. Нужные фрагменты кДНК амплифицировали и детектировали с помощью ПЦР в реальном времени (термоячейка Roche LightCycler, метод детекции с применением SYBR Green (в зеленом диапазоне спектра)). Праймеры для GAPDH, IFN-гамма, IL-6, IP-10 и TNF-альфа конструировали с применением программы LC PROBE DESIGN от Roche (Version 1.0 Roche catalog № 3139174). Праймеры для IFN-альфа конструировали с применением программы PRIMER 3. Выход продукта нормализовали как отношение к экспрессии контрольного гена (GAPDH).

Результаты:

После введения дозы олигонуклеотида SEQ ID NO:313 в дыхательные пути он индуцировал экспрессию TLR9-ассоциированных генов (IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ и IP-10) в легких. Результаты приводятся на фиг.25. Однако за исключением IP-10 эти гены не экспрессировались в почках мышей, которым были введены дозы таким способом. Поскольку IP-10 обычно индуцируется интерферонами, то экспрессия этого хемокина может происходить опосредованно в результате секреции интерферонов в кровоток, системно циркулирующих из легких. Если SEQ ID NO:313 вводили внутривенно, то каждый из этих генов за исключением гена IFN-γ индуцировался в почках. Поэтому отсутствие влияния SEQ ID NO:313 на почки после его введения в дыхательные пути, вероятно, обусловлено его низким системным действием.

CpG-ODN могут оказывать воздействие на почки посредством ряда механизмов. Острое почечное грануломатозное воспаление, вызываемое TLR9-зависимым механизмом, наблюдалось после системного воздействия некоторых CpG-ODN. Полученные авторами результаты дают основание предположить, что системное действие SEQ ID NO:313, вводимого в дыхательные пути, является недостаточным для непосредственного индуцирования TLR9-ассоциированных генов в почках.

Пример 23

Влияние на индуцированное антигеном развитие лимфоузлов у мышей in vivo

Методы:

В этом исследовании оценивали способность SEQ ID NO:313 индуцировать отклонение иммунного ответа от ответа Th2-типа в дренирующих лимфоузлах у мышей. Мышей (самцов BALB/c) сенсибилизировали путем инъекции антигена (овальбумина, 100 мкг) в полном адъюванте Фрейнда в правую заднюю подушечку лапы. Мышам в ту же самую подушечку лапы одновременно инъецировали SEQ ID NO:313 или SEQ ID NO:329 (1,5 мг/кг) или носитель (физиологический раствор). Через шесть дней после инъекции в подушечку лапы дренирующий подколенный лимфоузел удаляли. Т-клетки (CD3⁺) и В-клетки (В220⁺) подсчитывали с помощью проточной цитометрии. Ех vivo анализ вторичного иммунного ответа на антиген осуществляли следующим образом: 1×10⁶ клеток (из дренирующего подколенного лимфоузла) инкубировали в 220 мкл среды RPMI 1640 + 10% фетальная бычья сыворотка, содержащей либо овальбумин (100 мкг/мл), либо разбавитель. Через 36 часов культуральную среду удаляли, и концентрации IL-бета, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12р70, GM-CSF, IFN-гамма и TNF-альфа измеряли с применением набора от LINCO Research, Inc. 14 Research Park Drive, St Charles, Missouri 63304, и анализировали на мультиплексной системе Luminex (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).

Результаты:

Число клеток в подколенных лимфоузлах: Сенсибилизация приводила к аккумуляции Т-клеток и В-клеток в дренирующих подколенных лимфоузлах. У мышей, которым вводили CpG-ODN, в основном не наблюдалось дальнейшего увеличения антиген-индуцированной аккумуляции. Однако каждый CpG-ODN, который был отдельно инъецирован несенсибилизированной мыши, не вызывал аккумуляции как Т-клеток, так и В-клеток. Данные приводятся на фиг.26.

Анализ на вторичный иммунный ответ. Клетки дренирующего лимфоузла, взятые у сенсибилизированных антигеном мышей, секретировали IL-4, IL-5, IL-10 и IFN-γ при их повторной стимуляции антигеном ex vivo. У сенсибилизированных мышей, которым также вводили CpG-ODN, уровни секреции цитокинов Th2-типа, а именно IL-4, IL-5 и IL-10, снижались, а уровни секреции цитокина Th1-типа, IFN-γ увеличивались. Полученные авторами данные, представленные на фиг.27, подтвердили гипотезу, утверждающую, что SEQ ID NO:313, так же как и SEQ ID NO:329, подавляет Th2-ответ на сенсибилизацию антигеном. Результаты представлены как среднее ± ср.кв.от. (n=9-10). *Р<0,05 по сравнению с группой сенсибилизированных и обработанных носителем мышей (критерий множественного сравнения Крускала-Уоллиса).

Пример 24

Влияние на антиген-индуцированное продуцирование IgE у мышей in vivo

Методы:

Мышей (самцов BALB/c) в дни 0-7 проведения исследования сенсибилизировали антигеном (овальбумином, 10 мкг, i.p.) с адъювантом (гидроксидом алюминия). За два дня до каждой сенсибилизации и в день каждой сенсибилизации мышам вводили SEQ ID NO:313 (0,15 или 1,5 мг/кг, i.p.) или SEQ ID NO:17 (1,5 мг/кг, i.p.). На 18-й день исследования брали сыворотку. Титры антиген (овальбумин)-специфических IgE и IgG2а измеряли с помощью ELISA. Краткое описание протокола приводится в таблице 12.

Таблица 12 Краткое описание протокола исследований
Сенсибилизация	Сенсибилизация
	ODN	ODN		ODN	ODN
День:	-2	0		5	7		18
							конечная точка

Результаты:

У мышей, обработанных SEQ ID NO:313 или SEQ ID NO:329, продуцирование антиген-специфического IgE полностью предотвращалось. В противоположность этому продуцирование IgG2а увеличивалось. Поскольку продуцирование IgE и IgG2а представляет собой характерные ответы Th2-типа и Th1-типа соответственно, то этот эффект является дополнительным свидетельством того, что SEQ ID NO:313 может ингибировать ответы Th2-типа на сенсибилизацию антигеном. Альтернативно CpG-ODN могут непосредственно индуцировать экспрессию Т-бета и переключение класса IgE в В-клетках на другой класс. Данные представлены на фиг.28. Результаты представлены как среднее ± ср.кв.от. (n=10-12 за исключением того, что для группы SEQ ID NO:329, n=5). *Р<0,05 по сравнению с группой сенсибилизированных обработанных носителем мышей (критерий множественного сравнения Крускала-Уоллиса).

Пример 25

Влияние на антиген-индуцированое воспаление дыхательных путей у мышей in vivo

Методы:

Мышей (самцов BALB/c) в дни 0-7 проведения исследования сенсибилизировали антигеном (овальбумином, 10 мкг, i.p.) с адъювантом (гидроксидом алюминия). Два раза в неделю в течение двух последующих недель мышей подвергали антигенной стимуляции путем их обработки овальбуминсодержащим аэрозолем. Первую стимуляцию проводили на 21-й день исследования. SEQ ID NO:313 (0,1-1000 мкг/кг), SEQ ID NO:329 (1-1000 мкг/кг) или носитель (физиологический раствор, 20 мкл) вводили путем интраназальной инстилляции в дыхательные пути один раз в неделю за два дня до первой еженедельной антигенной стимуляции. Конечные точки определяли через 48 часов после последней антигенной стимуляции. Клетки дыхательных путей выделяли с помощью бронхоальвеолярного лаважа и проводили дифференциальный подсчет клеток. Число эозинофилов (объемная плотность эозинофилов) и секрецию слизи (PAS-окрашивание) в ткани легких определяли с помощью гистопатологического анализа. Протокол представлен в таблице 13.

