Композиция антител против ctla-4

Авторы патента:

МУТХУРАНИА Кевин Уомити (US)

НЕМА Сандип (US)

ЭБЕЙТ Джастин Доналд (US)

СИНГХ Сатиш Кумар (US)

ДАС Тапан Канти (US)

ЭЛЛИОТТ Кэрри Мари (US)

A61P35 - Противоопухолевые средства

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2356579:

ФАРМАЦИЯ ЭНД АПДЖОН КОМПАНИ ЛЛС (US)

Настоящее изобретение предоставляет новую композицию антител против CTLA-4 и ее варианты, содержащую хелатирующий агент. Композиция содержит по меньшей мере одно антитело, специфически связывающее CTLA-4 человека, имеющее тяжелую и легкую цепи, аминокислотные последовательности (АН) которых по меньшей мере на 90% идентичны соответствующим последовательностям известного антитела, в частности тицилимумаб (АН приведены в тексте описания). Композиция в качестве хелатирующего агента содержит EDTA (ЭДТА), а также может содержать по меньшей мере буфер, гистидин, ПАВ, изотонический агент, например полисорбат 80, трегалозу в различных сочетаниях и соотношениях. Композиция имеет улучшенные свойства по уровню агрегации антител, уровню фрагментации антител, уровню нестабильности антител к замораживанию/оттаиванию, уровню изменения цвета композиции и/или уровню деамидирования антител. Композиция может быть использована для лечения заболеваний и состояний, связанных с новообразованиями. 21 з.п. ф-лы, 14 ил., 37 табл.

Перекрестные ссылки на родственные патенты и заявки на патенты

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 60/659766, зарегистрированной 8 марта 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/728165, зарегистрированной 19 октября 2005 года; предварительной заявки на патент США № 60/752712, зарегистрированной 20 декабря 2005 года; и предварительной заявки на патент США № 60/762456, зарегистрированной 26 декабря 2006 года, все они включаются сюда в виде ссылок во всей их полноте.

Уровень техники

Цитотоксичный антиген-4 T-лимфоцитов (“CTLA-4”) представляет собой член суперсемейства белков иммуноглобулинов (“Ig”). CTLA-4 действует посредством отрицательной регуляции активирования T-лимфоцитов и поддержания иммунологического гомеостаза. Блокада CTLA-4 (например, посредством использования антител к CTLA-4), как показано на животных моделях, улучшает эффективность иммунотерапии рака.

Антитела, которые связываются и ингибируют активность CTLA-4, известны из литературы. Например, патент США № 6682736, Pfizer, Inc. and Abgenix, Inc., сообщает о нескольких моноклональных антителах человека к CTLA-4, включая антитело CTLA-4, имеющего последовательность аминокислот тяжелых и легких цепей антитела 11.2.1, известного сейчас как Ticilimumab™. Линия клеток гибридом, продуцирующих антитело 11.2.1, имеет депозитарный номер в ATCC № PTA-5169. Патент США № 5977318, Bristol-Myers Squibb Company, сообщает о другом моноклональном антителе, которое распознает и связывает внеклеточный домен CTLA-4, тем самым предотвращая связывание CTLA-4 с антигеном B7. Опубликованная заявка на патент США № 20050201994, Medarex, Inc., сообщает о нескольких последовательностях антител человека к CTLA-4, включая то, которое упоминается теперь как Ipilimumab™.

Один из возможных способов введения такого антитела к CTLA-4 представляет собой парентеральное введение. Например, патент США № 6682736 сообщает о внутривенном препарате антитела против CTLA-4, который представляет собой стерильный жидкий раствор, содержащий антитела против CTLA-4, 20 мМ ацетата натрия, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 140 мМ хлорида натрия при pH 5,5.

Подобно другим белковым препаратам, препараты антитела к CTLA-4 связаны все с теми же проблемами, относящимися к химической и физической деградации антитела в препарате со временем. Как правило, препараты антитела к CTLA-4 должны демонстрировать приемлемую химическую и физическую стабильность в ожидаемом диапазоне условий хранения и использования, то есть препарат антитела к CTLA-4 должен иметь достаточно большое время хранения в упакованном состоянии, оставаясь при этом биологически активным. Принимая во внимание время и ресурсы, необходимые для производства продукта антитела к CTLA-4, являются желательными препараты, которые уменьшают потери продукта. Соответственно настоящая заявка описывает новые препараты антитела к CTLA-4, которые демонстрируют улучшенную химическую и/или физическую стабильность по отношению к препаратам антитела к CTLA-4, ранее описанным в литературе.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, где хелатирующий агент выбирается из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксной кислоты, диэтилентриаминпентауксусной кислоты 5, нитрилотриуксусной кислоты, N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты, бис(аминоэтил)гликолевого эфира, N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, транс-диаминоциклогексан тетрауксусной кислоты, глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, N-гидроксиэтилиминодиуксусной кислоты, N,N-бис-гидроксиэтилглицина, N-(трисгидроксиметилметил)-10-глицина, глицилглицина, 2-(2-амино-2-оксоктил)аминоэтансульфоновой кислоты, дефероксамина, дефероксаминмезилата, дикалий эдетата, динатрий эдетата, кальций динатрий эдетата, эдетата натрия, тринатрий эдетата, эдетата калия, лимонной кислоты, цитрата натрия, безводной лимонной кислоты, тринатрий цитрата-дигидрата, ниацинамида, натрий дезоксихолата и их смесей.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, где композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один эксципиент, выбранный из группы, состоящей из изотонических агентов, поверхностно-активных веществ и буферов, где поверхностно-активное вещество выбирается из группы, состоящей из полисорбатов, полоксамеров, тритонов, натрий додецилсульфата, натрий лаурелсульфата, натрий октилгликозида, лаурил-сульфобетаина, миристил-сульфобетаина, линолеил-сульфобетаина, стеарил-сульфобетаина, лаурил-саркозина, миристил-саркозина, линолеил-саркозина, стеарил-саркозина, линолеил-бетаина, миристил-бетаина, цетил-бетаина, лауроамидопропил-бетаина, кокамидопропил-бетаина, линолеамидопропил-бетаина, миристамидопропил-бетаина, пальмидопропил-бетаина, изостеарамидопропил-бетаина, миристамидопропил-диметиламина, пальмидопропил-диметиламина, изостеарамидопропил-диметиламина, натрий метилкокоил-таурата, динатрий метилолеил-таурата, дигидроксипропил PEG 5 линоламмонийхлорида, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и их смесей.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, и антитело является стабильным при температуре примерно 5°C в течение, по меньшей мере, примерно 26 недель.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, и антитело является стабильным при температуре примерно 25°C в течение, по меньшей мере, примерно 26 недель.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, и антитело является стабильным при температуре примерно 40°C в течение, по меньшей мере, примерно 26 недель.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для композиции и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агент, которая хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, составляет, по меньшей мере, примерно 2%, где после хранения композиции в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C композиция остается по существу прозрачной и бесцветной.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для композиции и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, составляет, по меньшей мере, примерно 2%, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, общий процент окисления метиониновых остатков в положении аминокислоты 432 уменьшается на величину, которая равна или больше, чем 2,2%, как определяется после ферментативного расщепления с помощью лизилэндопептидазы, с последующим разделением с помощью HPLC обращенной фазой, если сравнивать с антителами в композиции, которая не содержит хелатирующего агента.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для композиции и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, составляет, по меньшей мере, примерно 2%, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, общий процент окисления метиониновых остатков в положении аминокислоты 256 уменьшается на величину, которая равна или больше, чем 4,2%, как определяется после ферментативного расщепления с помощью лизилэндопептидазы, с последующим разделением с помощью HPLC обращенной фазой, если сравнивать с антителами в композиции, которая не содержит хелатирующего агента.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, по существу состоящее из последовательности аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно по существу состоящее из последовательности аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, состоящее из последовательности аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно состоящее из последовательности аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет способ приготовления стабильной жидкой фармацевтической композиции, включающий в себя смешивание моноклональных антител против CTLA-4 с фармацевтически приемлемым хелатирующим агентом в количестве, которое понижает нестабильность антитела, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C; уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей моноклональные антитела против CTLA-4 и хелатирующий агент; и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, составляет, по меньшей мере, примерно 2%.

Настоящее изобретение также предоставляет способ стабилизации моноклональных антител против CTLA-4 в жидкой фармацевтической композиции, включающий в себя формирование жидкой композиции, содержащей антитела и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где, когда композиция хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C; уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей моноклональные антитела против CTLA-4 и хелатирующий агент; и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится в течение периода примерно 24 недель при температуре примерно 40°C, составляет, по меньшей мере, примерно 2%.

Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения состояния новообразования у субъекта, включающий в себя введение субъекту жидкой фармацевтической композиции, содержащей: терапевтически эффективное количество моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где состояние новообразования представляет собой рак, который выбирается из группы, состоящей из рака головного мозга, плоских клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, груди, головы, шеи, пищевода, простаты, толстой и прямой кишки, легких, ренальных органов, почек, яичников, женских органов и рака щитовидной железы.

Настоящее изобретение также предоставляет набор для приготовления жидкой композиции стабилизированного антитела, содержащий: первый контейнер, содержащий моноклональное антитело против CTLA-4 тицилимумаб в растворе, и второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет промышленное изделие, содержащее контейнер, который содержит смесь, по меньшей мере, одного антитела против CTLA-4, имеющего последовательность аминокислот тяжелой и легкой цепей тицилимумаб, и хелатирующего агента.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую моноклональные антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антител к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую моноклональные антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450, где антитела включают в себя моноклональные антитела против CTLA-4, имеющие последовательность аминокислот тяжелой и легкой цепей антитела тицилимумаб.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую моноклональные антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антител находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антител к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,0001 до примерно 100.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую моноклональные антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антител находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимоля, и где молярное отношение антител к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,001 до примерно 10.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую моноклональные антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антител находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антител к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450, где молярное отношение антител к хелатирующему агенту составляет примерно 0,5.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно моноклональное антитело против CTLA человека, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция содержит концентрацию антитела, которая составляет, по меньшей мере, примерно 10 мг/мл.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция содержит концентрацию антитела, которая находится в пределах от примерно 10 мг/мл до примерно 25 мг/мл.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция содержит концентрацию антитела, которая находится в пределах от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую: по меньшей мере, один хелатирующий агент и, по меньшей мере, одно антитело, содержащее: последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека.

Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую: по меньшей мере, хелатирующий агент и, по меньшей мере, одно антитело, содержащее: последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека, где антитело включает в себя моноклональное антитело против CTLA-4 IgG2, имеющее последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей тицилимумаб.

Настоящее изобретение также предоставляет способ приготовления жидкой фармацевтической композиции, включающий в себя смешивание, по меньшей мере, одного антитела против CTLA-4, имеющего последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей тицилимумаб, в растворе, по меньшей мере, с одним хелатирующим агентом.

Настоящее изобретение также предоставляет набор для приготовления жидкой композиции стабилизированного антитела, содержащий: первый контейнер, содержащий, по меньшей мере, одно антитело против CTLA-4, имеющее последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей тицилимумаб, в растворе, и второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый хелатирующий агент.

Настоящее изобретение также предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую: по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция содержит концентрацию антитела, которая составляет, по меньшей мере, примерно 10 мг/мл.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой столбчатую диаграмму, которая показывает процент агрегации различных исследуемых препаратов после хранения при 40°C в течение до 7 недель посредством эксклюзионной хроматографии (SEC);

Фигура 2 представляет собой столбчатую диаграмму, которая показывает процент образования (гидролитических) примесей в целом в различных исследуемых препаратах после хранения при 40°C в течение до 7 недель посредством восстановленного SDS PAGE (гель-электрофореза) (rSDS PAGE);

Фигура 3 представляет собой график, который показывает процент агрегации в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством SEC (эксклюзионной хроматографии);

Фигура 4 представляет собой график, который показывает процент образования (гидролитических) примесей в целом в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством rSDS PAGE;

Фигура 5 представляет собой график, который показывает процент агрегации в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством SEC;

Фигура 6 представляет собой график, который показывает процент образования (гидролитических) примесей в целом в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством rSDS PAGE;

Фигура 7 представляет собой столбчатую диаграмму, которая показывает процент агрегации в различных исследуемых препаратах как функцию уровня EDTA при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством SEC;

Фигура 8 представляет собой столбчатую диаграмму, которая показывает процент образования (гидролитических) примесей в целом в различных исследуемых препаратах как функцию уровня EDTA при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 24 недель посредством rSDS PAGE;

Фигура 9 представляет собой график, который показывает процент агрегации в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 13 недель посредством SEC;

Фигура 10 представляет собой график, который показывает процент образования (гидролитических) примесей в целом в различных исследуемых препаратах при хранении при ускоряющих условиях при 40°C в течение до 13 недель посредством rSDS PAGE;

Фигура 11, содержащая Фигуры 11A-11D, показывает последовательности нуклеотидов и аминокислот для антитела 11.2.1 против CTLA4, упоминаемого теперь как тицилимумаб. Фигура 11A показывает полноразмерную последовательность нуклеотидов для тяжелой цепи 11.2.1 (SEQ ID NO:1). Фигура 11B показывает полноразмерную последовательность аминокислот для тяжелой цепи 11.2.1 (SEQ ID NO:2) и последовательность аминокислот для вариабельной области тяжелой цепи для 11.2.1, как показано в квадратных скобках “[ ]” (SEQ ID NO:5). Последовательность аминокислот каждой CDR тяжелой цепи 11.2.1 подчеркнута. Последовательности CDR являются следующими: CDR1: GFTFSSYGMH (SEQ ID NO:7); CDR2: VIWYDGSNKYYADSV (SEQ ID NO:8) и CDR3: DPRGATLYYYYYGMDV (SEQ ID NO:9). Фигура 11C показывает последовательность нуклеотидов для легкой цепи 11.2.1 (SEQ ID NO:3). Фигура 11D показывает последовательность аминокислот полноразмерной легкой цепи 11.2.1 (SEQ ID NO:4) и вариабельную область легкой цепи, как показано в квадратных скобках “[ ]” (SEQ ID NO:6). Последовательность аминокислот каждой CDR указывается как следующая: CDR1: RASQSINSYLD (SEQ ID NO:10); CDR2: AASSLQS (SEQ ID NO:11) и CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO:12).

Подробное описание изобретения

Способы и технологии по настоящему изобретению, как правило, осуществляют в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иного. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Ферментативные реакции и технологии очистки осуществляют в соответствии с описаниями производителей, как повсеместно делают в данной области или как описано здесь. Номенклатуры, которые используются в связи с аналитической химией, химией органического синтеза и медицинской и фармацевтической химией и их лабораторными процедурами и технологиями, которые, описанные здесь, являются хорошо известными и повсеместно используемыми в данной области. Стандартные технологии используют для химического синтеза, химических анализов, получения фармацевтических препаратов, приготовления и доставки, и лечения субъектов.

Определения

Чтобы помочь понять следующее далее подробное описание, приводятся следующие определения:

Как здесь используется, термины “препарат” или “композиция”, когда они относятся к антителу против CTLA-4, как подразумевается, описывают антитело в сочетании с фармацевтически приемлемым эксципиентом, содержащим хелатирующий агент. Например, препараты по настоящему изобретению имеют улучшенное время хранения в упакованном состоянии и/или стабильность по сравнению с препаратами, известными из литературы.

Как здесь используется, термин “антитело” относится к интактному антителу или части, связывающейся с антигеном, которая конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. См., в целом, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Связывающиеся с антигеном части могут быть получены посредством технологий рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактных антител. В некоторых вариантах осуществления связывающиеся с антигеном части включают в себя Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb и фрагменты области, определяющей комплементарность (CDR), одноцепочечных антител (scFv), химерных антител, двойных антител и полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, часть антитела, которая является достаточной для обеспечения специфичного связывания антигена с полипептидом. От N-конца до C-конца вариабельные домены зрелой как легкой, так и тяжелой цепи содержат области FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Приписывание аминокислот к каждому домену осуществляется в соответствии с определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), или Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Как здесь используется, термин “полипептид” охватывает природные или искусственные белки, фрагменты белков и полипептидные аналоги последовательности белков. Полипептид может быть мономерным или полимерным.

Как здесь используется, фрагмент Fd означает фрагмент антитела, который состоит из доменов V_H и C_H1; фрагмент Fv состоит из доменов V_L и V_H одной руки антитела; и фрагмент dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)) состоит из домена V_H.

Термин “или его часть, связывающаяся с антигеном”, когда используется с термином “антитело”, относится к полипептиду, который имеет амино-конечную и/или карбокси-конечную делецию, но у которого оставшаяся последовательность аминокислот является идентичной соответствующим положениям в последовательности, встречающейся в природе. В некоторых вариантах осуществления фрагменты имеют длину, по меньшей мере, из 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах осуществления фрагменты имеют длину, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот.

Как здесь используется, термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах, или может отсутствовать C-конечный лизин. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, являясь направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, содержат различные антитела, направленные против различных детерминантов (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного детерминанта на антигене. Прилагательное "моноклональный" указывает на характер антитела, как полученного из гомогенной, по существу, популяции антител, и не должно рассматриваться как требующее продуцирования антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены в соответствии с гибридомным способом, изначально описанным Kohler, et al., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены посредством способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" могут также выделяться из библиотеки антител фагов, используя методики, описанные, например, в Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991) и Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Как здесь используется, термины “выделенное антитело” или “очищенное антитело” относятся к антителу, которое, из-за его происхождения или источника получения, имеет от одной до четырех из следующих особенностей: (1) не ассоциируется с ассоциируемыми в природе компонентами, которые сопровождают его в природном состоянии, (2) не содержит других белков от тех же самых видов, (3) экспрессируется клеткой из различных видов или (4) не существует в природе. Таким образом, антитело, которое синтезируется химически или синтезируется в клеточной системе, отличной от клетки, из которой оно происходит в природе, отделяется и очищается от ассоциируемых с ним в природе компонентов. Антитело может также быть сделано по существу не содержащим ассоциируемых с ним в природе компонентов посредством выделения и очистки, с использованием технологий очистки белков, хорошо известных в данной области. Примеры выделенных/очищенных антител включают в себя антитело против CTLA-4, которое афинно очищают с использованием CTLA-4, антитело против CTLA-4, которое синтезируется посредством линии клеток гибридом или других клеток in vitro, и антитело против CTLA-4 человека, получаемого из трансгенных мышей.

Примеры выделенных/очищенных антител включают в себя антитело против CTLA-4, которое афинно очищают с использованием CTLA-4, антитело против CTLA-4, которое синтезируют посредством линии клеток гибридом или другой линии клеток in vitro, и антитело против CTLA-4 человека, полученное от трансгенных мышей. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, антитела против CTLA-4 имеют чистоту, по меньшей мере, примерно 95% (мас./мас. - масса антитела против CTLA-4/масса компонентов иных, чем фармацевтически приемлемые эксципиенты), и в дополнительных вариантах осуществления, антитела против CTLA-4 имеют чистоту от примерно 95% мас./мас. до примерно 99,5% мас./мас.

Антитело является “по существу чистым”, “по существу гомогенным” или “по существу очищенным” когда, по меньшей мере, примерно 60-75% образца демонстрирует один вид антитела. Антитело может быть мономерным или мультимерным. По существу чистое антитело может, как правило, содержать примерно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% мас./мас. антитела образца, чаще примерно 95% и предпочтительно имеет чистоту выше 99%. Чистота или гомогенность антитела может быть показана с помощью ряда средств, хорошо известных в данной области, таких как электрофорез образца антитела на полиакриламидном геле, с последующей визуализацией отдельной полосы полипептида при окрашивании геля красителем, хорошо известным в данной области. Для определенных целей более высокое разрешение может достигаться посредством использования HPLC или других средств, хорошо известных в области очистки.

Как здесь используется, термин “антитело человека”, как подразумевается, включает в себя антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей гермлайн-иммуноглобулинов человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями гермлайн-иммуноглобулина человека (например, мутации, вводимые посредством случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, в CDR, и в частности, в CDR3. Однако термин "антитело человека", как здесь используется, не предназначается для включения антител, у которых последовательности CDR, полученные от половых клеток других видов млекопитающих, таких как мыши, прививаются на рамочные последовательности человека.

Как здесь используется, термин "рекомбинантное антитело человека", как подразумевается, включает в себя все антитела человека, которые приготавливаются, экспрессируются, создаются или выделяются с помощью рекомбинантных средств, таких как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицируемого в клетку-хозяин, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по отношению к генам иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью других средств, которые включают в себя сплайсинг генных последовательностей иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей гермлайн-иммуноглобулинов человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (или, когда используются последовательности животного, трансгенного по отношению к Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и таким образом последовательности аминокислот областей V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получаются из гермлайн-последовательностей V_H и V_L человека и являются родственными им, не могут существовать в спектре гермлайн-антител человека in vivo.

Как здесь используется, термин “полинуклеотид” или “нуклеиновая кислота”, используемый здесь взаимозаменяемо, обозначает полимерную форму нуклеотидов длиной, по меньшей мере, 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы. Последовательность “полинуклеотида” или “нуклеиновых кислот” охватывает их комплемент, если не указано иного. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую конкретную последовательность, должна, как понимается, охватывать ее комплементарную нить с ее комплементарной последовательностью.

Как здесь используется, термин “выделенный полинуклеотид” или “выделенная нуклеиновая кислота” обозначает полинуклеотид геномного, из цДНК, или синтетического происхождения, или некоторое их сочетание, этот выделенный в связи со своим источником происхождения или получения полинуклеотид имеет от одной до трех из следующих особенностей: (1) не ассоциируется со всем полинуклеотидом или с его частью, вместе с которой “выделенный полинуклеотид” встречается в природе, (2) является функционально связанным с полинуклеотидом, с которым он не связывается в природе, или (3) не встречается в природе как часть большей последовательности.

Как здесь используется, термин “встречающиеся в природе нуклеотиды” включают в себя дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин “модифицированные нуклеотиды”, как здесь используется, включает в себя нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров, и тому подобное. Термин “олигонуклеотидные связи”, упоминаемый здесь, включает в себя связи олигонуклеотидов, такие как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, фосфороселеноатная, фосфородиселеноатная, фосфороанилотиоатная, фосфораниладатная, фосфороамидатная и тому подобное. См., например, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); патент США № 5151510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), описания которых включаются сюда в качестве ссылок. Олигонуклеотид может содержать метку для детектирования, если это желательно.

