Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при микоплазмозе крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ включает дробную формалинизацию эритроцитов барана и сенсибилизацию их микоплазмозным антигеном при 70°С в течение 30 минут. При этом для сенсибилизации используют эритроциты без предварительной их танизации, которые нагружают сенситином, полученным из смеси в равных пропорциях культур микоплазм М. bovoculi, М. argenini и Ureaplasma sp., прогретым на водяной бане при 70°С в течение 30 минут. Затем трехкратно отмывают полученный диагностикум без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4% нормальной кроличьей сыворотки. Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации, 2 табл.

 

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, ранее используемые для РНГА при сальмонеллезе, пастереллезе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 г.г. (№№2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10) и микоплазмоза свиней (Андросик, Н.Н. // Ветеринария, 2000 №3).

Однако известные способы обладают следующими недостатками:

1. проводится танизация,

2. сложные и неэкономичные методы фиксации и сенсибилизации эритроцитов сенситином.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков, А.П. Новые механизмы искусственной регуляции паразито-хозяинных отношений: дис... доктора вет.наук.: 16.00.03. / А.П.Красиков; - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:

1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137 М хлористый натрий и 0,001М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).

Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия р-ра формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови р-р формальдегида добавлялся не сразу, а порциями в возрастающих объемах через определенный промежуток времени.

Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный р-р формальдегида порциями в возрастающих объемах через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

2. Вторым этапом конструирования эритроцитарного диагностикума является необходимость получения антигена, который бы обладал способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм В. abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ - ИЭВСиДВ (Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных - Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока) (Науч. техн. бюлл./ ИЭВСиДВ, 1981, вып.33. С.6-13). Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.

Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при Т 80-85°С на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализатат используют в качестве антигена.

3. Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикум в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.

Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с рН 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1%-40% р-ра формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с рН 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и доводят тем же буфером до 3%-ной концентрации эритроцитов с добавлением 1% формалина с целью закрепления антигена на эритроцитах.

Целью нашего изобретения является получение микоплазмозного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови исследуемых животных.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов:

1. дробная формалинизация эритроцитов барана,

2. получение антигена из трех культур микоплазм (М. bovoculi, M. argenini и Ureaplasma sp.) путем прогревания их на водяной бане при Т 70°С в течение 30 мин, механического смешивания в равных пропорциях и концентрации центрифугированием,

3. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана без предварительной танизации смесью трех микоплазмозных антигенов при 70°С в течение 30 мин с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН 7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.

Описание метода:

1. При формалинизации (фиксации) эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137 М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.

К 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2-5 мин и ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3%-20%-ного р-ра формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

2. В качестве сенситинов используются корпускулярные антигены микоплазм (М. bovoculi, M. argenini и Ureaplasma sp.). Микоплазмы выращивают на трех жидких питательных средах: глюкозоферментирующих, аргенинферментирующих и уреаплазмозных, разработанных Омским НИИ природно-очаговых инфекций совместно с ИВМ ОмГАУ, описанных Новиковой Н.Н. (Н.Н.Новикова. Экспресс-методы диагностики ассоциативного микоплазмоза плотоядных: дис. канд. вет. наук, Новосибирск - 2002. С.37-55).

Культуры микоплазм освобождают от питательных сред путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение одного часа. Осадки трех культур после трехкратного ресуспензирования и последующего центрифугирования смешивают в равных количествах и разводят 1:10 физиологическим р-ром. Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов

3. Для нагрузки формалинизированных 3% эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: IV эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% - 40% р-ра формальдегида.

Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, ресуспендируют в этом же р-ре, доводя до первоначальной 3% концентрации и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов после инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.

Определены специфичность и активность трех серий (С-1 - С-3) микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) в РНГА (табл.1, 2).

Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота.

Контроль на специфичность МЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий микоплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. В титре 1:10 МЭД в РНГА вызывает перекрестные реакции с бруцеллезной, лептоспирозной, сальмонеллезной, и хламидиозной гетерологичными сыворотками, тогда как в последующих разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:20 и выше (табл.1).

Таблица. 1.
Специфичность МЭД в РНГА.
МЭД	Стандартные диагностические сыворотки	Микоплазмозные сыворотки
	Г	А	У
бруц.	лепт.	лист.	ПВ	сальм.	хлам.	1/20	1/20	1/20
С-1	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-2	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
С-3	-	-	-	-	-	-	++++	++++	++++
Примечание: бруц. - бруцеллезная; лепт.- лептоспирозная; лист.- листериозная; ПВ -против пустулезного вульвовагинита; сальм. - сальмонеллезная; хлам. - хламидиозная; Г - глюкозоферментирующая - M.bovoculi, А - аргининферментирующая - M.argmini, - Ureaplasma sp.

Контроль на активность МЭД в РНГА.

Для контроля активности полученного эитроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках с микоплазмозными (Г, А, У - сыворотками) и смешанной (Г+А+У) микоплазмозными сыворотками в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН 6,4 и заведомо отрицательную на микоплазмоз сыворотку крупного рогатого скота в разведении 1:10.

С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешенной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:80, на два креста 1:160. С отрицательной сывороткой сомнительная реакция на два креста отмечается в первом разведении. В контроле с буферным раствором отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.2.).

Таблица 2.
Активность (МЭД) в РИГА.
Титр сывор	Микоплазмозные сыворотки	Г+А+У-сыворотка	Негативная сыворотка	ФБР
Г	А	У
1:10	++++	++++	++++	++++	++	-
1:20	++++	++++	++++	++++	-	-
1:40	++++	++++	++++	++++	-	-
1:80	++	++	++	+++	-	-
1:160	+	-	-	++	-	-
1:320	-	-	-	-	-	-

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемаглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их микоплазмозным антигеном при 70°С в течение 30 мин, отличающийся тем, что для сенсибилизации используют эритроциты без предварительной их танизации, которые нагружают сенситином, полученным из смеси в равных пропорциях культур микоплазм М. bovoculi, М. argenini и Ureaplasma sp., прогретым на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, затем трехкратно отмывают полученный диагностикум без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4%-ной нормальной кроличьей сыворотки.