Таблица 13 Краткое описание протокола исследований
Сенсибилизация	Стимуляция	Стимуляция
			ODN			ODN
День:	0	7	19	21	24	26	28	31	33
								конечные точки

Результаты:

Антигенная стимуляция приводила к увеличению общего числа лейкоцитов, а преимущественно эозинофилов в просвете дыхательных путей. Данные представлены на Фиг.29. Эозинофилия значительно подавлялась в зависимости от вводимой дозы SEQ ID NO:313 или SEQ ID NO:329. Величины ED₅₀, необходимые для подавления эозинофилии, составляли: SEQ ID NO:313: 23 мкг/кг; SEQ ID NO:329: 47 мкг/кг. Стимуляция также приводила к аккумуляции CD4⁺-T-клеток (CD3⁺, CD4⁺-клеток), которая значительно подавлялась олигонуклеотидом SEQ ID NO:313. Олигонуклеотид SEQ ID NO:313 также значительно ингибировал антиген-индуцированную аккумуляцию эозинофилов в ткани легких и секрецию эпителиальной слизи. Результаты на фиг.29 представлены как среднее ± ср.кв.от. (n=15). *Р<0,05 по сравнению с группой стимулированных антигеном и обработанных носителем мышей (критерий множественного сравнения Крускала-Уоллиса). Результаты на фиг.30 представлены как среднее ± ср.кв.от. (n=6). *Р<0,05, **Р<0,001 по сравнению с группой стимулированных антигеном и обработанных носителем мышей (ANOVA, критерий множественного сравнения Даннета).

Пример 26

Влияние на антиген-индуцированную гиперактивность дыхательных путей у мышей in vivo

Методы:

Мышей (самцов BALB/c) в дни 0-7 проведения исследования сенсибилизировали антигеном (овальбумином, 10 мкг, i.p.) с адъювантом (гидроксидом алюминия). Два раза в неделю в течение двух последующих недель мышей подвергали антигенной стимуляции путем их обработки овальбумин-содержащим аэрозолем. Первую стимуляцию осуществляли на 19-й день исследования. SEQ ID NO:313 (10-1000 мкг/кг) или носитель (физиологический раствор, 20 мкл) интраназально вводили в дыхательные пути один раз в неделю за два дня до первой еженедельной антигенной стимуляции. Гиперактивность дыхательных путей анализировали через 24 часа после последней антигенной стимуляции путем оценки бронхостеноза (увеличение резистентности дыхательных путей) в ответ на внутривенное введение метахолина. Для каждого животного строили кривую зависимости от дозы метахолина и реактивность дыхательных путей количественно оценивали как площадь под кривой. Протокол представлен в таблице 14.

Таблица 14 Краткое описание протокола исследований
Сенсибилизация	Стимуляция	Стимуляция
			ODN			ODN
День:	0	7	17	19	22	24	26	29	30
								конечные точки

Результаты:

Антигенная стимуляция приводила к гиперактивности дыхательных путей. SEQ ID NO:313 ингибировал развитие индуцированной антигеном гиперактивности дыхательных путей в зависимости от вводимой дозы. Данные представлены на фиг. 31 и 32 в виде кривых дозозависимого ответа образца на введение метахолина, которые иллюстрируют эффект SEQ ID NO:313 (1000 мкг/кг). Дозозависимые кривые ответа на введение метахолина количественно оценивали как площадь под кривой. Результаты представлены как среднее ± ср.кв.от. (n=6-8). *Р<0,05 по сравнению с группой стимулированных антигеном и обработанных носителем мышей (критерий множественного сравнения Крускала-Уоллиса).

Анализ кривых "максимальная доза-ответ" (RL), проводимый путем сравнения мышей, стимулированных антигеном и обработанных носителем, и каждой из соответствующих мышей, стимулированных антигеном и обработанных SEQ ID NO:313, осуществляли с применением многократных измерений в анализе MANOVA. Между кривыми дозозависимого ответа для групп, обработанных 100 и 1000 мкг/кг SEQ ID NO:313, наблюдалось значимое отличие (Р<0,05), при этом у групп мышей, стимулированных антигеном и обработанных носителем, и животных, аналогичным образом обработанных дозой 10 мкг/кг SEQ ID NO:313, какого-либо значимого отличия не наблюдалось.

Пример 27

Фармакокинетические исследования (ФК) на крысах in vivo

Фармакокинетические (ФК) исследования проводили на крысах для того, чтобы определить, выводится ли SEQ ID NO:313 ("полумягкий" ODN) из плазмы и тканей, а в частности из почек, быстрее, чем SEQ ID NO:329 (полностью фосфортиоатный ODN), имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:313.

Методы:

56 крысам внутривенно (i.v.) и интратекально (i.t.) вводили 5 мкг/кг (как i.v., так и i.t.) SEQ ID NO:313 и SEQ ID NO:329. Затем брали образцы плазмы, легких и почек. Исследование продолжалось 5 дней, при этом снимали 14 показаний в определенные моменты времени для каждой группы, которой вводилась доза. Для этого использовали 3 крысы/момент времени для i.v.-группы (всего - 42 крысы) и 4 крысы/момент времени для i.t.-группы.

Результаты:

На фиг.33 показаны концентрации ODN в плазме крыс после i.v.- и i.t.-введения при дозе 5 мг/кг. Данные, полученные для плазмы, показали, что SEQ ID NO:313 выводится из плазмы быстрее, чем SEQ ID NO:329 после i.v.- и i.t.-введения.

На фиг.34 показаны концентрации ODN в легких крыс после i.v.- и i.t.-введения при дозе 5 мг/кг. После i.v.-введения в той же самой дозе концентрации SEQ ID NO:313 в легких были ниже, чем концентрации SEQ ID NO:329. После i.t.-введения различие было менее заметным. Данные, полученные после введения SEQ ID NO:329 в легкие, могли быть получены только в течение 48-часов после введения дозы.

На фиг.35 показаны концентрации ODN в почках крыс после i.v.- и i.t.-введения дозы 5 мг/кг. Данные для почек показали, что абсолютные уровни SEQ ID NO:313 в почках были ниже, чем соответствующие концентрации SEQ ID NO:329 после i.v.- и i.t.-введения. Действие SEQ ID NO:313 на почки после i.t.-введения, в частности, было значительно ниже, чем действие SEQ ID NO:329 в той же самой дозе. Это более ясно видно на фиг. 36 и 37.

На фиг.36 показаны концентрации ODN в почках крыс после i.v.-введения дозы 5 мг/кг. На фиг.37 показаны концентрации ODN в почках крыс после i.t.-введения дозы 5 мг/кг. После i.t.-введения уровни SEQ ID NO:313 и SEQ ID NO:329 были ниже нижнего предела количественного интервала (0,4-0,6 мкг/г) в почках в течение 1 часа после введения дозы. Через 1 час SEQ ID NO:329 мог быть детектирован во всех образцах почек, взятых во время исследования (48 часов). С другой стороны, SEQ ID NO:313 присутствовал лишь на детектируемых уровнях в течение 7 часов после введения дозы.