“Функционально связанные” последовательности включают в себя как последовательности контроля экспрессии, которые совпадают с геном, представляющим интерес, так и последовательности контроля экспрессии, которые действуют в транс-положении или на расстоянии, контролируя ген, представляющий интерес. Термин “последовательность контроля экспрессии”, как здесь используется, означает последовательности полинуклеотидов, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигируются. Последовательности контроля экспрессии включают в себя соответствующее последовательности инициирования транскрипции, завершения, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (то есть консенсусную последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белков; а когда желательно, последовательности, которые повышают секрецию белков. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма хозяина; в прокариотах такие контрольные последовательности, как правило, включают в себя промотор, сайт рибосомального связывания и последовательность окончания транскрипции; у эукариотов, как правило, такие контрольные последовательности включают в себя последовательности промоторов и окончания транскрипции. Термин “контрольные последовательности”, как подразумевается, включает в себя, как минимум, все компоненты, присутствие которых является принципиально важным для экспрессии и процессинга, и могут также включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых является преимущественным, например лидерные последовательности и последовательности партнеров по слиянию.

Как здесь используется, термин “вектор” обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду, то есть круговую петлю двухцепочечной ДНК, с которой могут лигироваться дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут лигироваться в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный источник репликации и эписомальные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления векторы (например, не-эписомальные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяин и при этом реплицируются вместе с геном хозяина. Кроме того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они являются функционально связанными. Такие векторы упоминаются здесь как “рекомбинантные векторы экспрессии” (или просто “векторы экспрессии”).

Как здесь используется, термины “рекомбинантная клетка-хозяин” (или просто “клетка-хозяин”) обозначают клетку, в которую вводится рекомбинантный вектор экспрессии. Необходимо понять, что “рекомбинантная клетка-хозяин” и “клетка-хозяин” обозначают не только конкретную рассматриваемую клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях, либо из-за мутации, либо из-за воздействия окружающей среды, такое потомство, фактически, может не быть идентичным родительской клетке, но по-прежнему включается в рамки термина “клетка-хозяин”, как здесь используется.

Как здесь используется, термины “способно к специфичному связыванию” относятся к случаям, когда антитело связывается с антигеном с константой диссоциации, которая ≤1 мкМ, предпочтительно, ≤1 нМ, и наиболее предпочтительно, ≤10 пМ.

Как здесь используется, термин “селективная гибридизация” относится к детектируемому и специфичному связыванию. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением селективно гибридизируются с нитями нуклеиновых кислот при условиях гибридизации и отмывания, которые сводят к минимуму видимые количества детектируемого связывания с неспецифичными нуклеиновыми кислотами.

Условия “высокой строгости” или “очень строгие” условия могут использоваться для достижения условия селективной гибридизации, как известно в данной области и обсуждается здесь. Один из примеров “высокой строгости” или “очень строгих” условий представляет собой инкубирование полинуклеотида с другим полинуклеотидом, где один полинуклеотид может фиксироваться на твердой поверхности, такой как мембрана, в гибридизационном буфере из 6X SSPE или SSC, 50% формамида, 5X реагента Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной, дефрагментированной ДНК спермы лосося при температуре гибридизации 42°C в течение 12-16 часов, с последующей двукратной промывкой при 55°C с использованием промывочного буфера из 1X SSC, 0,5% SDS. См. также Sambrook et al., pp. 9.50-9.55, выше.

Термин “процент идентичности последовательности” в контексте последовательностей нуклеиновых кислот означает процент остатков, когда первая непрерывная последовательность сравнивается и совмещается для максимального совпадения со второй непрерывной последовательностью. Длина сравнения идентичности последовательности может распространяться на расстояние, по меньшей мере, примерно девяти нуклеотидов, обычно, по меньшей мере, примерно 18 нуклеотидов, чаще, по меньшей мере, примерно 24 нуклеотидов, как правило, по меньшей мере, примерно 28 нуклеотидов, еще чаще, по меньшей мере, примерно 32 нуклеотидов, а предпочтительно, по меньшей мере, примерно 36, 48 или более нуклеотидов. Имеется ряд различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут использоваться для измерения идентичности последовательностей нуклеотидов. Например, последовательности полинуклеотидов могут сравниваться с использованием FASTA, Gap или BESTFIT, которые представляют собой программы в Wisconsin Package Version 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, которая включает в себя, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает совмещение и процент идентичности последовательности областей наилучшего перекрывания между последовательностью сравнения и исследуемыми последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)). Если не указано иного, используются параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процент идентичности последовательности между последовательностями нуклеиновых кислот может определяться с использованием FASTA с параметрами по умолчанию (с размером слова 6 и NOPAM фактором для матрицы оценок) или с использованием Gap с ее параметрами по умолчанию, как предоставляется в GCG Version 6.1.

Ссылка на последовательность “полинуклеотидов” или “нуклеиновых кислот” охватывает ее комплемент, если не указано иного. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую конкретную последовательность, как понимается, должна охватывать ее комплементарную нить с ее комплементарной последовательностью.

Термин “достаточное сходство” или “достаточное сходство последовательностей”, когда упоминается нуклеиновая кислота или ее фрагмент, означает, что при оптимальном совмещении с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной нитью) имеется идентичность нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, примерно на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90%, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% оснований нуклеотидов, как измерено с помощью любого хорошо известного алгоритма идентификации последовательностей, такого как FASTA, BLAST или Gap, как обсуждается выше.

В применении к полипептидам термин “достаточная идентичность”, “процент идентичности” или “% идентичных” означает, что две последовательности пептидов, когда оптимально совмещаются, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, с использованием весов промежутков по умолчанию, как они поставляются вместе с программами, дают, по меньшей мере, 70%, 75% или 80% идентичность последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 90% или 95% идентичность последовательности, а более предпочтительно, по меньшей мере, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности. В определенных вариантах осуществления положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными замещениями аминокислот. “Консервативное замещение аминокислот” представляет собой такое, при котором остаток аминокислоты замещается остатком другой аминокислоты, имеющим боковую группу R со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативное замещение аминокислот существенно не меняет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более последовательности аминокислот отличаются друг от друга консервативными замещениями, процент идентичности последовательности может корректироваться в сторону увеличения благодаря консервативной природе замещения. Средства для осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают в себя 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глютамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Группы консервативного замещения аминокислот представляют собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глютамат-аспартат и аспарагин-глютамин.

Идентичность последовательности для полипептидов, как правило, измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет последовательности с использованием мер сходства, приписываемых различным замещениям, делециям и другим модификациям, включая консервативные замещения аминокислот. Например, GCG содержит такие программы, как “Gap” и “BESTFIT”, которые могут использоваться с параметрами по умолчанию, как описывается в программах, для определения гомологии последовательности или идентичности последовательности между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от различных видов организмов, или между диким белком и его мутантом. См., например, GCG Version 6.1. Последовательности полипептидов также могут сравниваться с использованием FASTA, используя параметры по умолчанию или рекомендованные параметры, см. GCG Version 6.1. (University of Wisconsin WI). FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает совмещение и процент идентичности последовательности областей наилучшего перекрывания между последовательностью сравнения и исследуемой последовательностью (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Другой предпочтительный алгоритм, при сравнении последовательности по настоящему изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от различных организмов, представляет собой компьютерную программу BLAST, в частности blastp или tblastn, с использованием параметров по умолчанию, как поставляется вместе с программой. См., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997). Длина последовательностей полипептидов, сравниваемых относительно гомологии, как правило, будет составлять, по меньшей мере, примерно 16 аминокислотных остатков, обычно, по меньшей мере, примерно 20 остатков, чаще, по меньшей мере, примерно 24 остатков, как правило, по меньшей мере, примерно 28 остатков, и предпочтительно, более, примерно, чем 35 остатков. Во время поиска в базе данных, содержащих последовательности от большого количества различных организмов, является предпочтительным сравнение последовательностей аминокислот.

“Терапевтически эффективное количество” относится к количеству, эффективному, при необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата, который включает в себя лечение или профилактическое предотвращение состояний новообразований. Необходимо отметить, что значения дозировок могут изменяться вместе с тяжестью состояния, которое должно облегчаться. Кроме того, необходимо понять, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования должны устанавливаться по времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным суждением лица, вводящего композиции или руководящего их введением, и что диапазоны дозировок, приведенные здесь, являются только примерными и не предназначаются для ограничения рамок или практического использования заявляемой композиции. Подобным же образом, терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может изменяться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, способность антитела или части антитела вызывать желаемую реакцию индивидуума и желаемый способ введения препарата антитела. Терапевтически эффективное количество является также таким, при котором любые токсические или вредные воздействия антитела или части антитела превосходятся терапевтически полезными воздействиями.

Как здесь используется, термин "субъект" для целей лечения включает в себя любой субъект, а предпочтительно представляет собой субъект, который нуждается в лечении состояния новообразования. Для целей предотвращения субъект представляет собой любой субъект, а предпочтительно представляет собой субъект, который имеет риск или является предрасположенным к развитию состояния новообразования. Термин "субъект", как подразумевается, включает в себя живые организмы, например прокариоты и эукариоты. Примеры субъектов включают в себя млекопитающих, например людей, собак, коров, лошадей, свиней, баранов, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от людей. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения субъект представляет собой человека.

Как здесь используется, термины "новообразование" и “состояния новообразования”, используемые здесь взаимозаменяемо, относится к росту новых клеток, который возникает в результате потери отзывчивости на нормальные факторы контроля роста, например рост клеток “новообразования”. Новообразование также используется здесь взаимозаменяемо с термином “рак”, и для целей настоящего изобретения рак представляет собой один из подтипов новообразования. Как здесь используется, термин “состояние новообразования” также охватывает другие клеточные аномалии, такие как гиперплазия, метаплазия и дисплазия. Термины новообразование, метаплазия, дисплазия и гиперплазия могут использоваться здесь взаимозаменяемо и относятся, в целом, к клеткам, испытывающим аномальный рост клеток.

Как здесь используется, термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предотвращение или замедление (уменьшение) целевого патологического состояния или положения. Нуждающиеся в лечении включают в себя тех, у кого уже есть это состояние, а также тех, которые склонны к возникновению состояния, или тех, у кого состояние должно предотвращаться.

При введении элементов по настоящему изобретению или его предпочтительного варианта (вариантов) осуществления указания на единственное число "указанный", как предполагается, обозначают, что имеется один или несколько элементов. Термины "содержащий", “содержат”, “содержит”, "включающий в себя" и "имеющий", как предполагается, являются инклюзивными и обозначают, что могут иметься дополнительные элементы, иные, чем перечисленные элементы.

Антитела против CTLA-4

В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что стабильность определенных моноклональных антител против CTLA-4, которые описываются здесь, может быть улучшена посредством смешивания антител против CTLA-4 с фармацевтически приемлемым хелатирующим агентом, таким как этилендиаминтетрауксусная кислота (“EDTA”).

Хотя и не имея желания ограничиваться теорией, предполагается, что присутствие хелатирующего агента в композиции по настоящему изобретению помогает улучшить стабильность полипептида антитела посредством уменьшения вероятности одного или нескольких из следующих событий: агрегации, фрагментации, окисления, нестабильности при заморозке/оттаивании, обесцвечивания и/или деамидирования антитела против CTLA-4. Настоящее изобретение включает в себя препараты антитела против CTLA-4, имеющие улучшенную химическую и/или физическую стабильность, по сравнению с описанными ранее композициями антител.

Следовательно, в определенных аспектах, настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, такой как EDTA, и моноклональное антитело против CTLA-4 или его часть, связывающуюся с антигеном. В других аспектах указанные выше жидкие композиции антитела против CTLA-4, содержащие хелатирующий агент, могут содержать дополнительные фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая, но, не ограничиваясь этим, один или несколько эксципиентов, которые выбираются из буферов, антиоксидантов, изотонических агентов, поверхностно-активных веществ и их смесей.

Настоящее изобретение предоставляет новые препараты для антитела против CTLA-4. Как здесь используется, фраза “антитело против CTLA-4” относится к любому антителу или к его части, которая способна связываться с любой частью полипептида, ассоциируемого с цитотоксичным T-лимфоцитарным белком 4 (“CTLA-4”), которая может присутствовать в любой животном или выделяться из него. В определенных вариантах осуществления полипептид CTLA-4 представляет собой полипептид CTLA-4 человека.

Антитела против CTLA-4, пригодные для использования вместе с настоящим изобретением, могут выбираться из поликлональных или моноклональных антител. В определенных аспектах моноклональное антитело против CTLA-4 может представлять собой антитело грызунов, химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. В дополнительных вариантах осуществления моноклональное антитело против CTLA-4 представляет собой моноклональное антитело против CTLA-4 человека.

В определенных вариантах осуществления антитела против CTLA-4, которые являются пригодными для использования вместе с настоящим изобретением, включают в себя те антитела против CTLA-4 и способы их получения, которые описаны в патенте США № 6682736, Hanson, et al., зарегистрированном 23 декабря 1999 года. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4, которые являются пригодными для использования вместе с настоящим изобретением, включают в себя те моноклональные антитела против CTLA-4, которые имеют последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи антитела, обозначенного 11.2.1 в патенте США № 6682736. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4, которые являются пригодными для использования вместе с настоящим изобретением, включают в себя те моноклональные антитела против CTLA-4, которые имеют последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи антител тицилимумаб и ипилимумаб. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4, которые являются пригодными для использования вместе с настоящим изобретением, включают в себя моноклональные антитела против CTLA-4, которые имеют последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи антитела тицилимумаб.

Как здесь используется, антитело, которое упоминается здесь под номером, имеет такие же последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи, как и моноклональное антитело, которое получают из гибридомы с таким же номером. Например, моноклональное антитело 11.2.1 имеет такие же последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи, как и антитело, полученное из гибридомы 11.2.1. Таким образом, упоминание антитела 11.2.1 включает в себя антитело, Ticilimumab^TM, которое имеет последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи, показанной в SEQ ID NOS. 2 и 4, и вариабельный домен тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO. 5, и вариабельный домен легкой цепи, показанной в SEQ ID NO. 6. Оно также включает в себя антитело, в котором отсутствует конечный лизин на тяжелой цепи, поскольку он обычно теряется в некоторой части антител во время получения.

В дополнение к этому, такие антитела против CTLA-4 могут выбираться на основе различий в последовательностях аминокислот в константной области их тяжелых цепей. Например, антитела против CTLA-4 могут выбираться из класса IgG, которые имеют тяжелые цепи типа “гамма”. Класс и подкласс антител против CTLA-4 могут определяться с помощью любого способа, известного в данной области. Как правило, класс и подкласс антитела могут определяться с использованием антител, которые являются специфичными к конкретному классу и подклассу антител. Такие антитела являются коммерчески доступными. Класс и подкласс могут определяться с помощью ELISA или Western Blot, а также других методик. Альтернативно, класс и подкласс могут определяться посредством секвенирования константных доменов, всех или их частей, тяжелых и/или легких цепей антител, сравнивая их последовательности аминокислот с известными последовательностями аминокислот различных классов и подклассов иммуноглобулинов, и определения класса и подкласса антител.

Антитело против CTLA-4 может представлять собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. В дополнительных вариантах осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой IgG и представляет собой подкласс IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Однако, как будет понятно, как правило, является нежелательным уничтожение клеток, экспрессирующих CTLA-4. Скорее, как правило, желают просто ингибировать связывание CTLA-4 с его лигандами для нарушения отрицательной регуляции T-лимфоцитов. Один из главных механизмов, посредством которого антитела уничтожают клетки, заключается в фиксации комплемента и в участии в CDC. Константная область антитела играет важную роль в связи со способностью антитела к фиксации комплемента и участием в CDC. Таким образом, как правило, выбирается изотип антитела либо для обеспечения способности к фиксации комплемента, либо нет. В случае настоящего изобретения, как правило, как указано выше, как правило, не является предпочтительным использование антитела, которое уничтожает клетки. Имеется ряд изотипов антител, которые способны к фиксации комплемента и CDC, включая, без ограничения, следующее: IgM грызунов, IgG2a грызунов, IgG2b грызунов, IgG3 грызунов, IgM человека, IgG1 человека и IgG3 человека. В противоположность этому, предпочтительные изотипы, которые не способны к фиксации комплемента и CDC, включают в себя, без ограничения, IgG2 человека и IgG4 человека. В дополнение к различиям в последовательностях тяжелых цепей, антитела IgG отличаются в пределах их подкласса на основе количества дисульфидных связей и длины шарнирной области. Например, подкласс IgG2 имеет несколько различий, отличающих его от других подклассов. Подклассы IgG2 и IgG4, как известно, имеют 4 дисульфидных связи в их шарнирной области, в то время как IgG1 имеет 2, а IgG3 имеет 11 дисульфидных связей. Другие различия для антител IgG2 включают в себя их пониженную способность проникать через плаценту и неспособность антител IgG2 связываться с рецепторами Fc лимфоцитов. Таким образом, в определенных вариантах осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой подкласс IgG2 или IgG4. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой подкласс IgG2.

В других вариантах осуществления, пригодные для использования антитела против CTLA-4 могут выбираться на основе различий в последовательностях аминокислот в их тяжелых цепях. Например, антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению могут иметь тяжелые цепи типа гамма человека, которые используют любой из следующих гермлайн-генов V_H человека: V_H1, V_H2, V_H3, V_H4 или V_H5. В определенных вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют гермлайн-ген V_H3 человека. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют гермлайн-ген V_H3 человека и вариабельную область тяжелой цепи DP-50 или DP-46 человека, а в других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют вариабельную область тяжелой цепи DP-50 человека. Ген DP-50 также упоминается как ген семейства V_H 3-33. Ген DP-46 также упоминается как ген семейства V_H 3-30.3. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют ген D_H человека, который выбирается из D1-26, DIR4 и DIR3, а в других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют ген D_H D1-26 человека. В дополнительных вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют ген человека J_H, который выбирается из J_H4 и J_H6, а в других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 используют ген J_H6 гена J_H человека.

В дополнительных вариантах осуществления антитела против CTLA-4 могут выбираться на основе различий в последовательности аминокислот в их легких цепях. Например, пригодные для использования антитела против CTLA-4 могут иметь легкие цепи лямбда или легкие цепи каппа. Однако, в определенных вариантах осуществления, антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению имеют легкие цепи каппа. В некоторых вариантах осуществления, где антитело против CTLA-4 содержит легкую цепь каппа, полинуклеотид, кодирующий вариабельный домен легкой цепи, включает в себя ген Vκ L5, O12, L2, B3, L15 или A27 человека и ген человека Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 или Jκ5. В некоторых вариантах осуществления, где антитело содержит легкую цепь каппа, вариабельный домен легкой цепи (V_L) частично кодируется геном VκO12 или VκA27 человека и геном Jκ3 или Jκ4 человека. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельной домен легкой цепи кодируется генами Vκ O12/Jκ3 человека.

Кроме того, антитело может содержать последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащую последовательности аминокислот CDR человека, полученные от гена V_H 3-30 или 3-33, или от его консервативных замещений или соматических мутаций. Понятно, что ген V_H 3-33 кодирует вариабельную область тяжелой цепи молекулы антитела от FR1 до FR3. Таким образом, настоящее изобретение охватывает антитело, которое разделяет, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 91%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 94%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 97%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, и наиболее предпочтительно, 100% идентичность с последовательностью антитела тицилимумаб от FR1 до FR3.

Кроме того, антитело может содержать области CDR в своей легкой цепи, полученные от гена A27 или O12, или оно может содержать области CDR антитела тицилимумаб.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитело ингибирует связывание между CTLA4 и B7-1, B7-2 или с ними обеими. Предпочтительно, антитело может ингибировать связывание с B7-1 при IC₅₀ примерно 100 нМ или ниже, более предпочтительно, примерно 10 нМ или ниже, например, примерно 5 нМ или ниже, еще более предпочтительно, примерно 2 нМ или ниже, или даже более предпочтительно, например, примерно 1 нМ или ниже. Подобным же образом, антитело может ингибировать связывание с B7-2 при IC₅₀ примерно 100 нМ или ниже, более предпочтительно, 10 нМ или ниже, например, даже более предпочтительно, примерно 5 нМ или ниже, еще более предпочтительно, примерно 2 нМ или ниже, или даже более предпочтительно, примерно 1 нМ или ниже.

Кроме того, в другом варианте осуществления антитело против CTLA4 имеет сродство при связывании с CTLA4 примерно 10^-8 или большее сродство, более предпочтительно, примерно 10^-9 или большее сродство, более предпочтительно, примерно 10^-10 или большее сродство, и даже более предпочтительно, примерно 10^-11 или большее сродство.

Антитело против CTLA4 включает в себя антитело, которое конкурирует за связывание с антителом, имеющим последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи антитела тицилимумаб. Кроме того, антитело против CTLA4 может конкурировать за связыванием с антителом ипилимумаб.

В другом варианте осуществления антитело предпочтительно перекрестно конкурирует с антителом, имеющим последовательность тяжелой и легкой цепи, последовательность вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепи и/или последовательности CDR тяжелой и легкой цепей антитела тицилимумаб. Например, антитело может связываться с эпитопом, с которым связывается антитело, которое имеет последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи, вариабельные последовательности и/или последовательности CDR антитела тицилимумаб. В другом варианте осуществления антитело перекрестно конкурирует с антителом, имеющим последовательности тяжелой и легкой цепи или последовательности, связывающиеся с антигеном, MDX-D010.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение осуществляется с использованием антитела против CTLA-4, которое содержит тяжелую цепь, содержащую последовательности аминокислот CDR-1, CDR-2 и CDR-3, и легкую цепь, содержащую последовательности аминокислот CDR-1, CDR-2 и CDR-3 антитела тицилимумаб, или последовательности, имеющие изменения, по сравнению с последовательностями CDR, выбранные из группы, состоящей из консервативных изменений, где консервативные изменения выбираются из группы, состоящей из замены неполярных остатков другими неполярными остатками, замены полярных заряженных остатков другими полярными незаряженными остатками, замены полярных заряженных остатков другими полярными заряженными остатками и замещения структурно сходных остатков; неконсервативных замещений, где неконсервативные замещения выбираются из группы, состоящей из замещения полярным заряженным остатком полярных незаряженных остатков и замещения неполярными остатками полярных остатков, дополнений и делеций.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит менее чем 10, 7, 5 или 3 изменения аминокислот, по сравнению с гермлайн-последовательностью в рамочных областях или областях CDR. В другом варианте осуществления антитело содержит менее чем 5 изменений аминокислот в рамочных областях и менее чем 10 изменения в областях CDR. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело содержит менее чем 3 изменения аминокислот в рамочных областях и менее чем 7 изменений в областях CDR. В предпочтительном варианте осуществления изменения в рамочных областях являются консервативными, а изменения в областях CDR представляют собой соматические мутации.