Таблица 15 Систематизированные данные средних величин ФК-параметров для SEQ ID NO:313 и SEQ ID NO:329 после i.v.- и i.t.-введения крысам дозы 5 мг/кг
Дозовая группа	Ткань	ODN	Смакс (мкг/мл)	Тмакс (час)	Т1/2 (час)	AUC0-INF (ч·мкг/мл)	AUC0-48ч* (ч·мкг/мл)
i.v. (5 мг/кг)	Плазма	10	na	na	020	9,5	9,3
	17	na	na	0,62	62,8	62,2
	Легкие	10	1,4	0,25	0,17	0,47	0,35
17	14,4	0,083	2,5	23,7	20,8
	Почки	10	6,6	0,083	24,9	184	123
17	11,4	0,083	nc	nc	346
i.t. (5 мг/кг)	Плазма	10	1,9	0,75	1,20	2,68	2,35
17	2,1	2	2,3	9,01	7,46
	Легкие	10	632	0,25	28,1	5540	5350
17	692	1	(31)**	(7908)**	6505
	Почки	10	0,49	2	7,8	5,81	2,34
17	3,8	7	nc	nc	134
na - не могли быть определены nc - не вычисляли. Не могли быть оценены точно из-за недостатка экспериментальных данных в конечной фазе либо из-за того, что в этот период исследования не была достигнута конечная фаза элиминации. * - AUC0-48ч или AUC0-LAST при последней измеряемой концентрации за период до 48 ч. ** - Очень приблизительная оценка (полученная только по 2 экспериментальным точкам в конечной фазе) 10 - SEQ ID NO:313 17 - SEQ ID NO:329.

Таблицы 16(а)-(с) Системное действие и действие на ткани SEQ ID NO:313 и SEQ ID NO:329 после их i.t. и i.v.-введения крысам в дозе 5 мг/кг
(а) Данные для плазмы
ODN	Способ введения дозы	AUC0-48ч (ч·мкг/мл)	Отношение SEQ ID NO:313:SEQ ID NO:329
SEQ ID NO:313	i.t.	2,35	0,32 (i.t.)
	i.v.	9,30	0,15 (i.v.)
	Отношение i.t.:i.v.	0,25
SEQ ID NO:329	i.t.	7,46
	i.v.	62,2
	Отношение i.t.:i.v.	0,12
(b) Данные для легких
ODN	Способ введения дозы	AUC0-48ч (ч·мкг/мл)	Отношение SEQ ID NO:313:SEQ ID NO:329
SEQ ID NO:313	i.t.	5350	0,82 (i.t.)
	i.v.	0,35	0,017 (i.v.)
	Отношение i.t.:i.v.	15286
SEQ ID NO:329	i.t.	6505
	i.v.	21
	Отношение i.t.:i.v.	313
(с) Данные для почек
ODN	Способ введения дозы	AUC0-48ч (ч·мкг/мл)	Отношение SEQ ID NO:313:SEQ ID NO:329
SEQ ID NO:313	i.t.	2,34	0,017 (i.t.)
	i.v.	123	0,36 (i.v.)
	Отношение i.t.:i.v.	0,019
SEQ ID NO:329	i.t.	134
	i.v.	346
	Отношение i.t.:i.v.	0,39

Было обнаружено, что системное действие и действие на почки SEQ ID NO:313 после введения 2 ODN либо внутривенно (i.v.) либо интратрехеально (i.t.) было значительно ниже, чем действие SEQ ID NO:329.

AUC для SEQ ID NO:313 в плазме после i.t.-введения в дозе 5 мг/кг составляла 2,7 ч·мкг/мл. Соответствующая величина для SEQ ID NO:329 составляла 9,0 ч·мкг/мл. Таким образом, системное действие SEQ ID NO:313 составляло одну треть от действия SEQ ID NO:329.

AUC для SEQ ID NO:313 в почках после i.t.-введения в дозе 5 мг/кг составляла 2,35 ч·мкг/мл. Соответствующая величина для SEQ ID NO:329 составляла 134 ч·мкг/мл. Таким образом, при тех же самых дозах системное действие SEQ ID NO:313 составляло примерно лишь 2% от действия SEQ ID NO:329.

В отличие от плазмы и почек действие SEQ ID NO:313 на легкие после i.t.-введения значительно не снижалось по сравнению с действием SEQ ID NO:329. AUC для SEQ ID NO:313 в легких составляла примерно 70-80% по сравнению с AUC для SEQ ID NO:329 в легких при той же самой дозе. Поскольку легкие являются тканью-мишенью, то предпочтительно, чтобы уровень выведения ODN из легких не превышал уровень выведения ODN из плазмы и почек.

На фиг.38 показаны концентрации SEQ ID NO:313 и его 8-мерного метаболита(ов) в почках крысы после i.v.-введения SEQ ID NO:313 в дозе 5 мг/кг.

На фиг.39 показаны концентрации SEQ ID NO:313 и его 8-мерного метаболита(ов) в почках крысы после i.t.-введения SEQ ID NO:313 в дозе 5 мг/кг. Из-за методологических проблем данные для 8-мерного метаболита SEQ ID NO:313 в плазме и тканях являются неполными. Однако данные для 8-мера были получены для некоторых i.v.-образцов и всех i.t.-образцов почек. Эти данные показали, что в большинстве образцов почек, где концентрации 8-мера были успешно измерены, уровни этого метаболита превышали уровни SEQ ID NO:313, что свидетельствовало о том, что эндонуклеазная активность представляет собой важный путь метаболизма для SEQ ID NO:313.

Введение ряда фосфодиэфирных связей (SEQ ID NO:313) в полностью фосфортиоатную основную цепь (SEQ ID NO:329), очевидно, приводит к увеличению скорости деградации ODN и тем самым к его более быстрому выведению, особенно из почек.

Пример 28

Активация TLR9 с применением полумягкого ODN по сравнению с полностью фосфортиоатным ODN

Методы:

Стабильно трансфицированные клетки НЕК293, экспрессирующие TLR9, были описаны ранее [Bauer et al., PNAS; 2001]. Короче говоря, клетки НЕК293 трансфицировали путем электропорации векторами, экспрессирующими человеческий TLR9, и репортерной плазмидой, содержащей 6×NF-kB-люциферазу. Стабильные трансфектанты (3× 10⁴ клеток/лунку) инкубировали с ODN в течение 16 ч при 37°С в инкубаторе с повышенной влажностью. Каждую экспериментальную точку определяли с тремя повторениями. Клетки подвергали лизису и анализировали на активность гена люциферазы (с применением набора Brightlite, Perkin-Elmer, Ueberlingen, Germany). Индексы стимуляции вычисляли по отношению к активности гена-репортера в среде без добавления ODN.

Результаты:

TLR9 легко активируется под действием ODN, содержащих оптимальные иммуностимулирующие CpG-последовательности. Авторы инкубировали клеточную линию, стабильно экспрессирующую человеческий TLR9, с различными полумягкими ODN и с различными полностью фосфортиоатными ODN, имеющими такую же последовательность ODN, как и полумягкие ODN. Результаты показаны на фиг.40.

Эти результаты продемонстрировали, что каждый из полумягких ODN, указанный в нижеследующей таблице, SEQ ID NO: 376, 378, 380, 382, 384, 241 активировал более высокие уровни TLR9, чем та же самая последовательность ODN, имеющая полностью фосфортиоатную основную цепь, SEQ ID NO:377, 379, 381, 383, 385 и 242 соответственно.

Пример 29

Межнуклеотидные Rp-связи в качестве фосфодиэфироподобных связей в полумягких олигонуклеотидах

Методы:

Условия культивирования клеток и реагенты

Для проведения анализов на пролиферацию В-клеток клетки селезенки, взятые у мышей BALB/c (4-18-недельных), культивировали при концентрации 2-5×10⁵-10⁶ клеток/мл в RPMI в течение 44 ч в 96-луночных микротитрационных планшетах, а затем обрабатывали 1 мкКи ³Н-тимидина в течение 4-6 ч, после чего клетки собирали и определяли число импульсов в минуту на сцинтилляционном счетчике, как было описано ранее (Krieg et al., 1995). Для получения Вестерн-блотов, клетки WEHI-231 (Американская коллекция типовых культур, Rockville, MD) культивировали при 37°С в инкубаторе с повышенной влажностью в 5% СО₂, и поддерживали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), в которую были добавлены 10% термоинактивированная FCS (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 1,5 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-МЕ, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Олигонуклеотиды

Олигодезоксинуклеотиды (РО-Oligos) и стеро-рандомизированные олиго(дезоксинуклеозид)фосфортиоаты, [Mix-PS]-Oligos, закупали у Operon Technologies (Alameda, CA) или получали стандартным фосфоамидитным методом (Caruthers, 1985) (Stec et al., 1984). Олигонуклеотид [Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT)([Mix-PS]-SEQ ID NO:386) применяли в качестве позитивного контроля, поскольку, как было обнаружено ранее, он обладает сильным иммуностимулирующим действием на мышиные клетки (Yi et al., 1996). Для CpG-PS-Oligo с минимальным стимулирующим мотивом, последовательность PS-d(TCAACGTT)-2066 была выбрана для исследований в качестве типичного мотива CpG с иммуностимулирующими эффектами широкого спектра, характерными для большого семейства CpG-ДНК. Эта последовательность была названа [Mix-PS]-2006, если она имела стерео-рандомизированную основную цепь. В случае если эта октамерная последовательность имела полностью или частично стерео-основную цепь, то PS-Oligo обозначали либо [All-Rp-PS]-2066, либо [All-Sp-PS]-2066, если вся основная цепь представляла собой стерео-основную цепь, либо [CG-Rp-PS]-2066, либо [CG-Sp-PS]-2066, если стерео-основная цепь имела только динуклеотид CpG. Другими используемыми PS-Oligos являются CpG-PS-d(TCAACGTTGA)([Mix-PS]-SEQ ID NO:387 и его A11-Rp- и All-Sp-стерео-аналоги, и контрольный не-CpG PS-d(TCAAGCTTGA)(Mix-PS]-SEQ ID NO:388.

Фосфортиоатные стерео-олигодезоксинуклеотиды были получены оксатиофосфолановым методом, описанным ранее (Stec et al., 1995) (Stec et al., 1998). Синтез осуществляли вручную. Первые нуклеозидные звенья от 3'-конца иммобилизовали на твердом носителе посредством DBU-резистентного саркозинильного линкера (Brown et al., 1989). Соответствующим образом защищенные дезоксинуклеозидильные мономеры, имеющие 3'-О-2-тио-"спиро"-4,4-пентаметилен-1,3,2-оксатиофосфолановую группу, синтезировали и подвергали хроматографическому разделению на чистые Р-диастереомеры. Для синтеза [CG-Rp-PS]-2066 и [CG-Sp-PS]-2066 неразделенные смеси обоих Р-диастереомеров (в отношении Rp:Sp приблизительно 1:1) (Stec et al., 1998) применяли для сборки межнуклеотидных связей в рандомизированной конфигурации атомов Р. Все синтезированные олигомеры очищали двухстадийной ОФ-ВЭЖХ: DMT-on (время удерживания в пределах 23-24 минут) и DMT-off (время удерживания 14-16 минут); хроматографическая система: колонка ODS Hypersil, 5 мкм, 240×4,6 мм, 0-40% СН₃CN в 0,1М бикарбонате триэтиламмония, рН 7,5, градиент 1%/мин. Чистоту этих олигомеров оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Для исследования уровня поглощения PS-Oligo конъюгированные с флуоресцеином стереорегулярные PS-Oligos получали методом твердофазного удлинения синтезированных вручную стерео-PS-олигомеров. После проведения стадии детритилирования добавляли флуоресцеин-фосфорамидит (ChemGenes Corporation, Ashland, MA; рабочая концентрация 125 мг/мл) и 1Н-тетразол (время связывания-120 с) традиционным способом, а затем проводили сульфирование реактивом S-Tetra (Stec et al., 1993). Отщепление от носителя и снятие защиты проводили с применением концентрированного гидроксида аммония в течение 1 часа при комнатной температуре и в течение 4 часов при 55°С соответственно. Полученные олигомеры очищали путем проведения одностадийной ОФ-ВЭЖХ (см.выше). Из-за повышенной гидрофобности флуоресцеиновой части Rp- и Sp-олигомер элюировался со временем удерживания 14,5, 14,8, 14,7 и 15,0 мин соответственно, т.е. у конца присоединенных последовательностей. В обоих случаях два Р-диастереомера элюировались благодаря нестереоспецифичности фосфорамидитного метода/метода удлинения флуоресцеинового мономера путем сульфирования.

Вестерн-блот-анализ

Клетки собирали и ресуспендировали в свежей среде при концентрации 2×10⁶ клеток/мл. Затем клетки оставляли на четыре часа до проведения 40-минутной стимуляции. Клетки собирали и три раза промывали холодным PBS. Клетки лизировали в 0,05М Трис (рН 7,4), 0,14М NaCl, 1% NP-40, 0,001М Na₃NO₄, 0,01М NaF, 4,3 мг/мл β-глицерофосфата, 0,002М DTT, 50 мкг/мл PMSF, 12,5 мкг/мл антипаина, 12,5 мкг/мл апротинина, 12,5 мкг/мл лейпептина, 1,25 мкг/мл пепстатина, 19 мкг/мл бестатина, 10 мкг/мл фосфорамидона, 12,5 мкг/мл ингибитора трипсина путем замораживания и оттаивания с последующим 30-минутным инкубированием на льду. Затем образцы центрифугировали при 10000×g в течение 10 минут при 4°С. Супернатант хранили в виде целых клеточных лизатов для дальнейшего анализа. Равные количества целых клеточных лизатов (20 мкг) кипятили в ДСН-буфере для образца в течение 5 минут, а затем подвергали электрофорезу в денатурирующем 11% полиакриламидном геле. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны методом полусухого блоттинга (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Блоты блокировали 5% обезжиренным молоком, а затем гибридизовали с фосфо-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), IkB-α и JNK1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Блоты визуализировали с применением реагентов с повышенной хемилюминесценцией (ЭХЛ, Amersham International) в соответствии с протоколом производителя.

Результаты:

Индуцирование Sp-стереоизомером CpG PS-Oligos включения ³Н-тимидина в клетки селезенки. Для определения стерео-специфичности иммуностимулирующих эффектов CpG-ДНК клетки селезенки BALB/c культивировали со стерео-октануклеотидами PS-d(TCAACGTT)-2066, в которых все межнуклеотидные связи имели либо Rp-, либо Sp-конфигурацию в концентрациях, указанных в таблице 17. Клетки культивировали в течение 48 часов, и это время было достаточным для индуцирования пролиферации В-клеток CpG-мотивами (Krieg et al., 1995). Стеро-рандомизированный [Mix-PS]-2066, имеющий CpG-мотив, индуцировал сильную пролиферацию клеток селезенки в зависимости от дозы (таблица 17). Sp-изомер также индуцировал пролиферацию клеток, и он обладал чуть более сильной активностью, чем [Mix-PS]-2066. В противоположность этому Rp-стереоизомер не индуцировал какой-либо детектируемой пролиферации, что совпадало с данными, полученными Yu et al. (Yu et al., 2000).