Еще более предпочтительно, антитело имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей по тяжелой цепи и легкой цепи, или с тяжелой цепью или легкой цепью, отдельно, с антителом тицилимумаб.

В другом варианте осуществления антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 94%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идентичность последовательностей или сходство последовательностей по полноразмерным последовательностям тяжелой и легкой цепи, или по тяжелой или легкой цепи, отдельно, с последовательностями гермлайн-VκA27, гермлайн-VκO12 и гермлайн-DP50 (который представляет собой аллель локуса гена V_H 3-33). Еще более предпочтительно, антитело имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей по последовательности тяжелой цепи с гермлайн-DP50 и/или с последовательностью легкой цепи гермлайн-A27 или гермлайн-O12.

В одном из вариантов осуществления антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 94%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идентичность последовательности (например, аминокислот, нуклеиновых кислот или как тех, так и других) или сходство последовательностей по последовательностям вариабельной области тяжелой и легкой цепи или по последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, отдельно, с последовательностями антитела 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, тицилимумаб, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, ипилимумаб. Даже более предпочтительно, антитело имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей по последовательностям вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, или с последовательностью тяжелой цепи или легкой цепи, отдельно, с антителом, выбранным из антитела 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, тицилимумаб, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, ипилимумаб.

В другом варианте осуществления антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 94%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идентичность последовательностей или сходство последовательностей по последовательности вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной последовательностью тяжелой цепи тяжелого гермлайн-DP50 (который представляет собой аллель локуса гена V_H 3-33) или с вариабельной последовательностью легкой цепи гермлайн-Vκ A27 или гермлайн-Vκ O12. Еще более предпочтительно, последовательность области тяжелой цепи антитела имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей с последовательностью гермлайн-DP50 или с последовательностью легкой цепи гермлайн-A27 или гермлайн-O12.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность последовательностей или сходство последовательностей с последовательностями тяжелой цепи, легкой цепи или их обеих, от FR1 до FR4, с последовательностями областей от FR1 до FR4 антитела тицилимумаб. Еще более предпочтительно, антитело имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей по последовательностям тяжелой, легкой цепи или их обеих, от FR1 до FR4, с антителом тицилимумаб.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, и наиболее предпочтительно, примерно 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей с последовательностями тяжелой цепи от FR1 до FR3 с последовательностями области от FR1 до FR3 гермлайн-DP50.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, и наиболее предпочтительно, примерно 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей с последовательностями легкой цепи от FR1 до FR4 с последовательностями области от FR1 до FR4 гермлайн-Vκ A27 или гермлайн-Vκ O12.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность последовательностей или сходство последовательностей с последовательностями тяжелой цепи, легкой цепи или их обеих, CDR-1, CDR-2 и CDR-3 антитела тицилимумаб. Еще более предпочтительно, антитело имеет 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей по последовательностям тяжелой, легкой цепи или их обеим, CDR-1, CDR-2 и CDR-3 антитела тицилимумаб.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, и наиболее предпочтительно, примерно 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей для последовательностей тяжелой цепи CDR-1 и CDR-2 с последовательностями CDR-1 и CDR-2 гермлайн-DP50.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, и наиболее предпочтительно, примерно 100% идентичность последовательностей или сходство последовательностей для последовательностей легкой цепи CDR-1, CDR-2 и CDR-3 с последовательностями CDR-1, CDR-2 и CDR-3 гермлайн-Vκ A27, или гермлайн-Vκ O12.

В одном из вариантов осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой антитело, известное как тицилимумаб.

Таблица 1 перечисляет деривацию гермлайн-гена человека для тяжелой цепи и легкой цепи для моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1 (то есть тицилимумаб).

Таблица 1
Клон	ДНК тяжелой цепи	ДНК легкой цепи
11.2.1	SEQ ID NO:	V_H	D_H	J_H	SEQ ID NO:	Vκ	Jκ
1 (цДНК) (полноразмерная)	DP-50 (3-33)	D1-26	6	3 (цДНК) (полноразмерная)	012	3

Некоторые антитела против CTLA-4 в соответствии с настоящим изобретением генерируются со смещением в сторону использования вариабельной области тяжелой цепи DP-50. Ген DP-50 также упоминается как ген семейства V_H 3-33. У мышей XenoMouse^TM имеется более 30 различных функциональных вариабельных генов тяжелой цепи, с помощью которых генерируются антитела. Следовательно, смещение представляет собой показатель предпочтительного мотива связывания взаимодействия антитело-антиген по отношению к объединенным свойствам связывания с антигеном и функциональной активности.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), в котором домены V_L и V_H спариваются, с образованием одновалентных молекул, посредством синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде одной белковой цепи. Bird et al., Science 242:423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой двойные антитела, то есть двухвалентные антитела, в которых домены V_H и V_L экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короткий, чтобы сделать возможным спаривание доменов на одной и той же цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два сайта связывания с антигеном. См., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), и Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994). В некоторых вариантах осуществления одна или несколько CDR из антитела по настоящему изобретению могут вводиться в молекулу либо ковалентно, либо нековалентно, делая ее иммуноадгезином, который специфично связывается с CTLA-4. В таких вариантах осуществления CDR могут вводиться как часть большей полипептидной цепи, могут ковалентно связываться с другой полипептидной цепью или могут вводиться нековалентно.

В другом варианте осуществления антитело против CTLA-4 имеет селективность (или специфичность) по отношению к CTLA-4, которая является, по меньшей мере, в 100 раз большей, чем его селективность по отношению к любому другому полипептиду. В некоторых вариантах осуществления антитело против CTLA-4 не демонстрирует никакого видимого специфичного связывания с любым другим белком, иным, чем CTLA-4. Можно определить селективность антитела против CTLA-4 по отношению к CTLA-4 с использованием способов, хорошо известных в данной области, следуя концепциям описания. Например, можно определить селективность, используя Western Blot, FACS, ELISA или RIA. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против CTLA-4 способно специфично связываться с CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления C-конечный лизин тяжелой цепи антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению не присутствует. В некоторых вариантах осуществления C-конечный лизин тяжелой цепи антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению не присутствует. В определенных аспектах настоящего изобретения антитело против CTLA-4, как правило, не содержит сигнального полипептида, поскольку сигнальный полипептид, как правило, устраняется во время пост-трансляционных модификаций. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, одна или обе, тяжелая и легкая цепи антитела против CTLA-4 содержат сигнальную последовательность (или часть сигнальной последовательности). В других вариантах осуществления настоящего изобретения ни тяжелая, ни легкая цепь антитела против CTLA-4 не содержит сигнальной последовательности.

Таблица 2 перечисляет идентификаторы последовательностей (SEQ ID NOS) нуклеиновых кислот, которые кодируют вариабельную область тяжелой и легкой цепей, и соответствующие предсказанные последовательности аминокислот для моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1.

Таблица 2
Антитело против CTLA-4 человека 11.2.1
	Идентификатор последовательности (SEQ ID NOS:)
MAb	Тяжелая	Легкая
цДНК	Аминокислота	цДНК	Аминокислота
11.2.1 (полноразмерная)	1	2	3	4

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует последовательность V_L аминокислот моноклонального антитела 11.2.1 (SEQ ID NO:4), или ее часть. В некоторых вариантах осуществления указанная часть содержит, по меньшей мере, область CDR2. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует последовательность аминокислот легкой цепи CDR указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления указанная часть представляет собой непрерывную часть, содержащую CDR1-CDR3. В определенных аспектах последовательность аминокислот легкой цепи CDR1 показывается посредством SEQ ID NO:10, последовательность аминокислот легкой цепи CDR2 - посредством SEQ ID NO:11 и последовательность аминокислот легкой цепи CDR3 - посредством SEQ ID NO:12.

В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность аминокислот V_L, которая является, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности аминокислот

V_L SEQ ID NO:4. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует последовательность аминокислот легкой цепи SEQ ID NO:4, или ее часть. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при очень строгих условиях, таких как те, которые описаны здесь, с последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей последовательность аминокислот легкой цепи SEQ ID NO:4.

В дополнительных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует, по меньшей мере, часть последовательность аминокислот V_H 11.2.1 (SEQ ID NO:2), или указанная последовательность имеет консервативные мутации аминокислот и/или в целом три или менее неконсервативных замещения аминокислот. В различных вариантах осуществления последовательность кодирует одну или несколько областей CDR, предпочтительно, область CDR3, все три области CDR, непрерывную часть, содержащую CDR1-CDR3, или всю область V_Hв целом. В определенных аспектах последовательность аминокислот CDR1 тяжелой цепи показывается посредством SEQ ID NO:7, последовательность аминокислот тяжелой цепи CDR2 - посредством SEQ ID NO:8 и последовательность аминокислот тяжелой цепи CDR3 - посредством SEQ ID NO:9.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность аминокислот V_H, которая является, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности аминокислот V_H SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует последовательность аминокислот тяжелой цепи SEQ ID NO:2 или ее часть. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при очень строгих условиях, таких как те, которые описаны выше, с последовательностью нуклеотидов, кодирующей последовательность аминокислот тяжелой цепи SEQ ID NO:2.

В определенных аспектах настоящее изобретение предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно выделенное антитело человека, которое связывается с CTLA-4, где антитело содержит последовательность аминокислот V_H, которая использует гермлайн-ген V_H 3-33 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, содержащий хелатирующий агент.

В других аспектах настоящее изобретение предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно выделенное антитело человека, которое связывается с CTLA-4, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, по меньшей мере, на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, по меньшей мере, на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO:4.

В других аспектах настоящее изобретение предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно выделенное антитело человека, которое связывается с CTLA-4, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, по меньше мере, на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, по меньше мере, на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO:4.

В других аспектах настоящее изобретение предоставляет жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно выделенное антитело человека, которое связывается с CTLA-4, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, по меньшей мере, на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, по меньшей мере, на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:4.

В других аспектах антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, которая содержит вариабельную область SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, которая содержит вариабельную область SEQ ID NO:4. В дополнительных аспектах антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи SEQ ID NO:5 и последовательность аминокислот легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:6. В дополнительных аспектах антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:4. В других аспектах антитело содержит последовательность аминокислот V_H, содержащую последовательности FR1, FR2 и FR3 человека, которые используют семейства генов V_H 3-33 человека, функционально связанных в рамке считывания с последовательностями CDR1, CDR2, и CDR3.

В одном из вариантов осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой тицилимумаб (также известный как CP-675,206), которое имеет последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи антитела тицилимумаб.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела против CTLA-4 специфично связываются с конформационным эпитопом CTLA-4 человека. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 ингибируют рост опухоли у человека после введения субъекту.

Приготовление препаратов моноклонального антитела против CTLA-4

Антитело против CTLA-4, как правило, приготавливается в виде фармацевтической композиции для парентерального введения субъекту. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию.

Композиции по настоящему изобретению содержат одно или несколько моноклональных антител против CTLA-4 по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые содержат гистидин и/или хелатирующий агент. Жидкие препараты по настоящему изобретению содержат одно или несколько моноклональных антител против CTLA-4 по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые содержат гистидин и/или хелатирующий агент.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к препаратам, которые находятся в такой форме, чтобы сделать возможной биологическую активность активных ингредиентов. "Фармацевтически приемлемые эксципиенты” (носители, добавки) представляют собой такие, которые могут разумным образом (то есть безопасно) вводиться субъекту для создания эффективной дозы используемого активного ингредиента. Термин "эксципиент" или “носитель”, как здесь используется, относится к инертному веществу, которое повсеместно используется в качестве разбавителя, носителя, консерванта, связующего или стабилизирующего агента для лекарственных средств. Как здесь используется, термин "разбавитель" относится к фармацевтически приемлемому (безопасному и нетоксичному при введении человеку) растворителю и используется для приготовления жидких препаратов. Пример разбавителей включает в себя, но, не ограничиваясь этим, стерильную воду и бактериостатическую воду для инъекций (BWFI).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на жидкую фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CTLA-4 и EDTA. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4 и DTPA.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и фармацевтически приемлемый буфер. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, EDTA и гистидин. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA4, DTPA и гистидин.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и фармацевтически приемлемый изотонический агент. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и трегалозу. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, EDTA и трегалозу. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, DTPA и трегалозу.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, EDTA и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, DTPA и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, выбранный из группы, состоящей из EDTA и DTPA, и полисорбат 80.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый буфер и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, гистидин и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, гистидин и полисорбат 80.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, фармацевтически приемлемый буфер и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, фармацевтически приемлемый буфер, фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество и фармацевтически приемлемый изотонический агент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на композицию, содержащую антитело против CTLA-4 и гистидин.

Антитело против CTLA-4, присутствующее в композиции, может быть таким, как описано ранее в настоящей заявке. В одном из вариантов осуществления композиция содержит антитело против CTLA-4, содержащее последовательность аминокислот V_L, которая является на 90%, 95% или 99% идентичной последовательности аминокислот

V_L, показанной в SEQ ID NO:4, и дополнительно содержит последовательность аминокислот V_H, которая является на 90%, 95% или 99% идентичной последовательности аминокислот V_H, показанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело против CTLA-4, которое представляет собой моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1.

Антитело против CTLA-4, присутствующее в жидких фармацевтических композициях, может быть таким, как описано ранее в настоящей заявке. В одном из вариантов осуществления жидкие фармацевтические композиции содержат антитело против CTLA-4, содержащее последовательность аминокислот V_L, которая является на 90%, 95% или 99% идентичной последовательности аминокислот V_L, показанной в SEQ ID NO:4, и дополнительно содержит последовательность аминокислот V_H, которая является на 90%, 95%, или 99% идентичной последовательности аминокислот V_H, показанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит антитело против CTLA-4, которое представляет собой моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1.

Концентрация антитела против CTLA-4 в жидких фармацевтических композициях по настоящему изобретению составляет, как правило, по меньшей мере, примерно 0,1 миллиграмма на миллилитр (мг/мл) или выше, по меньшей мере, примерно 1,0 мг/мл или выше, по меньшей мере, примерно 10 мг/мл или выше, по меньшей мере, примерно 50 мг/мл или выше, по меньшей мере, примерно 100 мг/мл или выше, или, по меньшей мере, примерно 200 мг/мл или выше. В определенных вариантах осуществления концентрация антитела против CTLA-4, как правило, находится в пределах от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 70 мг/мл, от примерно 2.0 мг/мл до примерно 65 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 35 мг/мл, от примерно 15 мг/мл до примерно 25 мг/мл, или примерно 20 мг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация антитела против CTLA-4 в жидкой фармацевтической композиции находится в пределах от примерно 50 мг/мл до примерно 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления могут использоваться более высокие концентрации антитела, когда композиция предназначается для подкожной доставки.

Как здесь используется, термин “хелатирующий агент”, как правило, относится к эксципиенту, который может образовывать, по меньшей мере, одну связь (например, ковалентную, ионную или иную) с ионом металла. Хелатирующий агент, как правило, представляет собой мультидентаный лиганд, который может использоваться в выбранных жидких композициях в качестве стабилизатора комплексообразования с частицами, которые могут способствовать нестабильности. Часто соединения, которые могут действовать в качестве хелатирующего агента, будут иметь обогащенные электронами функциональные группы. Соответствующие обогащенные электронами функциональные группы включают в себя группы карбоновой кислоты, гидроксигруппы и аминогруппы. Размещение этих групп в аминополикарбоновых кислотах, гидроксиполикарбоновых кислотах, гидроксиаминокарбоновых кислотах и тому подобное приводит к получению остатков, которые имеют способность к связыванию с металлами.

Однако настоящее изобретение, как подразумевается, не ограничивается хелатирующими агентами, прежде всего, по способности хелатирующих агентов образовывать связи с ионом металла. По этой причине настоящее изобретение, как подразумевается, не является ограниченным любым конкретным механизмом, посредством которого хелатирующий агент действует в препаратах по настоящему изобретению, и эксципиенты, определенные здесь как хелатирующие агенты, могут приобретать свои свойства посредством механизмов, которые, все вместе, не связаны со способностью хелатирующих агентов к образованию связей с ионами металлов.

Хелатирующие агенты, которые являются пригодными для использования в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваясь этим, аминополикарбоновые кислоты, гидроксиаминокарбоновые кислоты, N-замещенные глицины, 2-(2-амино-2-оксоктил)аминоэтансульфоновую кислоту (BES), дефероксамин (DEF), лимонную кислоту, ниацинамид и дезоксихолаты. Примеры соответствующих аминополикарбоновых кислот включают в себя этилендиаминтетрауксную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту 5 (DTPA), нитрилотриуксусную кислоту (NTA), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусную кислоту (ADA), бис(аминоэтил)гликолевый эфир, N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (EGTA), транс-диаминоциклогексан тетрауксусную кислоту (DCTA), глютаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. Примеры соответствующих гидроксиаминокарбоновых кислот включают в себя N- гидроксиэтилиминодиуксусную кислоту (HIMDA), N,N-бис-гидроксиэтилглицин (бицин) и N-(трисгидроксиметилметил)-10-глицин (трицин). Пример соответствующего N-замещенного глицина представляет собой глицилглицин. Пример соответствующего дезоксихолата представляет собой натрийдезоксихолат. Смеси двух или более хелатирующих агентов также охватываются настоящим изобретением.

Хелатирующие агенты, используемые в настоящем изобретении, могут присутствовать, когда возможно, в форме свободной кислоты или свободного основания соединения (например, упоминаемого здесь взаимозаменяемо как “EDTA” или “эдетат”) или в форме соответствующей соли (например, соответствующей кислотно-аддитивной соли или основно-аддитивной соли, такой как динатрий эдетат). Соответствующие кислотно-аддитивные соли, например, включают в себя соли щелочного металла (например, соли натрия или калия), соли щелочноземельного металла (например, соли кальция) и соли, которые могут быть получены с использованием других слабо связывающихся ионов металла. Как известно в данной области, природа соли и количество зарядов, которые должны нейтрализоваться, будут зависеть от количества присутствующих карбоксильных групп и от pH, при котором подается стабилизирующий хелатирующий агент. Также, как известно в данной области, хелатирующие агенты имеют различную силу, с которой связываются конкретные целевые ионы. В качестве дополнительной иллюстрации соответствующие соли EDTA включают в себя дикалий эдетат, динатрий эдетат, кальций динатрий эдетат, эдетат натрия, тринатрий эдетат и эдетат калия; и соответствующая соль дефероксамина (DEF) представляет собой дефероксамин мезилат (DFM).

Хелатирующие агенты, используемые в настоящем изобретении, могут присутствовать как безводная, сольватированная или гидратированная форма соединения или соответствующей соли. Когда хелатирующий агент находится в сольватированной или гидратированной форме, он может находиться в различных состояниях сольватирования или гидратирования (включая, например, безводную, гидратированную, дигидратированную и тригидратированную формы). В качестве дополнительной иллюстрации соответствующий гидрат EDTA представляет собой динатрий EDTA дигидрат; а соответствующие формы лимонной кислоты включают в себя безводную лимонную кислоту, моногидрат лимонной кислоты и тринатрий цитрат дигидрат.

Соответствующие хелатирующие агенты, используемые в композициях антител по настоящему изобретению, также включают в себя, например, те, которые связываются с ионами металлов в растворе, чтобы сделать их неспособными к взаимодействию с доступным O₂, тем самым, сводя к минимуму или предотвращая генерирование гидроксильных радикалов, которые могут свободно взаимодействовать с антителом и деградировать его. Хелатирующие агенты могут уменьшить образование восстановленных частиц кислорода, уменьшить образование кислотных частиц (например, деамидирование), уменьшить агрегацию антител и/или уменьшить фрагментацию антител в композициях по настоящему изобретению. Такие хелатирующие агенты могут уменьшить или предотвратить деградацию антитела, которое приготавливается без защиты хелатирующего агента.

Когда упоминается концентрация хелатирующего агента, подразумевается, что упомянутая концентрация представляет собой молярную концентрацию форм свободной кислоты или свободного основания хелатирующего агента. Например, концентрация хелатирующего агента в определенных жидких фармацевтических композициях, как правило, находится в пределах от примерно 0,01 микромоля до примерно 50 миллимолей, от примерно 1 микромоля до примерно 10,0 миллимолей, от примерно 15 микромолей до примерно 5,0 миллимолей, от примерно 0,01 миллимоля до примерно 1,0 миллимоля или от примерно 0,03 миллимоля до примерно 0,5 миллимоля. В определенных вариантах осуществления концентрация хелатирующего агента в жидкой фармацевтической композиции может составлять примерно 0,01 миллимоля, 0,02 миллимоля, 0,027 миллимоля, 0,03 миллимоля, примерно 0,04 миллимоля, примерно 0,05 миллимоля, примерно 0,06 миллимоля, примерно 0,07 миллимоля, примерно 0,10 миллимоля, примерно 0,20 миллимоля, примерно 0,26 миллимоля, примерно 0,27 миллимоля, примерно 0,30 миллимоля, примерно 0,31 миллимоля, примерно 0,34 миллимоля, примерно 0,40 миллимоля, примерно 0,50 миллимоля или примерно 1,0 миллимоля. В определенных вариантах осуществления концентрация хелатирующего агента составляет примерно 0,027 миллимоля, примерно 0,05 миллимоля, примерно 0,13 миллимоля или примерно 0,27 миллимоля. В одном из вариантов осуществления концентрация хелатирующего агента составляет примерно 0,05 миллимоля. В другом варианте осуществления концентрация хелатирующего агента составляет примерно 0,13 миллимоля.

Если не указано иного, концентрации, перечисленные здесь, представляют собой концентрации при условиях окружающей среды (то есть при 25°C и атмосферном давлении). Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше диапазонам концентраций хелатирующего агента, как предполагается, также являются частью настоящего изобретения. Например, диапазоны значений, использующие сочетание любого из перечисленных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться.