Таблица 17 Индуцирование пролиферации клеток селезенки Sp-стереоизомером CpG-октамеров
Олиго	Концентрация	имп./мин	SI
Отсутствует (среда)		2170	1
2066(стерео-рандоминизированный CpG)	0,4 мкМ	3154	1,5
"	2,4 мкМ	16525	7,6
"	4,8 мкМ	30811	14,2
Rp(2066)	0,4 мкМ	1207	0,6
"	2,4 мкМ	985	0,5
"	4,8 мкМ	640	0,3
Sp(2066)	0,4 мкМ	9567	4,4
"	2,4 мкМ	35372	16,3
"	4,8 мкМ	45591	20,1
Rp(2066)+10661	0,4 мкМ	1597	0,7
"	2,4 мкМ	10255	4,7
"	4,8 мкМ	15841	7,3
SI = индекс стимуляции по сравнению с контролем (среда) 1 каждый из двух PS-Oligos добавляли в указанной концентрации в начале культивирования

Предварительные исследования авторов настоящего изобретения продемонстрировали, что декамер CpG-PS-Oligos обладал улучшенным иммуностимулирующим действием по сравнению с октамерами, используемыми в первом эксперименте. Поэтому эти эксперименты проводили повторно с применением конструкции PS-SEQ ID NO:387, которая была синтезирована либо как стерео-рандомизированный [Mix-PS]-SEQ ID NO:387, либо в форме (All-Rp), либо в форме (All-Sp). И снова, как [Mix-PS]-SEQ ID NO:387, так и [All-Sp-PS]-SEQ ID NO:387 значительно индуцировали включение ³Н-тимидина в зависимости от дозы. Однако в этом случае [All-Rp-PS]-SEQ ID NO:387 также индуцировал значительное увеличение пролиферации клеток при самых высоких концентрациях, что указывало на то, что он обладал, по крайней мере, частичной стимулирующей активностью.

Предпочтительность Rp-хиральности у динуклеотида CpG в октамерных PS-Oligos.

Пока остается неясным, является ли предпочтительность Sp-стереоизомера в предварительных экспериментах результатом эффекта, продуцируемого в самом CG-динуклеотиде, либо этот эффект может иметь место за пределами CG. Для того чтобы это определить, были синтезированы два октамера PS-2066, которые имеют стерео-рандомизированную основную цепь за исключением связи между центральным CG, которые были определены как Sp- или Rp. В этом эксперименте неожиданно были получены результаты, противоположные результатам, полученным с применением PS-Oligos, в которых вся основная цепь была стереорегулярной, так как [CG-Rp-PS]-2066 индуцировал такое же сильное увеличение уровня включения ³Н-тимидина в клетки селезенки, как и контрольный стерео-рандомизированный PS-Oligo. В противоположность этому PS-Oligo [CG-Rp-PS]-2066 был в основном неактивным.

Ингибирование включения ³Н-тимидина в клетки селезенки R-стереоизомером CpG PS-Oligos.

Уровень включения ³Н-тимидина в лунках, обработанных Rp-стереоизомером, был ниже, чем в контрольных лунках, что дает основание предположить о его возможной ингибирующей активности, хотя оценка этих клеток под микроскопом не выявила какой-либо цитотоксичности. Действительно, если клетки культивировали с эквимолярной смесью [Mix-PS]-2066 и All-Rp-стереоизомера, наблюдалось приблизительно 50%-ное снижение уровня включения ³Н-тимидина по сравнению с клетками, культивированными только с [Mix-PS]-2066 (таблица 17).

Предпочтительная иммунная стимуляция [Rp-PS]-олиго-нуклеотидами на ранних стадиях.

Анализы на включение ³Н-тимидина, проводимые в предыдущих экспериментах, являются уязвимыми в отношении артефакта, возникающего в результате деградации PS-Oligo, при этом высвобождался холодный тимидин, который конкурировал с меченным материалом, что приводило к искусственному подавлению его включения (Matson et al., 1992). Проводимые ранее исследования продемонстрировали, что [Rp-PS]-Oligos являются гораздо более чувствительными к расщеплению нуклеазой, чем Sp-аналоги. Таким образом, возможно, что явное отсутствие стимулирующего эффекта [Rp-PS]-Oligo в анализах авторов на включение ³Н-тимидина могло быть артефактом, приводящим к неправильному выводу, который не отражает истинных эффектов [Rp-PS]-Oligo. Для детекции стимулирующих эффектов [Rp-PS]-Oligo на ранней стадии, то есть перед тем как PS-Oligo мог подвергнуться деградации, авторами в качестве независимого биологического анализа на CpG-индуцированную стимуляцию был проведен анализ на способность этих PS-олигонуклеотидов индуцировать быстрое фосфорилирование регуляторной митоген-активированной протеинкиназы, JNK. Авторами неожиданно было обнаружено, что после обработки CpG-последовательностей PS-SEQ ID NO:386 и PS-SEQ ID NO:387 в течение 40 минут фосфорилирование JNK сильно индуцировалось не [Sp-PS]-изомерами, а стерео-рандомизированными [Mix-PS]- и [Rp-PS]-изомерами. Контрольный не-CpG[Mix-PS]-SEQ ID NO:388 не индуцировал детектируемого фосфорилирования JNK. Все образцы содержали сравнимые количества общего белка JNK.

Хотя в анализе на фосфорилирование JNK не наблюдалось какого-либо эффекта CpG [Sp-PS]-Oligo, однако в этом эксперименте этот олигонуклеотид был биологически активным, поскольку уровень ингибирующего белка и IkB-α снижался под действием всех CpG-PS-Oligos независимо от стереоизомера, но не под действием контрольного не-CpG-PS SEQ ID NO:388.

Стерео-независимое связывание PS-Oligo с клеточной поверхностью и его поглощение.

Одно из возможных объяснений наблюдаемых различий в биоактивности PS-Oligo-стереоизомеров может заключаться в том, что связывание PS-Oligos с клетками или их поглощение клетками является стереозависимым. Для оценки такой возможности были синтезированы Р-стерео-PS-Oligos с флуоресцентными метками, а затем их инкубировали с клетками. PS-Oligos обнаруживали зависимую от концентрации и от температуры картину поглощения клетками, что совпадало с результатами предыдущих исследований. А именно, какого-либо детектируемого различия в связывании или поглощении Rp- или Sp-PS-Oligo не наблюдалось.

Пример 30

Полумягкий олигонуклеотид ODN 316 С-класса и полумягкий олигонуклеотид ODN 313 В-класса способствовали снижению индуцированного антигеном воспаления дыхательных путей in vivo.

В этом исследовании оценивали in vivo эффект ODN 316 на мышиной модели индуцированного антигеном воспаления дыхательных путей. В этом исследовании для сравнения был использован ODN 313 В-класса.

Методы:

Мышей (самцов BALB/c) в дни 0-7 проведения исследования сенсибилизировали антигеном (овальбумином, 10 мкг, i.p.) с адъювантом (гидроксидом алюминия) (Pierce Alum).

Два раза в неделю в течение двух последующих недель мышей подвергали антигенной стимуляции путем их обработки овальбумин-содержащим аэрозолем. Первую стимуляцию проводили на 21 день исследования. Аэрозоль распыляли в течение 1 часа из 1% раствора овальбумина в PBS с применением распылителя DeVilbiss Ultraneb. Отдельных мышей использовали в качестве несенсибилизированного контроля.

За два дня до первой антигенной стимуляции в каждую неделю один раз в неделю в дыхательные пути вводили ODN 316 или ODN 313 (1-100 мкг/кг) или носитель (физиологический раствор, 20 мкл) путем интраназальной инстилляции.

Конечные точки определяли на 33-й день исследования (то есть через 48 часов после последней антигенной стимуляции). Клетки дыхательных путей выделяли с помощью бронхоальвеолярного лаважа. Затем проводили дифференциальный подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток Advia с применением рандомизированных образцов, проверенных путем визуального подсчета клеток на цитоцентрифужных препаратах, окрашенных по Райту-Гимзе. Число CD4⁺-T-клеток (CD3⁺,CD4⁺-клеток) подсчитывали с помощью проточной цитометрии. Результаты были выражены как среднее ± ср.кв.от. для каждой группы. Значимость определяли с применением критерия множественного сравнения Крускала-Уоллиса.

Результаты:

Антигенная стимуляция приводила к увеличению общего числа лейкоцитов в просвете дыхательных путей. Такое увеличение было преимущественно обусловлено аккумуляцией эозинофилов (например, 3×10⁵ эозинофилов/мл у стимулированных антигеном, обработанных носителем мышей, в отличие от нестимулированных мышей, у которых наблюдалось <1×10⁴ эозинофилов/мл). Эозинофилия значительно подавлялась ODN 316 или ODN 313 (например, приблизительно 5×10⁴ эозинофилов/мл (Р<0,05) у стимулированных антигеном мышей, обработанных 100 мкг/мл любого ODN).

Стимуляция антигеном также приводила к аккумуляции CD4⁺-T-клеток, которая значительно подавлялась любым ODN (например, приблизительно 2×10⁴ CD4⁺-Т-клеток/мл у стимулированных антигеном мышей, обработанных 100 мкг/мл любого ODN, и приблизительно 1,3×10⁵ CD4⁺-Т-клеток/мл (Р<0,05), у стимулированных антигеном и обработанных носителем мышей.

Выводы:

Каждый из полумягких олигонуклеотидов ODN 316 С-класса и полумягких олигонуклеотидов ODN 313 В-класса подавлял индуцированную антигеном эозинофилию дыхательных путей и аккумуляцию CD4⁺-Т-клеток in vivo.

Пример 31

Сравнение полумягких ODN класса В, С и Т: индуцирование секреции цитокина из мышиных спленоцитов in vitro

В этих исследованиях оценивали способность полумягких ODN класса В, С и Т индуцировать секрецию цитокина из мышиных спленоцитов in vitro.

Методы:

Спленоциты мышей BALB/c собирали и объединяли в пул. Эти спленоциты инкубировали в 48-луночных культуральных планшетах с 1×10⁷ клетками на 1 мл в среде RPMI 1640 + 10% фетальная сыворотка, содержащей отдельный ODN (1; 0,001; 0,01; 0,1; 1 или 10 мкг/мл). Тестируемыми ODN были полумягкий ODN 20674 класса В, полумягкие ODN 316 и ODN 317 класса С, полумягкие ODN 319 и ODN 320 класса Т.

После 48-часового инкубирования (37°С, 5% СО₂) культуральную среду удаляли и концентрации IL-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-гамма и TNF-альфа измеряли с применением мультиплексной системы цитокинов Luminex. Концентрации IL-12р70, TNF-α и IP-10 измеряли с помощью ELISA. Нижние пределы точной детектируемости составляли 3,2-10 пг/мл. Статус активации клеток оценивали путем измерения экспрессии CD40, CD69 и CD86 на CD3⁺- и В220⁺-клетках с помощью проточной цитометрии.

Результаты:

Каждый из ODN индуцировал активацию В-клеток (В220⁺-клетки), как было определено по повышенной экспрессии CD40, CD69 и CD86, и активацию Т-клеток (CD3⁺-клеток), как было определено по повышенной экспрессии CD69.

ODN индуцировали секрецию IL-6, IL-10, IL-12р70, IFN-α, TNF-α и IP-10. Титры других измеренных цитокинов не были увеличены. Так, например, было обнаружено, что при концентрации ODN в 1 мкг/мл уровни секреции цитокинов были такими, как указано ниже (все уровни выражены в пг/мл).

Таблица 18

In vitro секреция цитокинов в ответ на введение полумягкого ODN класса В, С и Т

nd - не детектировали

По сравнению с полумягким ODN 313 В-класса два полумягких ODN С-класса индуцировали более высокие титры IL-10, IL-12р40, IFN-α, TNF-α и IP-10, но не индуцировали повышенных уровней активации В-клеток. Два полумягких ODN Т-класса, очевидно, были менее эффективными в качестве индукторов цитокинов, чем полумягкие ODN В- и С-класса.

Выводы:

Каждый из ODN В-класса и С-класса давали профиль индукции цитокинов, который соответствовал активации TLR9, и каждый из них индуцировал активацию В-клеток. ODN Т-класса были менее эффективными индукторами цитокинов.

По сравнению с полумягким ODN 313 В-класса каждый из полумягких ODN 316 и 317 С-класса индуцировал более высокие концентрации иммуномодифицирующих цитокинов, но не индуцировал активацию В-клеток. Эти данные позволяют сделать вывод о терапевтической ценности ODN С-класса.

Пример 32

Индукция цитокинов, антитела и ЦТЛ in vivo в ответ на введение CpG-ODN

Измерение уровня цитокинов: мышам BALB/c вводили путем подкожной (s.c.) инъекции 400 мг ODN (SEQ ID NO:294 (мягкого), 241 (полумягкого), 242 и 286). Через 3 часа после инъекции у животных брали кровь и измеряли уровни IP-10, IFN-гамма и TNF-альфа в плазме с помощью ELISA. Результаты представлены на фиг. 41А и В (IP-10), С (IFN), D и Е (TNF).

Гуморальный ответ: мышей BALB/c иммунизировали 1 мг HBsAg, вводимого отдельно или в комбинации с CpG-ODN путем внутримышечной (i.m.) инъекции. Через 4 недели после первичной иммунизации животным вводили бустер-инъекции. Титры антител измеряли в конечной точке с помощью ELISA. Через 2 недели после введения бустер-инъекции титры IgG-изотипа измеряли в конечной точке с помощью ELISA. Результаты показаны на фиг. 42А и В.

Ответ цитотоксических Т-лимфоцитов: мышей BALB/c иммунизировали 1 мг HBsAg, вводимого отдельно или в комбинации с CpG-ODN путем внутримышечной (i.m.) инъекции. Через 4 недели после первичной иммунизации животным вводили бустер-инъекции. Через 4 недели после введения бустер-инъекции ЦТЛ-активность измеряли с помощью анализа на высвобождение ⁵¹Cr. Результаты представлены на фиг.42С.

Таким образом, мягкий и полумягкий ODN оказывают аналогичное или более сильное активирующее действие на мышиную иммунную систему, как было показано в in vitro и in vivo исследованиях, и могут усиливать антигенспецифические иммунные ответы.