В одном из вариантов осуществления хелатирующий агент выбирается из группы, состоящей из EDTA, DTPA, DFM и их смесей. В другом варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой DFM. В другом варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой EDTA. В другом варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой DTPA. В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит EDTA в количестве, которое, как правило, находится в пределах от примерно 0,01 микромоля до примерно 50 миллимолей, от примерно 1 микромоля до примерно 20,0 миллимолей, от примерно 15 микромолей до примерно 10,0 миллимолей, от примерно 0,01 миллимоля до примерно 5,0 миллимолей или от примерно 0,03 миллимоля до примерно 1 миллимоля. В определенных вариантах осуществления концентрация EDTA в жидкой фармацевтической композиции может составлять примерно 0,01 миллимоля, 0,02 миллимоля, 0,027 миллимоля, 0,03 миллимоля, примерно 0,04 миллимоля, примерно 0,05 миллимоля, примерно 0,06 миллимоля, примерно 0,07 миллимоля, примерно 0,10 миллимоля, примерно 0,20 миллимоля, примерно 0,26 миллимоля, примерно 0,27 миллимоля, примерно 0,30 миллимоля, примерно 0,31 миллимоля, примерно 0,34 миллимоля, примерно 0,40 миллимоля, примерно 0,50 миллимоля или примерно 1,0 миллимоль. В определенных вариантах осуществления концентрация EDTA составляет примерно 0,027 миллимоля, примерно 0,05 миллимоля, примерно 0,13 миллимоля или примерно 0,27 миллимоля. В одном из вариантов осуществления, концентрация EDTA составляет примерно 0,05 миллимоля. В другом варианте осуществления концентрация EDTA составляет примерно 0,13 миллимоля. В другом варианте осуществления, жидкая фармацевтическая композиция содержит EDTA в количестве примерно 0,27 миллимоля.

Как отмечено выше, композиции по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый буфер, в дополнение к хелатирующему агенту. Как здесь используется, термин "буфер" относится к добавленной композиции, которая делает возможным приготовление жидкого антитела, чтобы противостоять изменениям pH. В определенных вариантах осуществления добавленный буфер делает возможным приготовление жидкого антитела, чтобы противостоять изменениям pH посредством действия его сопряженных компонентов кислота-основание.

Например, препарат с буфером может быть получен посредством добавления L-гистидин-HCl (L-гистидин-гидрохлорида) и L-гистидина в соответствующих количествах для достижения желаемого pH. Однако в других вариантах осуществления добавленный буфер делает возможным приготовление жидкого антитела, чтобы противостоять изменениям pH посредством действия его сопряженных компонентов кислота-основание. В качестве второго примера препарат с буфером может быть приготовлен посредством добавления кислоты, такой как хлористоводородная кислота, и L-гистидина в соответствующих количествах для достижения желаемого pH.

Примеры соответствующих буферов включают в себя, но не ограничиваясь этим, ацетат (например, ацетат натрия), сукцинат (например, сукцинат натрия), глюконат, цитрат (например, и буферы на основе других органических кислот, включая, но не ограничиваясь этим, буферы, такие как аминокислоты (например, гистидин), уксусная кислота, фосфорная кислота и фосфаты), аскорбат, винная кислота, малеиновая кислота, глицин, лактат, молочная кислота, аскорбиновая кислота, имидазолы, угольная кислота и бикарбонаты, янтарная кислота, натрийбензойная кислота и бензоаты, глюконат, эдетат (EDTA), ацетат, малат, имидазол, трис, фосфат и их смеси. В одном из вариантов осуществления буфер представляет собой ацетат.

В другом варианте осуществления буфер представляет собой гистидин. Исходный материал гистидина, используемый для получения композиций по настоящему изобретению, может существовать в различных формах. Например, гистидин может представлять собой энантиомерную (например, L- или D-энантиомер) или рацемическую форму гистидина, форму свободной кислоты или свободного основания гистидина, форму соли (например, моногидрохлоридной, дигидрохлоридной, гидробромидной, сульфатной или ацетатной соли) гистидина, сольватированную форму гистидина, гидратированную форму (например, моногидрата) гистидина или безводную форму гистидина. Чистота основания и/или соли гистидина, используемой для получения композиций, как правило, может составлять, по меньшей мере, примерно 98%, по меньшей мере, примерно 99%, или, по меньшей мере, примерно 99,5%. Как здесь используется, термин "чистота" в контексте гистидина относится к химической чистоте гистидина, как понимается в данной области, например, как описано в Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).

Когда упоминается концентрация буфера, подразумевается, что упомянутая концентрация представляет собой молярную концентрацию формы свободной кислоты или свободного основания буфера. Например, концентрация буфера, когда он присутствует в определенных жидких фармацевтических композициях, может находиться в пределах от примерно 0,1 миллимоля (мМ) до примерно 100 мМ. В одном из вариантов осуществления, концентрация буфера составляет от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ. В другом варианте осуществления концентрация буфера составляет от примерно 5 мМ до примерно 30 мМ. В различных вариантах осуществления концентрация буфера составляет примерно 1 мМ, примерно 5 мМ, примерно 10 мМ, примерно 15 мМ, примерно 20 мМ, примерно 25 мМ, примерно 30 мМ, примерно 35 мМ, примерно 40 мМ, примерно 45 мМ, примерно 50 мМ, примерно 55 мМ, примерно 60 мМ, примерно 65 мМ, примерно 70 мМ, примерно 75 мМ, примерно 80 мМ, примерно 85 мМ, примерно 90 мМ, примерно 95 мМ или примерно 100 мМ. В одном из вариантов осуществления концентрация гистидина в фармацевтической композиции составляет примерно 10 мМ. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит примерно 10 мМ L-гистидина (в форме основания). В другом варианте осуществления концентрация гистидина в фармацевтической композиции составляет примерно 20 мМ. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит примерно 20 мМ L-гистидина (в форме основания). Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше диапазонам концентраций гистидина, как подразумевается, также должны быть частью настоящего изобретения. Например, диапазоны значений, использующих сочетания любых из указанных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться.

Как правило, буфер используется для поддержания приемлемого уровня pH (который может влиять на стабильность антитела) в жидких фармацевтических композициях. Жидкая фармацевтическая композиция, как правило, дополняется буфером для поддержания pH в пределах от примерно 4 до примерно 8; от примерно 4,5 до примерно 7; от примерно 5,0 до примерно 6,5 или от примерно 5,3 до примерно 6,3. Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше диапазонам pH, как подразумевается, также должны быть частью настоящего изобретения. Например, диапазоны значений с использованием сочетания любых из указанных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться. В одном из вариантов осуществления жидкая фармацевтическая композиция дополняется буфером для поддержания pH примерно 5,5. В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция дополняется буфером для поддержания pH примерно 6,0.

Как отмечается выше, композиции по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый изотонический агент в дополнение к хелатирующему агенту. Как здесь используется, термины “изотонический агент” или “тонический агент” относится к эксципиенту, который может устанавливать осмотическое давление в жидком препарате антитела. В определенных вариантах осуществления изотонический агент может устанавливать осмотическое давление в жидком препарате антитела как изотоническое, так что препарат антитела является физиологически совместимым с клетками ткани тела субъекта. В других вариантах осуществления “изотонический агент” может вносить вклад в улучшение стабильности любого из антител против CTLA-4, описанных здесь. "Изотонический" препарат представляет собой такой, который имеет по существу такое же осмотическое давление, как и кровь человека. Изотонические препараты, как правило, имеют осмотическое давление примерно от 250 до 350 мОсм. Термин "гипотонический" описывает препарат с осмотическим давлением ниже, чем в крови человека. Соответственно, термин "гипертонический" используется для описания препарата с осмотическим давлением выше, чем в крови человека. Изотоничность может измеряться с использованием давления паров или осмометра, например, типа с заморозкой на льду.

Изотонический агент, используемый для получения композиций по настоящему изобретению, может существовать в различных формах. Когда упоминается изотонический агент, подразумевается, что все эти различные формы охватываются под наименованием изотонического агента. Например, изотонический агент может находиться в энантиомерной (например, L- или D-энантиомер) или рацемической форме; в форме изомеров, таких как альфа или бета, включая альфа, альфа; или бета, бета; или альфа, бета; или бета, альфа; в форме свободной кислоты или свободного основания; в гидратированной форме (например, моногидрат) или безводной форме.

В одном из вариантов осуществления изотонический агент представляет собой сахарид. Как здесь используется, термин "сахарид" относится к классу молекул, которые являются производными многоатомных спиртов. Сахариды повсеместно упоминаются как углеводы и могут содержать различные количества единиц сахара (сахарида), например моносахариды, дисахариды и полисахариды. Сахариды, которые являются пригодными для использования в качестве изотонического агента в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваясь этим, сахариды, выбранные из группы, состоящей из фруктозы, глюкозы, маннозы, сорбозы, ксилозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, декстрана, пуллулана, декстрина, циклодекстринов, растворимого крахмала, гидроксиэтилкрахмала, водорастворимых глюканов и их смесей.

В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой полиол. Как здесь используется, термин “полиол” относится к эксципиенту с множеством гидроксильных групп и включает в себя сахара (восстанавливающие и невосстанавливающие сахара), сахарные спирты и сахарные кислоты. В одном из вариантов осуществления полиол имеет молекулярную массу, которая меньше, примерно, чем 600 кДа (например, в пределах от примерно 120 до примерно 400 кДа). "Восстанавливающий сахар" представляет собой такой, который содержит гемиацеталевую группу, которая может восстанавливать ионы металлов или взаимодействовать ковалентно с лизином и другими амино группами в белках, и "невосстанавливающий сахар" представляет собой такой, который не имеет этих свойств восстанавливающего сахара. Полиолы, которые являются пригодными для использования в качестве изотонического агента в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваясь этим, полиолы, выбранные из группы, состоящей из маннита, трегалозы, сорбита, эритритола, изомалата, лактитола, мальтитола, ксилитола, глицерина, лактитола, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, инозитола и их смесей. В одном из вариантов осуществления изотонический агент представляет собой невосстанавливающий сахар, выбранный из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы и их смесей.

В одном из вариантов осуществления изотонический агент представляет собой маннит. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой D-маннит. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой трегалозу. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой α,α-трегалоза дигидрат. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой сахарозу.

В одном из вариантов осуществления концентрация изотонического агента в жидкой фармацевтической композиции находится в пределах от примерно 1 миллимоля до примерно 600 миллимолей, от примерно 1 миллимоля до примерно 400 миллимолей, от примерно 1 миллимоля до примерно 300 миллимолей или от примерно 200 миллимолей до примерно 275 миллимолей. В другом варианте осуществления, изотонический агент представляет собой маннит и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 247 миллимолей. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой трегалозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 222 миллимолей. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой трегалозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 238 миллимолей. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой сахарозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 263 миллимолей.

В одном из вариантов осуществления концентрация изотонического агента в жидкой фармацевтической композиции находится в пределах от примерно 1 мг/мл до примерно 300 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 200 мг/мл или от примерно 50 мг/мл до примерно 150 мг/мл. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой маннит и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 45 мг/мл. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой трегалозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 84 мг/мл. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой трегалозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрация примерно 90 мг/мл. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой сахарозу и присутствует в жидкой фармацевтической композиции при концентрации примерно 90 мг/мл.

В одном из вариантов осуществления изотонический агент представляет собой соль, такую как хлорид натрия. В одном из вариантов осуществления, когда изотонический агент представляет собой соль, концентрация соли в жидкой фармацевтической композиции находится в пределах от примерно 1 мг/мл до примерно 20 мг/мл. В другом варианте осуществления изотонический агент представляет собой хлорид натрия и концентрация хлорида натрия в жидкой фармацевтической композиции составляет примерно 8,18 мг/мл.

Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше диапазонам концентраций изотонического агента, как подразумевается, также должны быть частью настоящего изобретения. Например, пределы значений с использованием сочетания любых из указанных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться.

Как отмечается выше, композиции по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в дополнение к хелатирующему агенту. Как здесь используется, термин “поверхностно-активное вещество” относится к эксципиенту, который может менять поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В определенных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество понижает поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В других вариантах осуществления “поверхностно-активное вещество” может вносить вклад в улучшение стабильности любых антител против CTLA-4, описанных здесь. Например, поверхностно-активное вещество может понижать агрегацию приготовленного антитела, и/или сводить к минимуму образование частиц в препарате, и/или уменьшать адсорбцию. Поверхностно-активное вещество может также улучшать стабильность антитела во время и после циклов заморозки/оттаивания.

Соответствующие поверхностно-активные вещества включают в себя поверхностно-активные вещества на основе полисорбатов, полоксамеры (например, полоксамер 18 и 407), поверхностно-активные вещества тритон, такие как Triton X-100®, поверхностно-активные вещества на основе полисорбатов, такие как Tween 20® и Tween 80®, натрий додецил сульфат, натрий лаурелсульфат, натрий октилгликозид, лаурил-сульфобетаин, миристил-сульфобетаин, линолеил-сульфобетаин, стеарил-сульфобетаин, лаурил-саркозин, миристил-саркозин, линолеил-саркозин, стеарил-саркозин, линолеил-бетаин, миристил-бетаин, цетил-бетаин, лауроамидопропил-бетаин, кокамидопропил-бетаин, линолеамидопропил-бетаин, миристамидопропил-бетаин, пальмидопропил-бетаин, изостеарамидопропил-бетаин, миристамидопропил-диметиламин, пальмидопропил-диметиламин, изостеарамидопропил-диметиламин, натрий метилкокоил-таурат, динатрий метил олеил-таурат, дигидроксипропил PEG 5 линолеаммонийхлорид, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль и их смеси.

В одном из вариантов осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой поверхностно-активное вещество на основе полисорбата, включающего в себя, по меньшей мере, один эксципиент, который выбирается из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 21, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 61, полисорбата 65, полисорбата 80, полисорбата 81, полисорбата 85 и их смесей. В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит полисорбат 80.

Концентрация поверхностно-активного вещества, когда оно присутствует в композиции, как правило, находится в пределах от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,05 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл, или от примерно 0,2 мг/мл до примерно 0,7 мг/мл. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в количестве, которое составляет примерно 0,2 мг/мл. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в количестве, которое составляет примерно 0,5 мг/мл. В одном из вариантов осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит примерно 0,2 мг/мл полисорбата 80. В другом варианте осуществления, жидкая фармацевтическая композиция содержит примерно 0,4 мг/мл полисорбата 80. В другом варианте осуществления, жидкая фармацевтическая композиция содержит примерно 0,5 мг/мл полисорбата 80.

Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше диапазонам концентраций поверхностно-активного вещества, как подразумевается, также должны быть частью настоящего изобретения. Например, диапазоны значений с использованием сочетания любых из указанных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться.

Композиции по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый антиоксидант в дополнение к хелатирующему агенту. Соответствующие антиоксиданты включают в себя, но не ограничиваясь этим, метионин, тиосульфат натрия, каталазу и платину. Например, жидкая фармацевтическая композиция может содержать метионин при концентрации, которая находится в пределах от 1 мМ до примерно 100 мМ, и в частности, составляет примерно 27 мМ.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает композицию, содержащую, по меньшей мере, одно моноклональное антитело против CTLA человека, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно моноклональное антитело против CTLA человека, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и хелатирующий агент.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает жидкую фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, одно антитело, содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и дополнительно содержащее последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 95% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4, где антитело связывается с CTLA-4 человека; и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция содержит концентрацию антитела, которая находится в пределах от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл.

В одном из вариантов осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,01 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и от примерно 0,3 микромоля до примерно 50 миллимолей хелатирующего агента.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей хелатирующего агента.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и примерно 0,27 миллимоля хелатирующего агента.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и от примерно 0,3 микромоля до примерно 50 миллимолей EDTA.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и от примерно 0,1 миллимоля до примерно 1,0 миллимоля EDTA.

В одном из вариантов осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,01 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб и от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей хелатирующего агента и от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей хелатирующего агента; от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы и от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей хелатирующего агента; от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы; от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина и от примерно 0,005 миллимоля до примерно 10 миллимолей полисорбата 80.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей EDTA; от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей изотонического агента; от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ буфера и от примерно 0,005 миллимоля до примерно 10 миллимолей поверхностно-активного вещества.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей EDTA; от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей изотонического агента; от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина и от примерно 0,005 миллимоля до примерно 10 миллимолей поверхностно-активного вещества.

В другом варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей EDTA; от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы; от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина и от примерно 0,005 миллимоля до примерно 10 миллимолей поверхностно-активного вещества.

В определенных аспектах настоящего изобретения жидкая композиция антитела против CTLA-4 содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 200 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина; от примерно 0,005 миллимоля до примерно 10 миллимолей полисорбата 80; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей EDTA и от примерно 10 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы.

В других аспектах настоящего изобретения жидкая композиция антитела против CTLA-4 содержит от примерно 1,0 мг/мл до примерно 100 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 10 мМ до примерно 50 мМ гистидина; от примерно 0,01 миллимоля до примерно 1,0 миллимоля полисорбата 80; от примерно 3 микромолей до примерно 5,0 миллимолей EDTA и от примерно 100 миллимолей до примерно 300 миллимолей трегалозы.

В других аспектах настоящего изобретения жидкая композиция антитела против CTLA-4 содержат от примерно 10 мг/мл до примерно 50 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; от примерно 10 мМ до примерно 30 мМ гистидина; от примерно 0,05 миллимоля до примерно 0,5 миллимоля полисорбата 80; от примерно 0,1 миллимоля до примерно 1 миллимоля EDTA и от примерно 200 миллимолей до примерно 250 миллимолей трегалозы.

В других аспектах настоящего изобретения жидкая композиция антитела против CTLA-4 содержит примерно 20 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 тицилимумаб; примерно 20 мМ гистидина; примерно 0,15 миллимоля полисорбата 80; примерно 0,27 миллимоля EDTA и примерно 222 миллимолей трегалозы.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450; от примерно 0,0001 до примерно 100; от примерно 0,005 до примерно 50; от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450; от примерно 0,0001 до примерно 100; от примерно 0,005 до примерно 50; от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин; где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля, молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей и молярная концентрация гистидина находится в пределах от примерно 1 миллимоля до примерно 100 миллимолей; и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450; от примерно 0,0001 до примерно 100; от примерно 0,005 до примерно 50; от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин; где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля, молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей и молярная концентрация гистидина находится в пределах от примерно 10 миллимолей до примерно 50 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,0001 до примерно 100; от примерно 0,005 до примерно 50; от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин; где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля, молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей и молярная концентрация гистидина находится в пределах от примерно 10 миллимолей до примерно 30 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,005 до примерно 50; от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин; где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля, молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей и молярная концентрация гистидина находится в пределах от примерно 10 миллимолей до примерно 30 миллимолей, и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на стабильную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую тицилимумаб, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент и гистидин; где молярная концентрация антитела находится в пределах от примерно 0,0006 миллимоля до примерно 1,35 миллимоля, молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 миллимоля до примерно 50 миллимолей и молярная концентрация гистидина составляет примерно 20 миллимолей; и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,001 до примерно 10; от примерно 0,01 до примерно 5; от примерно 0,1 до примерно 1 или составляет примерно 0,5.

Способы продуцирования антитела против CTLA-4 и линии клеток, продуцирующие антитела

Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены посредством использования трансгенной мыши, которая имеет вставленную достаточную часть генома, продуцирующего антитело человека, но которая делается дефицитной относительно продуцирования эндогенных, мышиных антител. Такие мыши затем становятся способными к продуцированию молекул иммуноглобулинов человека и антител и являются дефицитными относительно продуцирования молекул мышиных иммуноглобулинов и антител. Технологии, используемые для достижения этого, обсуждаются ниже.

Является возможным производство трансгенных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный спектр антител человека в отсутствие продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. В частности, однако, один из вариантов осуществления трансгенного производства мышей и антител из них описан в патенте США № 6682736, Hanson, et al. Посредством использования такой технологии могут быть получены антитела, которые связываются с CTLA-4, и гибридомы, продуцирующие такие антитела.

Антитела человека исключают потенциальные проблемы, связанные с антителами, которые имеют вариабельные и/или константные области мышей или крыс. Присутствие таких белков, полученных от мышей или крыс, может приводить к быстрому распознаванию антител или может приводить к генерированию иммунной реакции против антитела у субъекта, который принимает введение таких антител.

Например, описано, что гомозиготная делеция гена области присоединения тяжелой цепи антитела (J_H) у химерных и гермлайн-мутантных мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенных антител. Перенос генной матрицы гермлайн-иммуноглобулина человека в таких гермлайн-мутантнхе мышей будет приводить к продуцированию антител человека при антигенном (например, CTLA-4) провоцировании. См., например, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). Антитела человека могут также быть получены из библиотек фаговых дисплеев (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. MoL Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)).

В некоторых вариантах осуществления антитела против CTLA-4 человека могут быть получены посредством иммунизации трансгенного животного не-человека, например мышей XENOMOUSE^TM, геном которых содержит гены иммуноглобулина человека, так что рекомбинантная мышь продуцирует антитела человека. Мыши XENOMOUSE^TM представляют собой штаммы мышей, которые получены посредством генной инженерии, содержат большие фрагменты локусов тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулинов человека и являются дефицитными относительно продуцирования антител мыши. Мыши XENOMOUSE^TM продуцируют сходный с взрослым человеком спектр вполне человеческих антител и генерируют антиген-специфичные антитела человека. В некоторых вариантах осуществления мыши XENOMOUSE^TM содержат приблизительно 80% генного спектра антитела V человека посредством введения фрагментов локусов тяжелой цепи человека и локуса каппа легкой цепи человека искусственной хромосомы дрожжей (YAC) гермлайн-конфигурации, размером порядка нескольких мегапар оснований. В других вариантах осуществления мыши XENOMOUSE^TM дополнительно содержат приблизительно весь локус лямбда легкой цепи. См., например, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) и патенты США №№ 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 и 6150584. См. также заявки на Международные патенты WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 и WO 00/037504.

В некоторых вариантах осуществления животное не-человек, содержащее гены иммуноглобулинов человека, представляет собой животное, которое имеет “минилокус” иммуноглобулинов человека. В подходе, основанном на минилокусе, локус экзогенного Ig воспроизводится посредством включения индивидуальных генов из локуса Ig. Таким образом, один или несколько генов V_H, один или несколько генов D_H, один или несколько генов J_H, константный домен mu и второй константный домен (предпочтительно гамма константный домен) формируются в виде конструкта для инсерции в животное. Этот подход описывается, среди прочего, в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления антитела человека могут производиться посредством иммунизации животного не-человека, содержащего в своем геноме некоторые или все локусы тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулинов человека, с помощью антигена CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления антиген CTLA-4 представляет собой выделенный и/или очищенный CTLA-4. В предпочтительном варианте осуществления антиген CTLA-4 представляет собой CTLA-4 человека. В некоторых вариантах осуществления антиген CTLA-4 представляет собой фрагмент CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления фрагмент CTLA-4 содержит, по меньшей мере, один эпитоп CTLA-4. В других вариантах осуществления антиген CTLA-4 представляет собой клетку, которая экспрессирует или сверхэкспрессирует CTLA-4 или его иммуногенный фрагмент на своей поверхности. В других вариантах осуществления антиген CTLA-4 представляет собой белок слияния CTLA-4. CTLA-4 может очищаться из природных источников с использованием известных технологий.