Пример 33

Применение CpG-ODN в противораковой терапии in vivo

ODN по настоящему изобретению тестировали на эффективность в монотерапии на трех моделях злокачественной опухоли. Сначала ODN вводили мышам с почечно-клеточной карциномой (renca). Эти тесты проводили следующими методами: опухоли индуцировали путем подкожной (s.c.) инъекции 2×10⁵ клеток renca в левый бок мыши на день 0. Обработку проводили путем s.c. инъекции PBS, CpG-ODN 241 или 242 еженедельно в течение 5 недель, начиная с 10-го дня после инъекции опухолевых клеток. Результаты представлены на фиг. 43А и В.

В качестве второй тестируемой модели использовали мышиный немелкоклеточный рак легких (карцинома легких Льюиса). Опухоли индуцировали путем s.c. инъекции 2×10⁶ клеток карциномы Льюиса в левый бок мыши на день 0. Обработку проводили путем s.c. инъекций PBS, 100 мг CpG-ODN 241 или 242 на 1-й, 3-й, 7-й день и еженедельно в течение 2 месяцев. Результаты представлены на фиг. 43Е и F.

В качестве третьей модели использовали мышиную нейробластому. 1×10⁶ клеток Neuro2а s.c. инъецировали в левый бок на день 0. Подкожные инъекции PBS, 100 мг CpG-ODN 241 или 242 вводили ежедневно с 10-го дня по 15-й день. Результаты представлены на фиг. 43С и D.

Таким образом, полумягкий ODN может подавлять рост злокачественной опухоли (мышиной renca, LLC, нейробластомы) и увеличивать выживаемость мышей с указанными злокачественными опухолями.

Пример 34

Паранефральное воспаление, возникающее в результате введения мягких, полумягких и жестких ODN у TLR9-дефицитных мышей BALB/c

TLR9-дефицитных мышей BALB/c исследовали на паранефральное воспаление. Результаты представлены в таблицах 19 и 20 соответственно. Полумягкий ODN (241) индуцировал меньшую степень воспаления в области инъекции, но не индуцировал (при дозе 100 мг) или индуцировал незначительное (при дозе 250 мг) перинефральное воспаление и лучше переносился мышами после его многократного введения.

Таблица 19
Группы	Воспаление паренхимы почек	Грануломатозное воспаление почечной капсулы	Грануломатозное воспаление адипозной ткани
PBS	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
242, 100 мг	Слабое, 2/5	Слабое или умеренное, 5/5	Слабое или умеренное, 5/5
242, 250 мг	Слабое, 1/4	Слабое или умеренное, 4/4	Заметное, 4/4
241, 100 мг	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
241, 250 мг	Слабое, 2/5	Слабое, 2/5	Слабое или умеренное, 3/5

Таблица 20
Группы	Воспаление паренхимы почек	Грануломатозное воспаление почечной капсулы	Грануломатозное воспаление адипозной ткани
PBS	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
242, 100 мг	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
242, 250 мг	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
241, 100 мг	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5
241, 250 мг	Норма 5/5	Норма 5/5	Норма 5/5

Приведенное выше описание является достаточным для практического осуществления настоящего изобретения любым специалистом. Объем настоящего изобретения не ограничивается описанными выше примерами, поскольку эти примеры приведены лишь в целях иллюстрации одного из аспектов настоящего изобретения, и в объем настоящего изобретения могут быть включены другие функционально эквивалентные варианты. Исходя из вышеприведенного описания помимо указанных и описанных выше вариантов специалистом могут быть внесены различные модификации, не выходящие за рамки объема прилагаемой формулы изобретения. Преимущества и цели настоящего изобретения не обязательно охватываются каждым из представленных вариантов изобретения.

1. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий, по крайней мере, один внутренний динуклеотид цитозин-гуанозин (CG), где, по крайней мере, один внутренний динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, где необязательно каждый дополнительный внутренний динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную, фосфодиэфироподобную или стабилизированную фосфортиоатную межнуклеотидную связь и где все остальные межнуклеотидные связи стабилизированы фосфортиоатной связью.

2. Олигонуклеотид по п.1, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит множество внутренних динуклеотидов CG, имеющих фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.

3. Олигонуклеотид по п.2, где каждый внутренний динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную межнуклеотидную связь.

4. Олигонуклеотид по п.3, где молекулой иммуностимулирующего олигонуклеотида является иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты В-класса.

5. Олигонуклеотид по п.3, где молекулой иммуностимулирующего олигонуклеотида является иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты С-класса.

6. Олигонуклеотид по п.3, где молекула иммуностимулирующего олигонуклеотида имеет длину 4-100 нуклеотидов.

7. Олигонуклеотид по п.3, не содержащий антисмысловых последовательностей.

8. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий, по крайней мере, одну последовательность N₁CGN₂, где в каждой последовательности N₁CGN₂ CG независимо представляет собой внутренний динуклеотид цитозин-гуанозин, каждый из N₁ и N₂ независимо представляет собой любой нуклеотид, и где, по крайней мере, в одной последовательности N₁CGN₂ и необязательно в каждой дополнительной последовательности N₁CGN₂:

динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и

(a) N₁ и С связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид,

(b) G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, или

(c) N₁ и С связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, где все остальные межнуклеотидные связи стабилизированы фосфортиоатной связью.

9. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов, и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, и где G-N₂-C содержит 1 или 2 связи стабилизированных фосфортиоатной связью.

10. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов, и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-20 нуклеотидов, и где G-N₂-C содержит, по крайней мере, 5 связей стабилизированных фосфортиоатной связью.

11. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

где каждый из N₁, N₂ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и где указанный олигонуклеотид не содержит антисмысловых последовательностей.

12. Соединение, содержащее олигонуклеотид по п.3, конъюгированный с адъювантом, цитокином или антигеном.

13. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'T*C*G*(T*/A*)TN₃CGTTTTN₄CGN₅*T*T3' (SEQ ID NO:301), где N₃ состоит из 0-4 нуклеотидов, N₄ состоит из 1-5 нуклеотидов и необязательно из 1-2 нуклеотидов, N₅ состоит из 0-7 нуклеотидов, где символ * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, и где указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 3 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи и имеет длину, необязательно, 16-24 нуклеотида.

14. Олигонуклеотид по п.13, где указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

5'T*C*G*(T*/A*)TN₃CGTTTTN₄C*G*N₅*T*T 3'(SEQ ID NO: 301),

5' T*C*G*A*T*N₃C*G*TTTTN₄C_G_*N₅*T*T 3'(SEQ ID NO: 302),

5'T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 304),

5'T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 305), или

5'T*C*G*T*T*N₃C_G_TTTTN₄CGN₅*T*T 3'(SEQ ID NO: 303).

15. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'T*CGCGN₈CGCGC*GN₉3' (SEQ ID NO:315),

где N₈ имеет длину 4-10 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив C_G и необязательно, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG, N₉ имеет длину 0-3 нуклеотида, символ * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, и где указанный олигонуклеотид имеет длину 15-40 нуклеотидов.

16. Олигонуклеотид по п.15, где N₈ представляет собой PuCGPyPyCG, PuCGPyPyCGCG или ACGTTCG.

17. Олигонуклеотид по п.15, где N₉ содержит, по крайней мере, один мотив CG.

18. Олигонуклеотид по п.15, где N₉ представляет собой CCG.