В предпочтительном варианте осуществления животное не-человек представляет собой животное XENOMOUSE^TM (Abgenix Inc., Fremont, CA). Другое животное не-человек, которое может использоваться, представляет собой трансгенную мышь, производимую Medarex (Medarex, Inc., Princeton, NJ).

Иммунизация животных может осуществляться с помощью любого способа, известного в данной области. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Способы иммунизации животных не-людей, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны в данной области. См., например, Harlow and Lane, выше, и патент США № 5994619. В предпочтительном варианте осуществления антиген CTLA-4 вводится вместе с адъювантом для стимуляции иммунной реакции. Примеры адъювантов включают в себя полный или неполный адъювант Фройнда, RIBI (мурамил-дипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защитить полипептид от быстрого диспергирования посредством секвестрирования его при локальном осаждении, или они могут содержать вещества, которые могут стимулировать хозяина для секретирования факторов, которые являются хемотактическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, если вводится полипептид, временной график иммунизации может включать в себя два или более введений полипептида, распределенные на несколько недель.

После иммунизации животного с помощью антигена CTLA-4, антитела и/или клетки, продуцирующие антитела, могут быть получены от животного. В некоторых вариантах осуществления сыворотка, содержащая антитела против CTLA-4, получается от животного посредством отбора крови или умерщвления животного. Сыворотка может использоваться в том виде, как она получается от животного, фракция иммуноглобулинов может быть получена из сыворотки, или антитела против CTLA-4 могут очищаться от сыворотки.

В некоторых вариантах осуществления иммортализованные линии клеток, продуцирующие антитела, получают из клеток, выделенных из иммунизированного животного. После иммунизации животное забивают, и B-лимфоциты лимфатических узлов и/или селезеночные B-лимфоциты иммортализуются. Способы иммортализации клеток включают в себя, но не ограничиваясь этим, трансфицирование их онкогенами, инфицирования их онкогенным вирусом, культивирование их при условиях селекции иммортализованных клеток, воздействия на них канцерогенных или вызывающих мутации соединений, слияние их с иммортализованной клеткой, например клеткой миеломы, и инактивацию гена супрессора опухоли. См., например, Harlow and Lane, выше. В предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное представляет собой животное не-человека, которое экспрессирует гены иммуноглобулинов человека, и селезеночные B-лимфоциты сливаются с линией клеток миеломы от тех же видов, что и животное не-человек. В более предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное представляет собой животное XENOMOUSE™ и линия клеток миеломы представляет собой несекреторную миелому мышей. В еще более предпочтительном варианте осуществления линия клеток миеломы представляет собой P3-X63-AG8-653. Если используется слияние с клетками миеломы, клетки миеломы предпочтительно не секретируют полипептиды иммуноглобулинов (несекреторная линия клеток). Иммортализованные клетки просматривают с использованием CTLA-4, его части или клетки, экспрессирующей CTLA-4. В предпочтительном варианте осуществления начальный скрининг осуществляют с использованием иммунного анализа на связанных ферментах (ELISA) или радиоиммунологического анализа. Пример скрининга ELISA приводится в Международной заявке WO 00/37504.

Клетки, продуцирующие антитела против CTLA-4, например гибридомы, подвергаются селекции, клонируются и дополнительно просматриваются на желаемые характеристики, включая устойчивый рост, высокое продуцирование антител и желаемые характеристики антитела, как дополнительно обсуждается ниже. Гибридомы могут размножаться in vivo в синергетических животных, в животных, у которых нет иммунной системы, например в голых мышах, или в культурах клеток in vitro. Способы селекции, клонирования и распространения гибридом хорошо известны специалистам в данной области.

Как будет понятно, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут рекомбинантно экспрессироваться в линии клеток, иные, чем линии клеток гибридом. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие цДНК, или геномные клоны для конкретных антител могут использоваться для трансформации соответствующих клеток-хозяев млекопитающих или не-млекопитающих.

Настоящее изобретение также охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления различные молекулы нуклеиновых кислот кодируют тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против CTLA-4. В других вариантах осуществления одна и та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против CTLA-4. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота кодирует антитело против CTLA-4 по настоящему изобретению.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или всю легкую цепь антитела против CTLA-4 или ее части, может быть выделена из любого источника, который продуцирует такое антитело. В различных вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот выделяют из B-лимфоцитов, выделенных из животного, иммунизированного с помощью анти-CTLA-4, или из иммортализованной клетки, полученной из такого B-лимфоцита, которая экспрессирует антитело против CTLA-4. Способы выделения мРНК, кодирующей антитело, хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning, 3rd Ed. Vol.3 (1989). мРНК может использоваться для получения цДНК, для использования в цепной реакции полимеразы (PCR) или клонирования с помощью цДНК генов антител. В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты выделяется из гибридомы, которая имеет в качестве одного из своих партнеров по слиянию клетку, продуцирующую иммуноглобулины человека, из трансгенного животного, не являющегося человеком. В еще более предпочтительном варианте осуществления клетка, продуцирующая иммуноглобулины человека, выделяется из животного XENOMOUSE™. В другом варианте осуществления клетка, продуцирующая иммуноглобулины человека, получается из трансгенного животного, не являющегося человеком или мышью, как описано выше. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота выделяется из не-трансгенного животного, не являющегося человеком. Молекулы нуклеиновых кислот, выделенные из животного, не являющегося человеком, могут использоваться, например, для гуманизированных антител.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению, может содержать последовательность нуклеотидов, кодирующую домен V_H по настоящему изобретению, соединенный в рамке с последовательностью нуклеотидов, кодирующей константный домен тяжелой цепи, от любого источника. Подобным же образом, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению, может содержать последовательность нуклеотидов, кодирующую домен V_L по настоящему изобретению, соединенный в рамке с последовательностью нуклеотидов, кодирующей константный домен легкой цепи, от любого источника.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельный домен тяжелой (V_H) и легкой (V_L) цепей, “преобразуются” в полноразмерные гены антитела. В одном из вариантов осуществления молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены V_H или V_L , преобразуются в полноразмерные гены антитела посредством инсерции в вектор экспрессии, уже кодирующий константные домены тяжелой цепи (C_H) или легкой цепи (C_L) соответственно, так что сегмент V_H функционально связан с сегментом (сегментами) C_H внутри вектора, и сегмент V_L функционально связан с сегментом C_L внутри вектора. В другом варианте осуществления молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены V_H и/или V_L, преобразуются в полноразмерные гены антитела посредством связывания, например лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей домены V_H и/или V_L, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей домен C_H и/или C_L, с использованием стандартных методик молекулярной биологии. Последовательности нуклеиновых кислот генов константных доменов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов человека известны в данной области. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. № 91-3242, 1991. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, затем могут экспрессироваться из клетки, в которую они вводятся, а антитело против CTLA-4 выделяться.

Настоящее изобретение также предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют тяжелую цепь антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению или его часть, связывающуюся с антигеном. Настоящее изобретение также предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют легкую цепь таких антител или их часть, связывающуюся с антигеном. Настоящее изобретение, кроме того, предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки слияния, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.

В некоторых вариантах осуществления антитела против CTLA-4 или части, связывающиеся с антигеном по настоящему изобретению, экспрессируются посредством инсерции ДНК, кодирующих частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные, как описано выше, в векторы экспрессии, так что гены функционально связываются с необходимыми последовательностями контроля экспрессии, такими как последовательности транскрипционного и трансляционного контроля. Векторы экспрессии включают в себя плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV), вирусы растения, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирус табачной мозаики, космиды, YAC, эписомы, полученные из EBV, и тому подобное. Ген антитела лигируется в вектор так, что последовательности транскрипционного и трансляционного контроля в векторе служат для их предполагаемой функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбираются, чтобы они были совместимым с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в различные векторы. В предпочтительном варианте осуществления оба гена вставляются в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вставляются в вектор экспрессии с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе или лигирование тупого конца, если сайты рестрикции не присутствуют).

Удобный вектор представляет собой такой, который кодирует функционально полную последовательность C_H или C_L иммуноглобулина человека, с соответствующими сайтами рестрикции, полученными с помощью генной инженерии, так что любая последовательность V_H или V_L может легко вставляться и экспрессироваться, как описано выше. В таких векторах обычно осуществляется сплайсинг между донорным сайтом сплайсирования во вставленной области J и акцепторным сайтом сплайсирования, предшествующим домену C человека, а также в областях сплайсирования, которые имеются внутри экзонов C_H человека. Завершение полиаденилирования и транскрипции осуществляется на нативных хромосомных сайтах после областей кодирования. Рекомбинантный вектор экспрессии также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может клонироваться в вектор, так что сигнальный пептид связывается в рамке с амино окончанием цепи иммуноглобулина. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть сигнальный пептид от белка не-иммуноглобулина).

В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Специалисту в данной области будет ясно, что дизайн вектора экспрессии, включая селекцию регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, которая должна трансформироваться, уровень экспрессии желаемого белка и тому подобное. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии клеток-хозяев млекопитающих включают в себя элементы вирусов, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусов (таких как ретровирусные LTR), цитомегаловирус (CMV) (такой как CMV промотор/энхансер), вирус обезьяны 40 (SV40) (такой как SV40 промотор/энхансер), аденовирус, (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)), полиома и сильные промоторы млекопитающих, такие как нативные промоторы иммуноглобулинов и актина. Относительно дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, патент США № 5168062, патент США № 4510245 и патент США № 4968615. Способы экспрессирования антител в растениях, включая описание промоторов и векторов, а также трансформация растений известна в данной области. См., например, патент США № 6517529, включенный сюда в качестве ссылки. Способы экспрессирования полипептидов в бактериальных клетках или в клетках грибов, например в клетках дрожжей, также хорошо известны в данной области.

В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, источники репликации) и необходимые для селекции маркерные гены. Необходимый для селекции маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые вводится вектор (см. например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 5179017). Например, как правило, необходимый для селекции маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вводится вектор. Предпочтительные необходимые для селекции маркерные гены включают в себя ген дигидрофолиат редуктазы (DHFR) (для использования в клетках-хозяевах DHFR с селекцией/амплификацией метотрексата), ген стойкости к неомицину (для селекции G418) и ген глютаминсинтетазы.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против CTLA-4, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, могут использоваться для трансформации соответствующей клетки-хозяина млекопитающего, растения, бактерии или дрожжей. Антитела по настоящему изобретению могут производиться трансгенно посредством генерирования млекопитающего или растения, которое является трансгенным относительно последовательностей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, представляющей интерес, и получения из него антитела в извлекаемой форме.

Трансформация может представлять собой любой известный способ для введения полинуклеотидов в клетку-хозяин, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и преобразование клетки-хозяина с помощью вируса (или вектора) или посредством процедур трансфицирования, известных в данной области, как иллюстрируется в патентах США №№ 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455. Используемая процедура трансформации зависит от хозяина, который должен трасформироваться. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваясь этим, трасфицирование опосредуемое декстраном, кальций-фосфатную преципитацию, трансфицирование, опосредуемое полибреном, слияние протопластов, электропорообразование, бомбардировку частицами, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах, пептидные конъюгаты, дендримеры и прямую микроинъекцию ДНК в ядро.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают в себя множество линий иммортализованных клеток, доступных от American Type Culture Collection (ATCC), включая, но не ограничиваясь этим, клетки яичников китайского хомячка (CHO), клетки NS0, клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (BHK), клетки почек обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и ряд других линий клеток. Клетки не-млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, бактерии, дрожжи, насекомых и растения, могут также использоваться для экспрессии рекомбинантных антител. Сайт-направленный мутагенез домена антитела CH₂ для устранения гликозилирования может быть предпочтительным для предотвращения изменений в любой из иммуногенных, фармакокинетических и/или эффекторных функций, возникающих от гликозилирования у не-человека. Способы экспрессирования выбираются посредством определения системы, которая генерирует самые высокие уровни экспрессии и продуцирует антитела с конститутивными свойствами связывания CTLA-4.

Кроме того, экспрессия антител по настоящему изобретению (или других остатков из них) из продуцирующих линий клеток может быть усилена с использованием ряда известных технологий. Например, глютаминситетаза и системы экспрессии гена DHFR являются обычными подходами для усиления экспрессии при определенных условиях. Клоны клеток с высокой экспрессией могут идентифицироваться с использованием обычных технологий, таких как клонирование при ограниченном разбавлении и технология Microdrop. Система глютаминсинтетазы обсуждается полностью или частично в связи с Европейскими патентами №№ 0216846, 0256055 и 0323997 и заявкой на Европейский патент № 893039644.

В связи с трансгенным продуцированием у млекопитающих антитела могут также продуцироваться в молоке коз, коров или других млекопитающих и извлекаться из него. См., например патенты США №№ 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957.

Антитела против CTLA-4, экспрессируемые в линиях клеток, как описано выше, могут очищаться и/или выделяться из ассоциированного клеточного материала. Антитела могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток или в частично очищенной или по существу чистой форме. Очистку осуществляют для устранения других клеточных компонентов или других загрязнений, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных технологий, включая щелочную/SDS обработку, колоночную хроматографию и другие способы, хорошо известные в данной области. См. Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

В настоящем изобретении является возможным, чтобы антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению, экспрессируемые различными линиями клеток или в трансгенных животных, имели структуры гликозилирования, отличные друг от друга. Однако все антитела против CTLA-4, кодируемые нуклеиновыми кислотами и аминокислотами, предусмотренными здесь, рассматриваются как часть настоящего изобретения, независимо от их структуры гликозилирования, или ее модификации, или делеции. Таким образом, для целей настоящего изобретения антитела против CLTA-4 могут быть гликозилированными или негликозилированными. Когда антитела против CTLA-4 являются гликозилированными, они могут иметь любую возможную структуру гликозилирования. Более того, каждая тяжелая цепь в одном антителе может иметь одну и ту же структуру гликозилирования или две тяжелых цепи могут иметь различные структуры гликозилирования. Сайт-направленный мутагенез домена CH₂ антитела для устранения гликозилирования также охватывается настоящим изобретением для предотвращения изменения в любой из иммуногенной, фармакокинетической и/или эффекторной функций в результате гликозилирования у не-человека.

Как здесь используется, термин "гликозилирование" означает структуру углеводных единиц, которые ковалентно присоединены к антителу. Когда говорится, что антитела против M-CTLA-4 здесь имеют конкретную структуру гликозилирования, подразумевается, что большая часть упомянутых антител против CTLA-4 имеет эту конкретную структуру гликозилирования. В других аспектах, когда говорится, что антитела против M-CTLA-4 здесь имеют конкретную структуру гликозилирования, подразумевается, что 50%, 75%, 90%, 95%, 99% или 100% или больше упомянутых антител против CTLA-4 имеют эту конкретную структуру гликозилирования.

Антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению также охватывают их варианты гликозилирования (например, посредством инсерции сайта гликозилирования или делеции любого сайта гликозилирования посредством делеции, инсерции или замещения соответствующих аминокислотных остатков).

Гликозилирование полипептидов обычно бывает либо N-связанным, либо O-связанным. Гликозилирование полипептидов антитела обычно является N-связанным и формирует двойную антенную структуру. N-связанный относится к присоединению углеводного остатка к боковой цепи аспарагинового остатка. Трехпептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой распознающие последовательности для ферментативного присоединения углеводного остатка к аспарагиновой боковой цепи. Таким образом, присутствие любой из этих трехпептидных последовательностей в антителе создает потенциальный сайт гликозилирования.

Три различные структуры двойных антенных гликанов обозначаются “G0”, “G1” и “G2” и имеют ноль, один или два соответственно конечных остатков галактозы на невосстанавливающем конце гликана. См. Jefferis et al., Biochem. J., 268, 529-537 (1990). В некоторых случаях гликановая структура может также иметь фукозный остаток, связанный с N-ацетилглюкозамином, который ковалентно связан с аспарагиновой аминокислотой (например, положение 297), находящийся в антителе. Когда присутствует фукоза (F), номенклатура двойного антенного гликана изменяется на “G0F”, “G1F” или “G2F”, в зависимости от количества конечных остатков галактозы. См. Teillaud, Expert Opin. Biol. Ther., 5(Suppl.1):S15-S27 (2005). Кроме того, когда антитело содержит обе тяжелые цепи, номенклатура гликана повторяется для каждой из двух тяжелых цепей. Гликоформа "G0F,G0F" представляет собой вид, в котором обе тяжелые цепи имеют присоединенный гликан G0 и каждый гликан G0 имеет фукозный (F) остаток, связанный с N-ацетилглюкозамином. Гликоформа "G0F,G1F" представляет собой виды, у которых одна из тяжелых цепей имеет присоединенный гликан G0, а другая тяжелая цепь имеет присоединенный гликан G1, при этом каждый из гликана G0 и гликана G1 имеет фукозный (F) остаток, связанный с N-ацетилглюкозамином.

В определенных вариантах осуществления антитела против CTLA-4 имеют структуру гликозилирования, выбранную из группы, состоящей из “G0F,G0F”; "G0F,G1F"; "G1F,G1F"; "G1F,G2F" и их смесей. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 имеют структуру гликозилирования, которая представляет собой “G0F,G1F” для более чем 50% получаемых антител. В других вариантах осуществления антитела против CTLA-4 имеют структуру гликозилирования, которая представляет собой “G0F,G0F” для менее чем 50% получаемых антител. Например, в одном из вариантов осуществления антитело против CTLA-4 11.2.1, описанное здесь, имеет структуру гликозилирования “G0F,G0F” или “G0F,G1F”. В некоторых вариантах осуществления получаются антитела против CTLA-4 (11.2.1), имеющие смесь различных структур гликозилирования. Например, в образце антител (11.2.1) может находиться смесь антител (11.2.1), где некоторые из них имеют структуру гликозилирования “G0F,G1F”, а другие имеют структуру гликозилирования “G0F,G0F” при отношении приблизительно 3:2 соответственно.

Способы введения и дозировки

Композиции по настоящему изобретению могут находиться в жидких растворах (например, в растворах для инъекций и для вливаний). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции находятся в форме растворов для инъекций или для вливаний, как композиции, сходные с теми, которые используются для пассивной иммунизации людей. Предпочтительный способ введения является парентеральным (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно и надчревно) или посредством методик вливания, в форме стерильной жидкости для инъекций или масляных суспензий. Как увидит специалист в данной области, способ и/или режим введения будет изменяться, в зависимости от желаемых результатов. В предпочтительном варианте осуществления антитело вводится посредством внутривенного вливания или инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводится посредством внутримышечной или подкожной инъекции.

Терапевтические композиции, как правило, являются стерильными и стабильными при условиях производства и хранения.

Композиция может быть приготовлена в форме раствора, микроэмульсии, дисперсии или липосом. Стерильные растворы для инъекций могут приготавливаться посредством введения антитела против CTLA-4 в требуемом количестве в соответствующий разбавитель, вместе с одним из ингредиентов, перечисленных выше, или с их сочетанием, по потребности, с последующей стерилизацией (например, стерилизацией на фильтре). Как правило, дисперсии приготавливают посредством введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную среду дисперсии и необходимые другие ингредиенты, из тех, которые перечислены выше. Такие суспензии могут приготавливаться в соответствии с литературой, используя те, которые пригодны для диспергирования смачивающих агентов и суспендирующих агентов или других приемлемых агентов. Стерильный препарат для инъекций также может представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В дополнение к этому, стерильные, фиксированные масла удобно использовать в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может использоваться любое смягчающее фиксированное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В дополнение к этому, n-3 полиненасыщенные жирные кислоты могут найти применение при приготовлении препаратов для инъекций.

В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительные способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и сушку замораживанием, которая дает порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента из ранее стерильно отфильтрованного его раствора. Соответствующая текучесть раствора может поддерживаться, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц, в случае дисперсии, и посредством использования поверхностно-активных веществ.

Пролонгированное поглощение композиций для инъекций может осуществляться посредством включения в композицию агента, который замедляет поглощение, например моностеаратных солей и желатина, или посредством приготовления композиции в форме с пролонгированным поглощением, такой как депо, липосомы, полимерные микросферы, полимерные гели и импланты.

Другие способы введения антител, описанных здесь, включают в себя термические пластыри, которые высвобождают медицинские препараты непосредственно в кожу субъекта. Такие пластыри могут содержать антитела по настоящему изобретению в необязательно дополненном буфером жидком растворе, растворенные и/или диспергированные в адгезиве или диспергированные в полимере.

Другие способы введения антител, описанных здесь, включают в себя жидкие офтальмологические капли для глаз.

Антитело может вводиться однократно, но более предпочтительно, вводится много раз. Например, антитело может вводиться от одного раза в день до одного раза каждые шесть месяцев или больше. Введение может происходить при таком графике, как три раза в день, дважды в день, один раз в день, раз в каждые два дня, раз в каждые три дня, раз в неделю, раз в каждые две недели, раз в каждый месяц, раз в каждые два месяца, раз в каждые три месяца и раз в каждые шесть месяцев.

Антитело также может вводиться непрерывно с помощью мининасоса. Антитело может вводиться в место, где находится опухоль, или в воспаленную часть тела, в опухоль или воспаленную часть тела, или в место, удаленное от места опухоли или воспаленной части тела. Антитело может вводиться один раз, по меньшей мере, два раза или в течение, по меньшей мере, периода времени, пока состояние лечится, облегчается или поддерживается. Как правило, антитело может вводиться настолько долго, насколько присутствует опухоль, при условии, что антитело заставляет опухоль или рак прекратить рост или уменьшиться по массе или объему, или до тех пор, пока воспаленная часть тела не заживет. Антитело, как правило, должно вводиться как часть фармацевтической композиции, как описано выше.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела или связывающейся с антигеном части по настоящему изобретению. При приготовлении препарата терапевтически эффективное количество антитела против CTLA-4, присутствующего в препарате, может определяться, например, посредством учета желаемых объемов доз и способа (способов) введения, природы и тяжести состояния, которое должно лечиться, и возраста и размеров субъекта.

Примерные, неограничивающие диапазоны доз для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению субъекту составляют от примерно 0,01 мг/кг до примерно 200 мг/кг (выраженных в единицах миллиграммов (мг) антитела против CTLA-4, вводимого на килограмм (кг) массы субъекта), от примерно 0,1 мг/кг до примерно 100 мг/кг, от примерно 1,0 мг/кг до примерно 50 мг/кг, от примерно 5,0 мг/кг до примерно 20 мг/кг, или примерно 15 мг/кг. Для целей настоящего изобретения, средний субъект человек весит примерно 70 кг.

Диапазоны, промежуточные к любому диапазону дозировок, упомянутому здесь, например, примерно 0,01 мг/кг - 199 мг/кг, также, как подразумевается, должны быть частью настоящего изобретения. Например, пределы значений с использованием сочетания любых из упомянутых значений в качестве верхних и/или нижних пределов, как подразумевается, должны включаться.

Режимы дозировки могут также устанавливаться для получения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции) посредством введения нескольких разделенных доз субъекту со временем, или доза может пропорционально уменьшаться или увеличиваться, как показывают нужды терапевтической ситуации. Является особенно преимущественным приготовление парентеральных композиций стандартной дозированной формы, для простоты введения и однородности дозировки.

Стандартная дозированная форма, как здесь используется, относится к физически дискретным единицам, пригодным для использования в качестве стандартных дозировок для субъектов млекопитающих, которые должны лечиться; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для оказания желаемого терапевтического воздействия, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных дозированных форм по настоящему изобретению диктуются и находятся в прямой зависимости от (a) уникальных характеристик антитела против CTLA-4 или его части и конкретного терапевтического или профилактического воздействия, которое должно быть достигнуто; и (b) ограничений, присущих в области компаундирования такого антитела, для лечения восприимчивости у индивидуумов.

Жидкие препараты по настоящему изобретению могут приготавливаться как единичные дозированные формы. Например, единичная дозировка на флакон может содержать от 1 до 1000 миллилитра (мл) различных концентраций антитела против CTLA-4. В других вариантах осуществления единичная дозировка на флакон может содержать примерно 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл, 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл или 100 мл различных концентраций антител против CTLA-4. Если это необходимо, эти препараты могут доводиться до желаемой концентрации посредством добавления стерильного разбавителя в каждый флакон. Жидкие препараты по настоящему изобретению могут также приготавливаться как единичная дозированная форма в стерильных пакетах или контейнерах, которые пригодны для соединения с линией или катетером для внутривенного введения.

Оценка стабильности

Настоящее изобретение включает в себя стабильные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антитело против CTLA4, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый хелатирующий агент. Для стабильной композиции является желательным поддержание или противостояние изменениям, например, внешнего вида и целостности продукта (включая физическую или химическую деградацию, приводящую к уменьшению биологической активности). Различные аналитические методики и индикаторы для измерения стабильности белков освещаются в литературе, и ряд этих методик и индикаторов обозревается в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Как правило, жидкие фармацевтические композиции по настоящему изобретению демонстрируют улучшенную стабильность, когда подвергаются воздействию низких температур хранения в течение некоторого периода времени и/или когда подвергаются воздействию одного или нескольких циклов заморозки/оттаивания.

В одном из вариантов осуществления композиция, когда хранится при температуре от примерно 2°C до примерно 8°C в течение, по меньшей мере, примерно 12 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 18 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 24 месяцев, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени.

В другом варианте осуществления композиция, когда хранится при температуре от примерно 25°C до примерно 30°C в течение, по меньшей мере, примерно 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 12 месяцев, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени.

В другом варианте осуществления композиция, когда хранится при температуре примерно 40°C в течение, по меньшей мере, примерно 1 месяца, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 2 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 3 месяца, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени.

Как здесь используется, термин "цикл заморозки/оттаивания" относится к технологиям для использования жидкого образца антитела после хранения в замороженном состоянии, когда температура образца понижается до температуры 0°C или ниже для заморозки жидкого образца, а затем образец подвергается воздействию температуры, которая восстановит его жидкое состояние в течение достаточного периода времени, чтобы сделать возможным использование образца, с последующим возвращением к хранению в замороженном состоянии, предпочтительно, при температуре 0°C или ниже. Как здесь используется, термин "хранение в замороженном состоянии" относится к заморозке и поддержанию ранее жидкого образца антитела при температуре 0°C или ниже, а предпочтительно, -20°C или ниже.

В одном из вариантов осуществления композиция, когда подвергается воздействию, по меньшей мере, 1 цикла заморозки/оттаивания, предпочтительно, по меньшей мере, 2 циклов заморозки/оттаивания, более предпочтительно, по меньшей мере, 3 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 4 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 5 циклов заморозки/оттаивания, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 6 циклов заморозки/оттаивания, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая подвергается воздействию таким же условиям заморозки/оттаивания.

В другом варианте осуществления композиция удовлетворяет двум или более из следующих условий:

(a) композиция, когда хранится при температуре от примерно 2°C до примерно 8°C в течение, по меньшей мере, примерно 12 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 18 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 24 месяцев, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени;

(b) композиция, когда хранится при температуре от примерно 25°C до примерно 30°C в течение, по меньшей мере, примерно 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 12 месяцев, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени;

(c) композиция, когда хранится при температуре примерно 40°C в течение, по меньшей мере, примерно 1 месяца, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 2 месяцев, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 3 месяцев, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени; или

(d) композиция, когда подвергается воздействию, по меньшей мере, 1 циклу заморозки/оттаивания, предпочтительно, по меньшей мере, 2 циклов заморозки/оттаивания, более предпочтительно, по меньшей мере, 3 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 4 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 5 циклов заморозки/оттаивания, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 6 циклов заморозки/оттаивания, является более стабильной, чем идентичная в остальном композиция, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится при таких же условиях в течение такого же времени;

В другом варианте осуществления композиция удовлетворяет трем или более условиям, обсуждаемым непосредственно выше.

Для целей настоящей заявки агрегация антитела, фрагментация антитела и/или обесцвечивание композиции, например, могут использоваться в качестве индикаторов стабильности композиции. Как правило, жидкие фармацевтические композиции по настоящему изобретению демонстрируют более низкий уровень, по меньшей мере, одного параметра из агрегации антитела, фрагментации антитела и обесцвечивания композиции, когда подвергаются воздействию одного или нескольких из описанных выше условий хранения или заморозки/оттаивания, по сравнению с идентичными в основном композициями, в которых нет хелатирующего агента, которые подвергаются воздействию таких же условий.

Агрегация белков в жидкой фармацевтической композиции может измеряться посредством различных способов, известных в данной области. Такие способы включают в себя гель-фильтрационную хроматографию для разделения белков на основе их молекулярной массы. "Гель" представляет собой матрицу из воды и полимера, такого как агароза или полимеризованный акриламид. Настоящее изобретение также охватывает использование гель-фильтрационной HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Другие известные способы измерения агрегации включают в себя катионообменную хроматографию, которая представляет собой общую методику жидкостной хроматографии для ионообменной хроматографии с использованием анионных колонок. Катионы, которые обмениваются по настоящему изобретению, происходят от молекул белков. Поскольку многовалентные агрегаты белков могут иметь в несколько раз больший суммарный заряд, чем одноцепочечный белок, связывающийся с антигеном, агрегаты могут удерживаться сильнее и могут отделяться из одноцепочечных молекул. Предпочтительный катионообменник представляет собой колонку с полиаспарагиновой кислотой. Таким образом, мономерный белок может легко быть отделен от агрегата. Однако специалисты в данной области поймут, что анализы агрегации по настоящему изобретению не являются ограниченными каким-либо конкретным типом хроматографической колонки постольку, поскольку она способна разделять две формы молекул белков.

Фрагментация белков в жидкой фармацевтической композиции может измеряться посредством различных способов, известных в данной области. Такие способы включают в себя, например, эксклюзионную хроматографию, ультрафиолетовое детектирование (например, на 214 нанометрах), SDS-PAGE и/или матричную лазерную десорбционную ионизацию/времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI/TOF MS). Фрагментация белков, приводящая к изменению заряда (например, осуществляемая в результате деамидирования), может оцениваться, например, посредством ионообменной хроматографии или изоэлектрической фокусировки (IEF).

Обесцвечивание композиции, как правило, может измеряться посредством визуального наблюдения самой композиции. Данные жидкие фармацевтические композиции, содержащие хелатирующий агент, как правило, уменьшают обесцвечивание композиции (например, розовое или желтое) и/или поддерживают прозрачность композиции (например, мутность, затуманивание и/или образование частиц), по сравнению с идентичными в остальном композициями, которые не содержат хелатирующего агента. Для целей настоящего изобретения термин “обесцвечивание” относится как к изменениям цвета (например, от прозрачного и бесцветного до розового или желтого), так и к изменениям прозрачности (например, от прозрачной и бесцветной до мутной, затуманенной и/или содержащей частицы). Обесцвечивание композиции, как правило, может измеряться с использованием дополнительных методик, таких как ультрафиолетовое детектирование на 214 нанометрах и/или визуальное сравнение со стандартной цветовой шкалой композиций, с хелатирующим агентом и без него. См. PhEur 5.0, 2005 Monograph 2.2.2.

В одном из вариантов осуществления агрегация антитела определяется после того, как композиция подвергается воздействию, по меньшей мере, одного из следующих условий:

(a) композиция хранится при температуре от примерно 2°C до примерно 8°C в течение, по меньшей мере, примерно 12 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 18 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 24 месяцев;

(b) композиция хранится при температуре от примерно 25°C до примерно 30°C в течение, по меньшей мере, примерно 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 12 месяцев;

(c) композиция хранится при температуре примерно 40°C в течение, по меньшей мере, примерно 1 месяца, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 2 месяцев, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 3 месяцев; или

(d) композиция подвергается воздействию, по меньшей мере, 1 цикла заморозки/оттаивания, предпочтительно, по меньшей мере, 2 циклов заморозки/оттаивания, более предпочтительно, по меньшей мере, 3 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 4 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 5 циклов заморозки/оттаивания, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 6 циклов заморозки/оттаивания. Затем агрегаты антител хроматографически отделяются от композиции (например, с использованием HPLC), и степень агрегации определяется из полученной хроматограммы. Стабильные жидкие фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, имеют площадь пика агрегата на хроматограмме, которая меньше, примерно, чем 6%, меньше, примерно, чем 5%, меньше, примерно, чем 4%, меньше, примерно, чем 3%, меньше, примерно, чем 2%, или меньше, примерно, чем 1,5%, от общей площади пиков на хроматограмме. В одном из конкретных примеров этой методики измерения агрегации композицию хранят в течение 24 недель при 40°C, и хроматографическое разделение осуществляют затем с использованием SE-HPLC, с ультрафиолетовым детектированием на 214 нанометрах. Это методика используется для измерения агрегации антител в Примере 11, где, например, Препарат № 37 (содержащий хелатирующий агент) демонстрирует площадь пика агрегатов на хроматограмме примерно 1,1%, в то время как Препарат 26 (в котором нет хелатирующего агента) демонстрирует площадь пика агрегатов на хроматограмме примерно 6,4%.

Как правило, различие между площадью пика агрегатов на хроматограмме для стабильной жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению и площадью пика агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, где нет хелатирующего агента, которая подвергается воздействию таких же условий, составляет, по меньшей мере, примерно 2%, по меньшей мере, примерно 3%, по меньшей мере, примерно 4%, или, по меньшей мере, примерно 4,5%. Например, это различие между Препаратом 37 (площадь пика агрегатов на хроматограмме примерно 1,1%) и Препаратом 26 (площадь пика агрегатов на хроматограмме примерно 6,4%), исследуемым в Примере 11, как обсуждается выше, составляет примерно 5,3%.

В другом варианте осуществления фрагментация антитела определяется после того, как композиция подвергается воздействию, по меньшей мере, одного из следующих условий:

(b) композиция хранится при температуре от примерно 25°C до примерно 30°C в течение, по меньшей мере, примерно 3 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 12 месяцев;

(d) композиция подвергается воздействию, по меньшей мере, 1 цикла заморозки/оттаивания, предпочтительно, по меньшей мере, 2 циклов заморозки/оттаивания, более предпочтительно, по меньшей мере, 3 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 4 циклов заморозки/оттаивания, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 5 циклов заморозки/оттаивания, а еще более предпочтительно, по меньшей мере, 6 циклов заморозки/оттаивания. Фрагменты антител затем хроматографически отделяются от композиции (например, с использованием гель-фильтрации) и степень фрагментации определяется из полученной хроматограммы. Стабильные жидкие фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, имеют объем полосы фрагментов на хроматограмме, который меньше, примерно, чем 9%, меньше, примерно, чем 8%, меньше примерно, чем 7%, меньше примерно, чем 6%, меньше, примерно, чем 5%, или меньше, примерно, чем 4,5%, от общего объема полос на хроматограмме. В одном конкретном примере этой методики измерения фрагментации композиция хранится в течение 24 недель при 40°C, а затем подвергается хроматографическому разделению с использованием восстановленного SDS-PAGE (rSDS-PAGE), при этом объемы полос определяются посредством сканирования с помощью либо Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, либо Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Эта методика используется для измерения фрагментации антител в Примере 11, где, например, Препарат № 37 (содержащий хелатирующий агент) демонстрирует объем полосы фрагментов на хроматограмме примерно 4,5%, в то время как Препарат 26 (в котором нет хелатирующего агента) демонстрирует объем полосы фрагментов на хроматограмме примерно 10,1%.

Как правило, различие между объемом полосы фрагментов для стабильной жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению и объемом полосы фрагментов для идентичной в остальном композиции, где нет хелатирующего агента, которая подвергается воздействию таких же условий, составляет, по меньшей мере, примерно 2%, по меньшей мере, примерно 3%, по меньшей мере, примерно 4%, или, по меньшей мере, примерно 5%. Например, это различие между Препаратом 37 (объем полосы фрагментов на хроматограмме примерно 4,5%) и Препаратом 26 (объем полосы фрагментов на хроматограмме примерно 10,1%), исследуемым в Примере 11, как обсуждается выше, составляет примерно 5,6%.

Способы лечения

Любой из типов антител, описанных здесь, может использоваться терапевтически. В предпочтительном варианте осуществления, антитело против CTLA-4 представляет собой антитело человека. В другом предпочтительном варианте осуществления CTLA-4 принадлежит человеку, и субъектом является субъект-человек. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против CTLA-4 представляет собой антитело IgG2 человека. Альтернативно, субъект может представлять собой млекопитающее, которое экспрессирует белок CTLA-4, с которым антитело против CTLA-4 перекрестно взаимодействует. Антитело может вводиться млекопитающему не-человеку, экспрессирующему CTLA-4, с которым антитело перекрестно взаимодействует (то есть примату), для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. Такие животные модели могут использоваться для оценки терапевтической эффективности антител по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение предоставляет способ лечения состояния новообразования у субъекта, включающий в себя введение субъекту жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело против CTLA-4 и хелатирующий агент, сам по себе или в сочетании с другими эксципиентами, выбранными из буфера, изотонического агента или поверхностно-активного вещества и их смесей. В дополнительных вариантах осуществления указанный выше субъект представляет собой такой, который нуждается в предотвращении или лечении состояния новообразования.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ лечения состояния новообразования у субъекта, включающий в себя введение субъекту жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело против CTLA-4, тицилимумаб и фармацевтически приемлемый эксципиент, содержащий хелатирующий агент, сам по себе или в сочетании с другими эксципиентами, выбранными из буфера, изотонического агента или поверхностно-активного вещества и их смесей.

Оба термина “новообразование” и “состояние новообразования” относится к “новообразованию” или опухоли, которая может быть доброкачественной, предраковой, метастатической или злокачественной. Также охваченными настоящим изобретением являются доброкачественные, предраковые, метастатические или злокачественные новообразования. Также охваченными настоящим изобретением являются доброкачественные, предраковые, метастатические или злокачественные опухоли. Таким образом, все доброкачественные, предраковые, метастатические или злокачественные новообразования или опухоли охватываются настоящим изобретением и могут упоминаться взаимозаменяемо как новообразования, неоплазмы или состояния, связанные с новообразованиями. Опухоли, как правило, как известно в данной области, представляют собой массу новообразования или “неопластических” клеток. Хотя нужно понять, что даже одна неопластическая клетка рассматривается для целей настоящего изобретения как представляющая собой неоплазму или, альтернативно, новообразование.

Состояния новообразования, которые могут лечиться с помощью антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению, могут включать в себя любую ткань или орган и включают в себя, но не ограничиваясь этим, раковые заболевания костей, головного мозга, легких, плоских клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, груди, головы, шеи, печени, почек, яичников, простаты, толстой и прямой кишки, пищевода, женских органов (например, матки и яичников), носоглотки или щитовидной железы. Также охваченными термином состояния новообразования являются метастазы в костях, меланомы, лимфомы, лейкемии и множественные миеломы. В частности, препараты антитела против CTLA-4 по настоящему изобретению являются пригодными для лечения раковых заболеваний груди, простаты, толстой кишки и легких.

В других вариантах осуществления способы и композиции по настоящему изобретению охватывают предотвращение и лечение состояний новообразования, выбранных из группы, состоящей из лентигиноза конечностей, актинического кератоза, аденокарциномы, аденоидной карциномы мочевого пузыря, аденом, наследственного аденоматозного полипоза, наследственных полипов, полипов толстой кишки, полипов, аденосаркомы, аденосквамозной карциномы, адренокортикальной карциномы, лимфомы, связанной со СПИД, анального рака, атроцитозных опухолей, карциномы бартолиновой железы, карциномы базальных клеток, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, глиомы ствола мозга, опухолей головного мозга, рака груди, карциномы бронхиальной железы, карциномы капилляров, карциноидов, карциномы, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциносаркомы, кавернозной лимфомы центральной нервной системы, церебральной астроцитомы, холангиокарциномы, хондосаркомы, папилломы/карциномы хориоидального сплетения, карциномы прозрачных клеток, рака кожи, рака головного мозга, рака толстой кишки, рака толстой и прямой кишки, лимфомы T-лимфоцитов кожи, цистаденомы, опухоли эндодермального синуса, эндометриальной гиперплазии, стромальной саркомы эндометрия, эндометриоидной аденокарциномы, эпендимального, эпителиоидного рака, рака пищевода, саркомы Эвинга, опухоли экстрагонадальных половых клеток, фиброламеллярной гиперплазии, фокальной узелковой гиперплазии, рака желчного пузыря, гастриномы, опухолей половых клеток, гестационной трофобластической опухоли, глиобластомы, глиомы, глюкагономы, гемангибластом, гемангиоэндотелиомы, гемангиом, аденомы печени, аденоматоза печени, гепатоцеллюлярной карциномы, лимфомы Ходжкина, гипофарингеального рака, глиомы гипоталамического и зрительного пути, инсулиномы, интаэпителиальных неоплазии, интерэпителиальных неоплазии плоских клеток, внутриглазной меланомы, инвазивной карциномы плоских клеток, крупноклеточной карциномы, карциномы островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, рака гортани, лейомиосаркомы, злокачественных меланом родимых пятен, состояний, связанных с лейкемией, рака губ и ротовой полости, рака печени, рака легких, лимфомы, злокачественных мезотелиальных опухолей, злокачественной тимомы, медуллобластомы, медуллоэпителиомы, меланомы, менингеальной карциномы клеток Меркеля, мезотелиальной, метастатической карциномы, мукоэпидермоидной карциномы, множественной миеломы/новообразований плазматических клеток, фунгоидного микоза, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативных состояний, рака носовой полости и параназального синуса, рак а носоглотки, нейробластомы, нейроэпителиальной аденокарциномы, узелковой меланомы, новообразований центральной нервной системы (например, первичной лимфомы ЦНС, опухолей спинного мозга, глиом ствола головного мозга или питуитарных аденом), лимфомы не-Ходжкина, карциномы овсяновидных клеток, олигодендроглиального рака ротовой полости, рака ротоглотки, остеосаркомы, полипептида поджелудочной железы, рака яичников, опухоли половых клеток яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной серозной аденокарциномы, пинеалоцитов, питуитарных опухолей, плазмацитомы, псевдосаркомы, пульмонарной бластомы, паращитовидного рака, рака полового члена, феохромоцитомы, пинеальных и супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей, питуитарной опухоли, новообразований плазматических клеток, плевропульмонарной бластомы, рака простаты, ректального рака, карциномы клеток почек, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, саркомы, серозной карциномы, мелкоклеточной карциномы, рака тонкой кишки, карцином мягких тканей, соматостатин-секретирующей опухоли, сквамозной карциномы, карциномы плоских клеток, субмезотелиальной, поверхностно распространяющейся меланомы, супратенториалных примитивных нейроэктодермальных опухолей, рака щитовидной железы, недифференцированной карциномы, рака уретры, рака матки, увеальной меланомы, веррукозной карциномы, рака влагалища, випомы, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрома, хорошо дифференцированной карциномы и опухоли Вильма.

В более предпочтительном варианте осуществления антитело против CTLA-4 вводится субъекту с раком груди, раком простаты, раком легких или раком толстой кишки. В еще более предпочтительном варианте осуществления способ заставляет рак прекратить аномальную пролиферацию или не увеличиваться по массе или объему, или уменьшаться по массе или объему.

Промышленные изделия

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предоставляется промышленное изделие, содержащее контейнер, который удерживает жидкий фармацевтический препарат, содержащий, по меньшей мере, одно моноклональное антитело против CTLA-4 по настоящему изобретению в препарате, содержащем хелатирующий агент, сам по себе или в сочетании с другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, и необязательно предоставляет инструкции для его использования. Соответствующие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, пакеты и шприцы. Контейнер может формироваться из различных материалов, таких как стекло или пластик. Примерный контейнер представляет собой 3-20 см³ одноразовый стеклянный флакон. Альтернативно, для множества доз препарата контейнер может представлять собой 3-100 см³ стеклянный флакон. Контейнер содержит препарат и этикетку на нем или связанную с ним, контейнер может показывать инструкции для применения. Промышленное изделие может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вставки с инструкциями для применения, противопоказания и/или списки возможных побочных воздействий.

Настоящее изобретение также предоставляет набор для приготовления жидкой композиции из стабилизированного антитела, составляющий первый контейнер, содержащий моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1 в растворе, и второй контейнер, содержащий достаточное количество хелатирующего агента, самого по себе или в сочетании с другими эксципиентами в растворе для стабилизации антитела.