19. Олигонуклеотид по п.15, где указанный олигонуклеотид имеет нижеследующую структуру:

5'T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'(SEQ ID NO: 316)

или 5'T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G3'(SEQ ID NO: 317).

20. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'T*C_G(N₆C_GN₇)_2-3T*C_G*T*T3'(SEQ ID NO:311-312), где N₆ и N₇ независимо имеют длину 1-5 нуклеотидов и N₆, необязательно, представляет собой один нуклеотид, предпочтительно, Т или А, и N₇ необязательно состоит из пяти нуклеотидов, предпочтительно, из пяти пиримидинов или TTTTG, где * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, и где указанный олигонуклеотид имеет длину 16-40 нуклеотидов.

21. Олигонуклеотид по п.20, где указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

5'T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 313) или 5'Т*С_G*А*С_G*Т*Т*Т*Т*G*Т*С_G*Т*Т*'Т*Т*G*Т*С_G*Т*Т 3'(SEQ ID NO: 314).

22. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'T*T*GX₁X₂TGX₃X₄T*T*T*T*N₁₀T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO:318), где N₁₀ имеет длину 4-8 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив C_G и необязательно, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG, где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ независимо представляют собой С или G, * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, и где указанный олигонуклеотид имеет длину 24-40 нуклеотидов.

23. Олигонуклеотид по п.22, где указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

5'T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 319) или 5'T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 320).

24. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3' (SEQ ID NO:321), где * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, и необязательно где указанный олигонуклеотид имеет длину 21-40 нуклеотидов.

25. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

октамерную последовательность, содержащую, по крайней мере, один динуклеотид CG, имеющий фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь и, по крайней мере, 4 нуклеотида Т, где С представляет собой цитозин или модифицированный цитозин, а G представляет собой гуанозин или модифицированный гуанозин, и где указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную фосфортиоатную межнуклеотидную связь.

26. Олигонуклеотид по п.25, где указанная октамерная последовательность содержит мотив ТТТТ.

27. Олигонуклеотид по п.25, где указанная октамерная последовательность содержит два динуклеотида CG.

28. Олигонуклеотид по п.27, где оба динуклеотида CG имеют фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь.

29. Олигонуклеотид по п.25, где указанная октамерная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

T*C-G*T*C-G*T*T, C-G*T*C-G*T*T*T, G*T*C-G*T*T*T*T,

T*C-G*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*A, T*T*T*T*G*A*C-G,

T*T*T*G*A*C-G*T, T*T*G*A*C-G*T*T, T*G*A*C-G*T*T*T, G*A*C-G*Т*Т*Т*Т,

A*C-G*T*T*T*T*G, С-G*Т*Т*Т*Т*G*Т, T*T*T*T*G*T*C-G,

T*T*T*G*T*C-G*T, и T*T*G*T*C-G*T*T,

где * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи, и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

30. Олигонуклеотид по п.25, где указанный олигонуклеотид имеет длину 8-40 нуклеотидов.

31. Олигонуклеотид по п.25, где С представляет собой цитозин или модифицированные цитозиновые основания, выбранные из группы, состоящей из 5-метилцитозина, 5-метилизоцитозина, 5-гидроксицитозина, 5-галогенцитозина, урацила, N4-этилцитозина, 5-фторурацила, и водород.

32. Олигонуклеотид по п.25, где G представляет собой гуанин или модифицированное гуаниновое основание, выбранное из группы, состоящей из 7-деазагуанина, 7-деаза-7-замещенного гуанина (такого как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенного гуанина, гипоксантина, 2,6-диаминопурина, 2-аминопурина, пурина, 8-замещенного гуанина, такого как 8-гидроксигуанин, 6-тиогуанина, 2-аминопурина.

33. Олигонуклеотид по п.25, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из

CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 333),

GTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 334),

TCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 335), CGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 336), GTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO; 337),

TTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 338), TTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 339), TTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 340), TGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 341), GACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 342), ACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO; 343), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 344), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 345).

34. Олигонуклеотид по п.25, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из

TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT (SEQ ID NO: 347),

TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQ ID NO: 348),

TCGTCGTTTTGACGTTTTGTC (SEQ ID NO: 349), TCGTCGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 350), TCGTCGTTTTGACGTTTTG (SEQ ID NO: 351),

TCGTCGTTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 352), TCGTCGTTTTGACGTTT (SEQ ID NO: 353), TCGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 354), TCGTCGTTTTGACGT (SEQ ID NO: 355), TCGTCGTTTTGACG (SEQ ID NO: 356), TCGTCGTTTTGAC (SEQ ID NO: 357), TCGTCGTTTTGA (SEQ ID NO: 358), TCGTCGTTTTG (SEQ ID NO: 359), TCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 360).

35. Олигонуклеотид по п.25, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из

CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT(SEQ ID N0:361),

GTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQ ID NO: 362), TCGTTTTGACGTTTTGTC (SEQ ID NO 363), CGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 364), GTTTTGACGTTTTG (SEQ ID NO: 365), TTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 366), TTTGACGTTT (SEQ ID NO:367).

36. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO:368), где, по крайней мере, один динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную межнуклеотидную связь и где указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную фосфортиоатную межнуклеотидную связь.

37. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий:

5'GNC3', где N представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-10 нуклеотидов, которая, по крайней мере, на 50% состоит из Т и не содержит динуклеотид CG, и где указанный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную фосфортиоатную межнуклеотидную связь.

38. Олигонуклеотид по п.37, где N содержит мотив ТТТТ.

39. Олигонуклеотид по п.38, где указанный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из G*T*T*T*T*G*T*C и G*T*T*T*T*G*A*C, где * означает присутствие стабилизированной фосфортиоатной межнуклеотидной связи.

40. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий T*C-G*T*C-G*A*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 369).

41. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий T*C-G*G*A*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 371).

42. Способ модуляции иммунного ответа, предусматривающий введение субъекту олигонуклеотида по любому из пп.1-41 в количестве, эффективном для модуляции иммунного ответа.

43. Способ по п.42, где указанный олигонуклеотид вводят указанному субъекту для лечения астмы или аллергии.

44. Способ по п.42, где указанный субъект страдает злокачественной опухолью, инфекционным заболеванием или аутоиммунным заболеванием.

45. Способ по п.42, который дополнительно предусматривает проведение лечения указанного субъекта в соответствии с такой методикой, как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или медикаментозная терапия.

46. Способ по п.42, где указанный олигонуклеотид входит в состав лекарственного препарата.

47. Способ по п.42, где указанный олигонуклеотид вводят способом, выбранным из группы, состоящей из перорального, интраназального, подъязычного, внутривенного, подкожного, трансмукозального способа введения, введения через дыхательные пути, прямой инъекции и внутрикожного введения.

48. Способ по п.42, где указанный олигонуклеотид вводят указанному субъекту в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии цитокинов, где цитокины необязательно включают IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ IP-10.

49. Способ по п.42, где указанный олигонуклеотид вводят указанному субъекту в количестве, эффективном для переключения иммунного ответа с Тh2-ответа на Th1-ответ.

Приоритет по пунктам и признакам:

19.08.2002 по пп.1-14, пп.42-49 в части использования олигонуклеотидов по пп.1-14;

27.11.2002 по пп.15-23, пп.42-49 в части использования олигонуклеотидов по пп.15-23;

14.02.2003 по п.24, пп.42-49 в части использования олигонуклеотидов по п.24.