Следующие далее примеры описывают варианты осуществления настоящего изобретения. Другие варианты осуществления в рамках формулы изобретения здесь будут понятны специалисту в данной области из рассмотрения описания или осуществления настоящего изобретения, как здесь описано. Предполагается, что описание, вместе с примерами, должно рассматриваться только в качестве иллюстрации, при этом рамки и дух настоящего изобретения указываются формулой изобретения, которая следует за примерами. В примерах все проценты приводятся как проценты массовые, если не указано иного. Специалист в данной области заметит, что массовые количества и/или отношения массы к объему, упоминаемые в примерах, могут быть преобразованы в моли и/или молярности с использованием известных в данной области молекулярных масс упоминаемых ингредиентов. Массовые величины, иллюстрируемые здесь (например, граммы), относятся к упоминаемым объемам (например, буферных растворов, препаратов антител и тому подобное). Специалист в данной области заметит, что массовые количества могут выбираться пропорционально, когда желаемыми являются различные объемы препарата.

Пример 1

Этот Пример показывает генерирование линии клеток гибридом, которые продуцируют антитела против CTLA-4, как описано в патенте США № 6682736, Hanson, et al.

Антитела по настоящему изобретению получают, подвергают селекции и анализируют следующим образом.

Приготовление антигена: Три различных иммуногена приготавливают для иммунизации мышей XenoMouse™: (i) белок слияния CTLA-4-IgG, (ii) пептид CTLA-4 и (iii) клетки лимфомы грызунов 300.19, трансфицированные мутантом CTLA-4 (Y201V), который конститутивно экспрессируется на поверхности клеток.

Белок слияния CTLA-4-IgG1:

Конструирование вектора экспрессии

цДНК, кодирующая зрелый внеклеточный домен CTLA-4, амплифицируется с помощью PCR из библиотеки цДНК тимуса человека (Clontech) с использованием праймеров, сконструированных для опубликованной последовательности (Eur. J Immunol 18:1901-1905 (1988)). Фрагмент направленно субклонируют в pSR5, плазмиду экспрессии вируса Sindbis (InVitrogen), между доменами сигнального пептида онкостатина M человека и IgG гамма 1 человека (IgG1) CH₁/CH₂/CH₃. Белок слияния не содержит шарнирного домена, но содержит цистеин 120 во внеклеточном домене CTLA-4 для образования ковалентного димера. Полученный вектор называют CTLA-4-IgG1/pSR5. Полная цДНК CTLA-4-IgG1 в векторе имеет последовательность, подтвержденную в обеих нитях. Последовательность аминокислот белка CTLA4-Ig показана ниже. Зрелый внеклеточный домен для CD44 амплифицируется с помощью PCR из библиотеки лимфоцита человека (Clontech) и субклонируется в pSinRep5 для генерирования контрольного белка с идентичным хвостом IgG1.

Белок слияния OM-CTLA4-IgG1:

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Подчеркнуто = сигнальный пептид

цДНК для зрелого внеклеточного домена CD28 амплифицируются с помощью PCR из библиотеки лимфоцитов человека (Clontech), а затем субклонируется в pCDM8 (J. Immunol. 151: 5261-71 (1993)) для получения белка слияния IgG1 человека, содержащего как области расщепления тромбина, так и шарнирные области. CTLA4 мартышки Cynomologous и макаки резус клонируют из мРНК, выделенной из PBMC, стимулированных PHA, с использованием стандартных методик для дегенерации PCR. Секвенирование демонстрирует, что последовательности аминокислот макаки резус и Cynomologous являются идентичными, с тремя отличиями от зрелого внеклеточного домена CTLA4 человека (S13N, I17T и L105M). Мартышка демонстрирует десять отличий аминокислот от зрелого внеклеточного домена CTLA4 человека (V21A, V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M и G106S). Сайт-направленный мутагенез используют для получения одноточечных мутаций всех аминокислот, отличающихся в CTLA4 мартышки, для картирования аминокислот, важных для взаимодействия антител с CTLA4-IgG человека. Мутации CTLA-IgG человека и мартышки для картирования эпитопа генерируют посредством адаптивного сайт-направленного мутагенеза (Promega). Белки слияния IgG получают посредством нестационарного трасфицирования клеток Cos7 и очищают с использованием стандартных технологий Protein A. Мутантные белки CTLA4-IgG оценивают на связывание антител посредством иммуноблотинга и с использованием анализов BIAcore.

Экспрессия/очистка рекомбинантного белка

Рекомбинантный вирус Sindbis генерируют посредством электропорообразования (Gibco) клеток почек детеныша хомячка с помощью полученной транскрипции in vitro мРНК CTLA-4-IgG1/pSR5 SP6 и хелперной мРНК DH-26S, как описывается InVitrogen. Через сорок восемь часов рекомбинантный вирус харвестируют и титруют для оптимального экспрессирования белка в яйцеклетках китайского хомячка (CHO-K1). Клетки CHO-K1 культивируют в суспензии в DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10% термического инактивированной фетальной сыворотки теленка (Gibco), неэссенциальных аминокислот (Gibco), 4 мМ глютамина (Gibco), пенициллин/стрептомицин (Gibco), 10 мМ Hepes pH 7,5 (Gibco). Для продуцирования CTLA-4-IgG клетки CHO-K1 повторно суспендируют при 1×10⁷ клеток/мл в DMEM/F12 и инкубируют вместе с вирусом Sindbis в течение одного часа при комнатной температуре. Затем клетки разбавляют до 1×10⁶/мл в DMEM/F12, содержащем 1% фетальной сыворотки теленка, обедненной IgG теленка с использованием Protein A Sepharose (Pharmacia), неэссенциальных аминокислот, 4 мМ глютамина, 12,5 мМ Hepes pH 7,5 и пенициллин/стрептомицин. Через сорок восемь часов после инфицирования клетки гранулируют и кондиционированные среды харвестируют и дополняют таблетками полного ингибитора протеазы (Boehringer Mannheim), доводят pH до 7,5 и фильтруют через 0,2 мкм (Nalgene). FPLC (Pharmacia) используют для афинной очистки белка слияния с использованием 5 мл колонки Protein A HiTrap (Pharmacia) при скорости потока 10 мл/мин. Колонку промывают 30 объемами слоя PBS и элюируют 0,1M глицин/HCl, pH 2,8 при 1 мл/мин. Фракции (1 мл) непосредственно нейтрализуют до pH 7,5 с помощью Трис pH 9. Фракции, содержащие CTLA-4-IgG1, идентифицируют посредством SDS-PAGE, а затем концентрируют с использованием Centriplus 50 (Amicon) перед нанесением на колонку Sepharosa 200 (Pharmacia) при 1 мл/мин с использованием PBS в качестве растворителя. Фракции, содержащие CTLA-4-IgG1, собирают, стерильно фильтруют через 0,2 мкм через 0,2 мкм (Millipore), аликвотируют и замораживают при -80°. CD44-IgG1 экспрессируют и очищают с использованием таких же способов. CD28-IgG очищают от кондиционированных сред и от нестационарно трансфицированных клеток Cos7.

Характеризация CTLA-4-IgG1:

Очищенный CTLA-4-IgG1 мигрирует как единая полоса при SDS-PAGE, с использованием окрашивания коллоидным Кумасси (Novex). При невосстанавливающий условиях CTLA-4-IgG1 представляет собой димер (100 кДа), затем восстанавливается до 50 кДа мономера, когда его обрабатывают 50 мМ DTT. Секвенирование аминокислот очищенного CTLA-4-IgG1 в растворе подтверждает N-окончания CTLA-4 (MHVAQPAVVLAS) и то, что сигнальный пептид онкостатин-M отщепляется от зрелого белка слияния. CTLA-4-IgG1 связывается посредством иммобилизованного B7.1-IgG концентрационно зависимым образом, и связывание блокируется антителом против CTLA-4 хомячка против человека (BNI3: PharMingen). Стерильный CTLA-4-IgG не содержит эндотоксинов и количественно определяется посредством OD280, используя 1,4 как коэффициент экстинкции. Выход очищенного CTLA-4-IgG находится в пределах 0,5-3 мг/литр клеток CHO-K1.

Пептид CTLA-4

Следующий пептид CTLA-4 получают, как описано ниже:

NH₂:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQ VNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEP CCONH₂

Сокращения/материалы

NMP, N-Метилпирролидинон; TFE, 2,2,2-Трифторэтанол; DCM, Дихлорметан; FMOC, флуоренилметоксикарбонил. Все реагенты поставляются Perkin Elmer со следующими исключениями: TFE, Aldrich Chemical, смола FMOC-PAL-PEG, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH; FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH и FMOC-Tyr(tBu)-OH используются для тех аминокислот, которые требуют защитных групп для боковых цепей.

Синтез пептидов

Синтез пептидов осуществляют на Perkin-Elmer 431A, модернизированном с помощью с отслеживания с обратной связью посредством УФ поглощения на 301 нм (детектор Perkin-Elmer Model 759A). Пептидную последовательность собирают на смоле FMOC-PAL-PEG с использованием условных циклов двойного связывания. Принудительные двойные связывания осуществляют на циклах 10, 11, 18, 19, 20 и 28-33. Смолу промывают 50% смесью DCM и TFE при завершении каждого цикла ацилирования, с последующим каппированием непрореагировавших аминогрупп с помощью уксусного ангидрида в NMP. Смолу удаляют из реактора после завершения цикла 49, а остаток продолжает взаимодействовать до завершения. Отщепление пептидов от смолы осуществляют с использованием Reagent K (King et al. International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) в течение 6 часов на 415 мг смолы, с получением 186 мг сырого пептида CTLA-4.

Характеризация пептидов

25 мг аликвоты сырого пептида CTLA-4 растворяют в 5 мл 6M гуанидин HCl/100 мМ K₂PO₃ при pH 6,4 и элюируют через колонку Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 мм × 600 мм, объем слоя 120 мл) с помощью 2M гуанидин HCl/100 мМ K₂PO₃ при pH 6,4, при скорости потока 2 мл/мин в течение 180 минут, собирая 5 мл фракции. Фракции анализируют посредством нанесения 1,7 мкл фракции на гель NuPAGE Laemeli, осуществляемого с протеканием буфера MES, и визуализации с использованием протоколов серебряного красителя Daichii. Те фракции, которые демонстрируют молекулярную массу 12 кДа, как оценивается посредством сравнения со стандартами молекулярных масс, собирают вместе и хранят при 4°C. Объединенные фракции анализируют посредством УФ и гель-электрофореза. Секвенирование аминокислот осуществляют посредством поглощения 100 микролитрового образца в картридже ProSorb (адсорбируется на мембране из PVDF) и промывки для удаления буферных солей. Секвенирование осуществляют на секвенсере Applied Biosystems 420. Наблюдают ожидаемую N-конечную последовательность (MHVAQPAVVLA). Иммуноблотинг демонстрирует, что пептид распознается антителом против CTLA-4 человека BNI3 (PharMingen). Для обессоливания аликвота, содержащая 648 мкг материала, помещается в диализную пробирку из MWCO на 3500 Да и диализуется по отношению к 0,1% TFA/H₂O при 4°C в течение 9 дней с перемешиванием. Все содержимое диализного мешка лиофилизируют до порошка.

Клетки “300.19”, трансфицированные антигеном пептида CTLA-4 (Y201V)

Полноразмерная цДНК CTLA-4 амплифицируется посредством PCR из библиотеки цДНК тимуса человека (Stratagene) и субклонируется в pIRESneo (Clontech). Мутация CTLA-4, которая приводит к конститутивной экспрессии на поверхности клетки, вводится с использованием MatchMaker Mutagenesis System (Promega). Мутация от тирозина Y201 до валина ингибирует связывание белка адаптина AP50, который является ответственным за быструю интернализацию CTLA-4 (Chuang, et al., J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Не содержащие микоплазмы клетки лимфомы грызунов 300.19 культивируют в RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, неэссенциальные аминокислоты, пенициллин/стрептомицин, 2 мМ глютамина, 12,5 мМ Hepes, pH 7,5, и 25 мкМ бета-меркаптоэтанола. Клетки подвергаются порообразованию (3×10⁶/0,4 мл RPMI, не содержащей сыворотки) в 1 мл камере с 20 мкг CTLA-4-Y201V/pIRESneo с использованием 200V/1180 мкФ (Gibco CellPorator). Клетки покоятся в течение 10 минут, а затем дополняются 8 мл предварительно нагретых сред RPMI. Через 48 часов клетки разбавляют до 0,5×10⁶/мл в полных средах RPMI, содержащих 1 мг/мл G418 (Gibco). Устойчивые клетки размножают, и, как показано, они экспрессируют CTLA-4 на поверхности клетки, используя антитело BNI3, конъюгированное с фикоэритрином (PharMingen). Клетки с высоким уровнем экспрессии выделяются посредством стерильной сортировки.

Иммунизация и генерирование гибридом

Мыши XenoMouse™ (возраст 8-10 недель) иммунизируются (i) подкожно в основание хвоста, с помощью 1×10⁷ клеток 300.19, которые трансфицируются для экспрессирования CTLA-4, как описано выше, повторно суспендированных в фосфатном солевом буфере (PBS) с полным адъювантом Фройнда, или (ii) подкожно в основание хвоста (a) 10 мкг CTLA-4 белка слияния или (b) 10 мкг пептида CTLA-4, эмульсифицированного в полном адъюванте Фройнда. В каждом случае дозировка в неполном адъюванте Фройнда повторяется три или четыре раза. За четыре дня перед слиянием мыши получают последнюю инъекцию иммуногена или клеток в PBS. Клетки селезенки и/или лимфоциты из лимфатических узлов иммунизированных мышей сливаются с [линией клеток P3 несекреторной миеломы грызунов] и подвергаются селекции HAT, как описано ранее (Galfre, G. and Milstein, C., "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures." Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Получают большую панель гибридом, все они секретируют специфичные к CTLA-4 антитела IgG2κ человека.

Следующие гибридомы, продуцирующие антитела против CTLA-4, обозначаемые следующим образом, находятся в American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209, на 29 апреля 2003 года:

Клон	Субклон	Депозит ATCC №
11.2.1 1	1.2.1.4	PTA-5169
4.1.1	4.1.1.1	PTA-5166

Пример 2

Этот Пример показывает генерирование рекомбинантных линий клеток млекопитающих, которые продуцируют антитела против CTLA-4.

ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи моноклонального антитела 11.2.1, клонируют из соответствующей линии клеток гибридом 11.2.1, и последовательности ДНК определяют с помощью способов, известных специалистам в данной области. По последовательности нуклеиновых кислот и предсказанной последовательности аминокислот антитела 11.2.1 определяют идентичность использования гена для каждой цепи антитела.

Вставки последовательности ДНК 11.2.1 затем субклонируются в векторы экспрессии. Впоследствии векторы экспрессии трансфицируются в клетку-хозяина миеломы мышей (NS0) для генерирования различных первичных линий клеток трансфектантов, которые продуцируют антитела против CTLA. Ведущая линия клеток выбирается на основе анализа роста и продуктивности. Ведущую линию позднее субклонируют для генерирования клонированной линии клеток.

Антитело против CTLA4 получают посредством культивирования клеток, с использованием линии клеток, в биологическом реакторе, содержащем среды для культивирования клеток. Среды дополняют питательными веществами во время продуцирования. После выполнения критериев харвестирования биореактор харвестируют либо посредством только фильтрования, либо посредством центрифугирования, с последующим фильтрованием. Затем осветленный супернатант очищают с помощью трех хроматографических стадий, включая афинную колонку Protein A и две ионообменных колонки. Инактивирование при низких pH и отфильтровывание вирусов также осуществляют для исключения из процесса любых потенциальных вирусов. Продукт концентрируют и подвергают диафильтрации в приготовленном буфере для получения лекарственного вещества.

Пример 3

Исследование осуществляют для оценки воздействия четырех различных буферов на агрегацию и фрагментацию антител.

Конкретно, приготавливают четыре жидких препарата, содержащих антитело против CTLA4 11.2.1, и дополняют буфером с ацетатом, сукцинатом, гистидином или EDTA. Затем препараты хранят при 40°C и осуществляют измерение агрегации и фрагментации антител на 0, 2, 5 и 7 неделях.

Приготовление буферных растворов

Приготавливают четыре буферных раствора, как описано в Таблице 3. Каждый раствор получают посредством растворения, сначала, некоторого количества видов буфера (перечисленных в Таблице 3) в воде (приблизительно 80% от целевого количества). Затем pH каждого раствора буфера доводят до 5,5 посредством добавления достаточного количества раствора кислоты или основания, отмеченного в Таблице 3. После установления pH добавляют дополнительное количество воды для получения конечной концентрации буфера 20 мМ. Концентрация буфера 20 мМ выбирается для обеспечения разумной стабильности pH при выбранном pH 5,5. Затем раствор буфера фильтруют через стерилизационный фильтр (размер пор 0,22 микрона) в стерилизованную емкость для последующего использования.

Таблица 3 Буферные растворы
Тип буфера	Виды буфера	Концентрация буфера (г/л)	Раствор кислоты/основания
Ацетат	Ацетат тригидрат натрия	2,74	1% объем/объем ледяной уксусной кислоты
Сукцинат	Янтарная кислота	2,36	1 M NaOH
Гистидин	L-Гистидин HCl моногидрат	4,19	1 M NaOH
EDTA	Динатрий EDTA дигидрат	7,45	5 M HCl

1% объем/объем раствор ледяной уксусной кислоты приготавливают посредством соответствующего разбавления (от 1 мл до 100 мл) ледяной уксусной кислоты (99,9%) водой. 1 молярный (M) раствор гидроксида натрия приготавливают посредством растворения 40 г твердого гидроксида натрия в 1 л воды. 5 молярный (M) раствор хлористоводородной кислоты приготавливают посредством соответствующего разбавления концентрированной хлористоводородной кислоты (37,8%) водой.

Приготовление препаратов антител

Препараты антител, которые оцениваются, перечислены в Таблице 4, ниже. Для получения каждого препарата некоторое количество изотонического агента (приведенное в мг/мл в Таблице 4) сначала добавляют в указанный буферный раствор, и раствор перемешивают до тех пор, пока изотонический агент не растворится. Объемный раствор антител от способа очистки, описанного в Примере 2, получают при 13,2 мг/мл в 20 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,5 + 140 мМ хлорида натрия. Замены буферов этого объемного раствора в указанных выше растворах препаратов осуществляют с помощью центрифужных концентраторов Amicon Ultra 15 MWCO10K (UFC901024), на центрифуге Beckman Coulter Allegra 21R, на 6500 об/мин при 5°C. Осуществляют обмены приблизительно 8 объемов и раствор антитела концентрируют при концентрации между 27 и 30 мг/мл. Приготавливают приблизительно 3-4 мл препаратов 1-18. Концентрации антител определяют с помощью метода спектрометрии в ультрафиолетовом видимом свете (UV-Vis), используя коэффициент экстинкции 1,43 (мг/мл)^-1 см^-1 на 280 нм.

Раствор 20 мг/мл полисорбата 80 (PS80) приготавливают посредством разбавления и растворения полисорбата 80 посредством соответствующего буфера для препарата, приготавливаемого, как описано выше. Затем полисорбат 80 добавляют к растворам антитела и буфера как концентрат 20 мг/мл, вместе с соответствующим количеством буфера, антитела, изотонического агента и воды, с получением 20 мг/мл конечного раствора моноклонального антитела против CTLA-4, в препарате, соответствующем композициям в Таблице 4, ниже.

К Препарату № 2 в Таблице 4 в этот момент добавляют PEG 3350 как концентрат 200 мг/мл.

Затем препараты фильтруют через 0,2 мкм стерилизирующие фильтры и заполняют во флаконы. Объем заполнения 0,5-1 мл используют в 2 мл стеклянных флаконах типа 1. Флаконы закрывают пробками Daikyo 777-1 с покрытием Flurotec®, заворачивают крышками на резьбе и помещают в камеры стабильности, сохраняемые вертикально при 40°C в течение 2, 5 и 7 недель. Флаконы промывают и обрабатывают в автоклаве, поскольку имеются 13 мм серологические пробки Daikyo 777-1. Идентичные флаконы непосредственно анализируют на уровни агрегации и фрагментации.

Таблица 4 Исследуемые препараты антитела
№ Препарата	Тип буфера 20 мМ, pH 5,5	Изотонический агент (мг/мл)	Поверхностно-активное вещество (мг/мл)
1	Ацетат	NaCl (9)	PS80 (0,2)
2	Ацетат	NaCl (9) + PEG3350 (10)	PS80 (0,2)
3	Ацетат	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
4	Ацетат	Сорбит (48)	PS80 (0,2)
5	Ацетат	Инозитол (48)	PS80 (0,2)
6	Ацетат	Маннит (41) + Глицин (2)	PS80 (0,2)

7	Сукцинат	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
8	Сукцинат	Сорбит (48)	PS80 (0,2)
9	Сукцинат	Инозитол (48)	PS80 (0,2)
10	Сукцинат	Маннит (41) + Глицин (2)	PS80 (0,2)

11	Гистидин	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
12	Гистидин	Сорбит (48)	PS80 (0,2)
13	Гистидин	Инозитол (48)	PS80 (0,2)
14	Гистидин	Маннит (41) + Глицин (2)	PS80 (0,2)

15	EDTA	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
16	EDTA	Сорбит (48)	PS80 (0,2)
17	EDTA	Инозитол (48)	PS80 (0,2)
18	EDTA	Маннит (41) + Глицин (2)	PS80 (0,2)

Анализ агрегации

Препараты антитела из Таблицы 4 хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 2, 5 и 7 каждый препарат анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Эксклюзионную хроматографию осуществляют с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазы, 0,2 M натрий-фосфатного буфера при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и УФ детектирования на 214 нм. Фигура 1 показывает проценты элюируемых высокомолекулярных частиц (то есть агрегатов моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1), измеренные в соответствующие времена для каждого из препаратов. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процента от общей площади пиков (см. Фигуру 1). Как можно увидеть на Фигуре 1, препараты с буфером EDTA показывают самые низкие уровни агрегации, затем следуют препараты с гистидиновым, ацетатным и сукцинатным буфером, в этом порядке.

Анализ фрагментации

Как отмечается выше, препараты антител из Таблицы 4 хранятся при температуре 40°C. На неделях 0, 2, 5 и 7 каждый препарат также анализируют на фрагментацию с использованием rSDS-PAGE. Анализ rSDS-PAGE осуществляют с использованием 4-12% геля бис-Трис NuPAGE и коллоидного голубого красителя (Кумасси). Для восстановленных гелей (rSDS-PAGE) восстановление достигается посредством восстанавливающего агента NuPAGE®. Общие гидролитические примеси (то есть фрагменты моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1) оценивают посредством сканирования, с использованием либо Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90 или Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Фигура 2 показывает процент фрагментации, измеренный в соответствующие времена, для каждого из препаратов. Уровни фрагментации вычисляют как процент от общего объема полосы (см. Фигуру 2). Как можно увидеть на Фигуре 2, препараты с буфером EDTA показывают самые низкие уровни фрагментации, затем идут препараты с гистидиновым, ацетатным и сукцинатным буфером, в этом порядке.

Таблица 5(a) (0 недель), Таблица 5(b) (2 недели), Таблица 5(c) (5 недель) и Таблица 5(d) (7 недель), ниже, приводят данные по агрегации и фрагментации, которые графически приведены на Фигурах 1 и 2.

Таблица 5(a) Результаты по агрегации и фрагментации в момент времени 0
№ Препарата	Процент агрегации	Процент фрагментации
1	0,4%	0,62%
2	0,4%	0,66%
3	0,3%	0,53%
4	0,4%	0,49%
5	0,4%	0,67%
6	0,3%	0,56%
7	0,3%	0,46%
8	0,4%	0,62%
9	0,4%	0,49%
10	0,3%	0,51%
11	0,3%	0,64%
12	0,3%	0,62%
13	0,3%	0,47%
14	0,3%	0,37%
15	0,3%	0,42%
16	0,3%	0,50%
17	0,3%	0,49%
18	0,3%	0,47%

Таблица 5(b) Результаты агрегации и фрагментации в момент времени 2 недели
№ Препарата	Процент агрегации	Процент фрагментации
1	0,7%	1,52%
2	0,7%	1,35%
3	0,5%	1,16%
4	0,5%	1,13%
5	0,5%	1,10%
6	0,4%	1,34%
7	0,6%	1,34%
8	0,6%	1,44%
9	0,6%	1,22%
10	0,5%	1,16%
11	0,4%	1,29%
12	0,4%	1,19%
13	0,4%	1,00%
14	0,4%	0,99%
15	0,5%	1,24%
16	0,5%	1,00%
17	0,5%	1,07%
18	0,5%	0,96%

Таблица 5(c) Результаты агрегации и фрагментации в момент времени 5 недель
№ Препарата	Процент агрегации	Процент фрагментации
1	0,8%	1,40%
2	0,9%	1,59%
3	1,2%	2,61%
4	1,1%	1,49%
5	1,0%	2,12%
6	0,6%	1,56%
7	1,7%	2,50%
8	1,4%	1,86%
9	1,4%	2,03%
10	0,9%	1,46%
11	0,6%	1,42%
12	0,7%	1,36%
13	0,6%	1,03%
14	0,5%	1,05%
15	0,5%	1,21%
16	0,5%	0,78%
17	0,6%	1,27%
18	0,5%	1,25%

Таблица 5(d) Результаты агрегации и фрагментации в момент времени 7 недель
№ Препарата	Процент агрегации	Процент фрагментации
1	1,4%	2,39%
2	1,2%	1,90%
3	1,4%	1,89%
4	1,8%	2,96%
5	1,3%	1,92%
6	1,1%	1,77%
7	1,2%	1,97%
8	2,2%	2,91%
9	2,4%	3,25%
10	1,3%	1,82%
11	0,9%	1,34%
12	0,9%	1,33%
13	0,7%	1,12%
14	0,6%	0,92%
15	0,6%	1,04%
16	0,6%	1,18%
17	0,6%	1,01%
18	0,6%	1,18%

Пример 4

Осуществляют исследование для оценки способности различных жидких препаратов, содержащих моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1, переносить множество циклов заморозки и оттаивания.

Способность жидкого препарата A выдерживать множество циклов заморозки/оттаивания часто оценивается для определения того, может ли препарат храниться (и, если по желанию, транспортироваться), замораживаться, затем оттаиваться для дальнейшего использования.

Препараты, которые оценивают, перечислены в Таблице 6, ниже. Процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описана в Примере 3. 2,5 мл Каждого раствора помещают в 5-мл стеклянные флаконы типа 1, закрывают пробками и герметизируют. Препараты, идентифицированные ниже как номера 1-4, 7-8, 11-12 и 15-16, являются идентичными препаратам, имеющим такие же численные идентификаторы, в Примере 3.

Таблица 6 Исследование препаратов антител
№ Препарата	Тип буфера 20 мМ, pH 5,5	Изотонический агент (мг/мл)	Поверхностно-активное вещество (мг/мл)
1	Ацетат	NaCl (9)	PS80 (0,2)
2	Ацетат	NaCl (9) + PEG3350 (10)	PS80 (0,2)
3	Ацетат	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
4	Ацетат	Сорбит (48)	PS80 (0,2)
19	Ацетат	Трегалоза (90)	PS80 (0,2)

20	Сукцинат	NaCl (9)	PS80 (0,2)
21	Сукцинат	NaCl (9) + PEG3350 (10)	PS80 (0,2)
7	Сукцинат	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
8	Сукцинат	Сорбит (48)	PS80 (0,2)

22	Гистидин	NaCl (9)	PS80 (0,2)
23	Гистидин	NaCl (9) +PEG3350 (10)	PS80 (0,2)
11	Гистидин	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
12	Гистидин	Сорбит (48)	PS80 (0,2)

24	EDTA	NaCl (9)	PS80 (0,2)
25	EDTA	NaCl (9) +PEG3350 (10)	PS80 (0,2)
15	EDTA	Сахароза (90)	PS80 (0,2)
16	EDTA	Сорбит (48)	PS80 (0,2)

Каждый препарат подвергают воздействию шести последовательных циклов заморозки/оттаивания. Первые три цикла осуществляют в морозильнике с контролируемой скоростью заморозки. Последние три цикла представляют собой более медленные циклы, осуществляемые с рядом наполненных водой флаконов, чтобы соответствовать высокой термической нагрузке, помещенной в морозильник или холодильник. Для циклов 1, 2 и 3 флаконы, содержащие препараты, помещают в морозильник с контролируемой скоростью заморозки (Planer Kryo 560-16) и подвергают воздействию следующего цикла: охлаждения препарата при скорости 0,2°C/мин до достижения температуры -70°C, выдерживания при -70°C в течение 1,5-3 часов и оттаивания препарата при скорости 0,3°C/мин до тех пор, пока не будет достигнута температура 5°C. Для циклов 4, 5 и 6 флаконы помещают в коробку вместе с другими заполненными водой флаконами (один флакон с образцом для каждого препарата; 17 флаконов с препаратами вместе, примерно, с 30 заполненными водой флаконами, в целом). Эту коробку затем помещают сначала в морозильник, поддерживаемый при температуре -70°C, приблизительно на 17 часов, а затем помещают в холодильник, поддерживаемый при температуре 2-8°C, приблизительно на 50 часов. Регистрация данных датчика температуры, помещенного в коробку, дает измерение средней скорости охлаждения 0,09°C/мин для процесса заморозки и среднюю скорость нагрева 0,03°C/мин для процесса оттаивания.

Каждый препарат оценивают визуально после каждого цикла заморозки/оттаивания относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности. Такие визуальные наблюдения каждого препарата осуществляют в световом боксе на черном и белом фоне, в то время как препарат по-прежнему является холодным после каждого оттаивания. Таблица 7 (ниже) приводит результаты.

Таблица 7 Визуальные оценки стабильности при заморозке/оттаивании антитела против CTLA-4 11.2.1
№	Описа-ние	1×ЗО	2×ЗО	3×З0	4×ЗО	5×ЗО	6×ЗО	% Увеличения количества частиц(SEC)
1	Ac + NaCl	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	мутный	множество частиц	множество частиц	0,7
2	Ac + NaCl +PEG	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	хопья	затуманенный с хлопьями	немного частиц	0
3	Ac + Саха-роза	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0,1
4	Ac + Сорбит	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0,1
19	Ac + Трега-лоза	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0
20	Сукци-нат + NaCl	немного частиц	немного частиц	большее количество частиц	большее количество частиц	затуманенный, хлопья, частицы	множество частиц	1,3
21	Сукци-нат + NaCl +PEG	бесцветный, нет частиц	меньшее количество частиц	немного частиц	затуманенный	затуманенный	немного частиц	0,2
7	Сукци-нат + саха-роза	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0,1
8	Сукци-нат + сорбит	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0
22	Гисти-дин + NaCl	бесцветный, нет частиц	мутный	мутный	затуманенный, хлопья	затуманенный	затуманенный, мутный, хлопья	1,1
23	Гисти-дин + NaCl +PEG	бесцветный, нет частиц	мутный	немного частиц	бесцветный, нет частиц	затуманенный, хлопья, немного частиц	немного частиц	0,1
11	Гисти-дин + саха-роза	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0,1
12	Гисти-дин + сорбит	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0
24	Ed + NaCl	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	затуманенный, меньшее количество частиц	множество частиц	множество частиц, затуманенный	0,1
25	Ed + NaCl +PEG	бесцветный, нет частиц	мутный, меньшее количество частиц	затуманенный, хлопья	затуманенный	затуманенный, хлопья	немного частиц	0
15	Ed + саха-роза	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0
16	Ed + сорбит	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	бесцветный, нет частиц	0,1

Препараты, содержащие только хлорид натрия (то есть хлоридные ионы), демонстрируют большее увеличение уровней растворимых частиц после циклирования заморозка/оттаивание, чем препараты, содержащим трегалозу, сахарозу или сорбит. Добавление PEG к препаратам, содержащим хлорид натрия, однако, видимо, уменьшает уровни растворимых частиц, измеряемые после циклирования заморозка/оттаивание, по сравнению с соответствующими препаратами, не содержащими PEG.

Анализ агрегации

В дополнение к этому процент увеличения количества растворимых частиц измеряют для каждого препарата после 6 последовательных циклов заморозки/оттаивания с использованием эксклюзионной хроматографии.

После шестого цикла заморозки/оттаивания каждый препарат анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионную хроматографию осуществляют, используя колонку с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижную фазу из 0,2 M натрий-фосфатного буфера при pH 7,0, при скорости потока 1 мл/мин и УФ детектировании на 214 нм. Таблица 7 показывает процент элюирования высокомолекулярных частиц (то есть агрегатов моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1), измеренный в соответствующие моменты времени для каждого препарата. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процента от общей площади пика (см. Таблицу 7). Как можно увидеть в Таблице 7, препараты, дополненные буфером EDTA, показывают самые низкие уровни агрегации, за которым следуют препараты, дополненные гистидиновым, ацетатным и сукцинатным буфером, в этом порядке.

Пример 5

Осуществляют исследование для оценки воздействия EDTA, метионина и анаэробных условий на обесцвечивание и агрегацию в жидких препаратах, содержащих моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1. Обесцвечивание и агрегация в таких жидких препаратах, как правило, являются нежелательными с точки зрения перспективы эстетики продукта, перспективы целостности продукта или их обеих.

Таблица 8, ниже, перечисляет виды обработки препаратов, которые оцениваются. Общая процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описана в Примере 3. Для этого Примера приготавливают исходный препарат, содержащий моноклональное антитело против CTLA-4 11.2.1 (5 мг/мл), натрий-ацетатный буфер (20 мМ), хлорид натрия (8,2 мг/мл) и полисорбат 80 (0,2 мг/мл), имеющий pH 5,5, и добавляют его в несколько 10-мл стеклянных флаконов, содержащих уплотнение сверху, чтобы дать возможность для асептического отбора образцов.

Различные обработки осуществляют на исходном препарате в соответствии с Таблицей 8, ниже. Как отмечается в Таблице 8, в некоторые флаконы добавляют метионин. Две различных концентрации EDTA добавляют в другие флаконы. Газообразный азот добавляют в пространство над жидкостью выбранных флаконов, содержащих EDTA или метионин. В дополнение к этому некоторые оставшиеся необработанные флаконы деаэрируют перед инъекцией газообразного азота в пространство над жидкостью в них. Кроме того, некоторые из оставшихся флаконов оставляют необработанными для использования в качестве экспериментальных контролей.

Два флакона от каждого из видов обработки в Таблице 8 хранят при 40°C в течение 0, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 и 18 недель. Один из двух сохраняемых флаконов в каждый момент времени используется для визуальной оценки цвета, в то время как из другого флакона асептически отбирают образец для измерения уровня агрегации антитела 11.2.1 после хранения. Таблицы 9 и 10 приводят результаты.

Таблица 8 Исследуемые обработки препарата антитела
№ Препарата	Идентификация обработки	Обработка
26	Без обработки	Нет
27	+ газообразный N₂ в пространстве над жидкостью	Замена газа в пространстве над жидкостью во флаконе на газообразный азот в лиофилизаторе посредством откачки и замены
28	+ Деаэрируют + газообразный N₂ в пространстве над жидкостью	Деаэрируют в лиофилизаторе, замена газа в пространстве над жидкостью во флаконе на азот в лиофилизаторе, как в №2, выше
29	+ 26,6 мМ Метионина	Добавляют 26,6 мМ метинона в виде твердого продукта
30	+ газообразный N₂ в пространстве над жидкостью + 26,6 мМ Метионина	Добавляют 26,6 мМ метионина в виде твердого продукта и заменяют газы в пространстве над жидкостью во флаконе на азот в лиофилизаторе, как в №2, выше
31	+ 0,005% Na₂EDTA	Добавляют 0,005% Na₂EDTA·2H₂O в виде твердого продукта
32	+ 26,6 мМ Метионина + 0,005% Na₂EDTA	Добавляют 26,6 мМ метионина и 0,005% Na₂EDTA·2H₂O в виде твердых продуктов
33	+ 0,01% Na₂EDTA	Добавляют 0,01% Na₂EDTA·2H₂O в виде твердого продукта

Анализ внешнего вида препарата

Каждый препарат оценивают визуально после 0 (начальный), 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 и 18 недель относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности. Визуальные наблюдения приведены в Таблице 9.

Результаты в Таблице 9 показывают, что препараты без EDTA и/или метионина развивают розовое окрашивание во флаконе после хранения, по меньшей мере, в течение 4 недель при 40°C. Хотя и не имея желания быть ограниченным какой-либо конкретной теорией, предполагается, что в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения это изменение цвета может вызываться, по меньшей мере, частично, окислительным процессом. Однако в других вариантах осуществления изменение цвета может вызываться любым количеством других процессов, которые не связаны с окислением.

Добавление газообразного азота в пространство над жидкостью флаконов, видимо, оказывает меньшее воздействие на уменьшение обесцвечивания, чем добавление метионина и/или EDTA, или вообще не оказывает никакого.

Анализ агрегации

Препараты антитела, обработанные в соответствии с Таблицей 8, хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 2, 6, 8, 10, 14, 16 и 18 каждый препарат анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионную хроматографию осуществляют с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазы из 0,2 M натрий-фосфатного буфера при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин, и УФ детектирования на 214 нм. Таблица 10 показывает процент элюирования высокомолекулярных частиц (то есть агрегатов антитела против CTLA-4 11.2.1), измеренный в соответствующие моменты времени для каждой обработки препарата. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процент от общей площади пика (см. Таблицу 10).

Таблица 10 Процент агрегации для обработок препарата в Таблице 8
№	Обработка флакона	Начальный	40°C 2 недели	40°C 4 недели	40°C 6 недель	40°C 8 недель	40°C 10 недель	40°C 12 недель	40°C 14 недель	40°C 16 недель	40°C 18 недель
26	Без обработки	0,2%	0,8%	2,3%	3,5%	4,6%	5,31%	4,3%	8,8%	7,7%	7,1%
27	+ N₂	0,2%	0,7%	2,3%	3,8%	4,4%	4,82%	4,5%	6,5%	6,0%	5,5%
28	+ Деаэрирование + N₂	0,2%	0,3%	0,9%	1,4%	2,5%	3,68%	4,3%	-	4,6%	4,8%
29	+ 26,6 мМ Метионина	0,2%	0,2%	0,5%	0,5%	0,6%	0,59%	0,5%	0,7%	0,8%	0,7%
30	+ N₂ + 26,6 мМ Метионина	0,2%	0,2%	0,5%	0,4%	0,4%	0,51%	0,5%	0,5%	0,7%	0,7%
31	+ 0,005% Na₂EDTA	0,2%	0,2%	0,4%	0,6%	0,5%	0,69%	0,8%	1,0%	1,0%	0,8%
32	+ 26,6 мМ Метионина + 0,005% Na₂EDTA	0,2%	0,3%	0,3%	0,4%	0,4%	0,35%	0,4%	0,8%	0,5%	0,7%
33	+ 0,01% Na₂EDTA	0,2%	0,2%	0,4%	0,6%	0,6%	0,73%	0,3%	1,2%	1,0%	1,2%

Результаты в Таблице 9 показывают, что препараты без EDTA и/или метионина начинают проявлять розовое окрашивание во флаконе после хранения, по меньшей мере, в течение 4 недель при 40°C. Как можно увидеть в Таблице 10, препараты, обработанные EDTA и/или метионином, показывают самые низкие уровни агрегации, за ними следуют обработанные газообразным азотом и необработанные контрольные препараты.

Пример 6

Осуществляют исследование для оценки воздействия метионина и EDTA на окисление определенных метиониновых остатков аминокислот в антителе против CTLA-4 11.2.1 после хранения в виде жидкого препарата.

Анализ окисления метионина

Уровни окисления метиониновых остатков в положениях аминокислот 256 и 432 в антителе против CTLA-4 11.2.1 измеряют способом картирования лизина-C после хранения в течение 8 недель при 40°C.

Стеклянные флаконы, содержащие препараты №№ 26, 29 и 33 (Таблица 8) и их обработки из Примера 5, подвергаются асептическому отбору образцов в момент времени 8 недель. Затем образцы расщепляются с помощью фермента Lyc-C в трис буфере при pH 8,0, при стандартных условиях, и анализируются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Разделение осуществляют с использованием аналитической колонки Grace Vydac Protein C4, с 0,1% TFA в воде и 0,085% TFA в ацетонитриле для градиентного элюирования.

Таблица 11 Процент окисления метиониновых аминокислот в антителе против CTLA-4 11.2.1 после обработок в Таблице 8
№ Препарата	Обработка	Процент окисления Met 432	Процент окисления Met 256
	Начальная	2,3%	4,9%
26	Без обработки	15,4%	32,9%
29	+ 26,6 мМ Метионина	0,5%	1,1%
33	+ 0,01% Na₂EDTA	1,6%	3,3%

Результаты в Таблице 11 показывают, что добавление метионина или EDTA к препарату антитела 11.2.1 понижает процент окисления на двух указанных метиониновых остатках, по сравнению с препаратом, сохраняемым без EDTA или метионина.

Пример 7

Осуществляют исследование для оценки окисления определенных триптофановых и тирозиновых остатков аминокислот в антителе против CTLA-4 11.2.1.

Препараты антитела против CTLA-4 11.2.1, которые проявляют розовое обесцвечивание со временем, как обнаружено, имеют характерный максимум поглощения на 500 нм после осуществления спектроскопии в ультрафиолетовом видимом свете (UV-Vis).

Процедура, используемая для приготовления препарата, является такой же, как описано в Пример 3. Для этого Примера препарат, содержащий раствор 5 мг/мл моноклонального антитела против CTLA-4 11.2.1 в 20 мМ натрий-ацетатного буфера, 8,2 мг/мл хлорида натрия и 0,2 мг/мл полисорбата 80 (при pH 5,5), хранят в двух стеклянных флаконах в течение 4 недель при 40°C, в это время препараты проявляют розовое обесцвечивание.

Раствор препарата в одном из обесцвеченных флаконов затем подвергается разделению по молекулярным массам посредством (порогового) фильтрования, которое позволяет эксципиентам препарата проходить через фильтровальное устройство, при этом оставляя антитела. Элюент после фильтрования (например, вода и эксципиенты) является прозрачным и бесцветным, в то время как собранная фракция (например, антитело 11.2.1) остается розовой. Таким образом, эксперимент по фильтрованию показывает, что розовое обесцвечивание относится к самому антителу 11.2.1 вместо того, чтобы быть связанным с эксципиентами препарата.

Затем второй флакон, имеющий розовое обесцвечивание, расщепляют с помощью трипсина при стандартных условиях и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, связанной с масс-спектрометрией (LC-MS). Разделение осуществляют с использованием аналитической колонки Grace Vydac Protein C4 с 0,1% TFA в воде и 0,085% TFA в ацетонитриле, в качестве градиентного элюирования. Отслеживается UV-Vis поглощение расщепленных пептидов на 500 нм, и соответствующие пептиды идентифицируются по отношению к их молекулярной массе.

Триптический пептид, который коррелирует с пиком поглощения на 500 нм, имеет последовательность аминокислот: GLEWVAVIWYDGSNK. Последовательность пептидов GLEWVAVIWYDGSNK затем расщепляется дополнительно с помощью Asp-N протеазы при стандартных условиях, и пик поглощения на 500 нм (UV-Vis) перемещается вместе с пептидом, расщепленным Asp-N протеазой, который имеет последовательность аминокислот: GLEWVAVIWY.

Поэтому, не имея желания ограничиваться какой-либо конкретной теорией, предполагается, что либо один, либо оба из двух триптофановых остатков аминокислот (W), или тирозинового остатка (Y) в пептиде, расщепленном протеазой (GLEWVAVIWY), представляют собой возможные центры окисления, которые могут быть ответственными за розовое обесцвечивание препарата антитела 11.2.1 в этом примере. В конкретных вариантах осуществления предполагается, что либо один, либо оба из двух триптофановых остатков аминокислот (W) в пептиде, расщепленном протеазой (GLEWVAVIWY), являются возможными центрами окисления, которые могут быть ответственными за розовое обесцвечивание.

В то же время является возможным также, что механизмы, иные, чем окисление, могут быть ответственными за одно или несколько конкретных обесцвечиваний (например, розовое и желтое), видимых в различных препаратах, оцениваемых здесь.

Пример 8

Осуществляют исследование для оценки воздействия EDTA и DTPA на обесцвечивание, агрегацию и фрагментацию антитела против CTLA-4 11.2.1.

Конкретно, приготавливают три жидких препарата, содержащих антитело 11.2.1, с EDTA и DTPA и без них. Препараты хранят при 40°C и оценки обесцвечивания, агрегации и фрагментации антитела осуществляют на 0, 2, 4, 6, 8 и 10 неделе.

Для этого Примера приготавливают 20 мг/мл раствора антитела против CTLA-4 в 20 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,5, с 8,2 мг/мл хлорида натрия и 0,2 мг/мл полисорбата 80 и разделяют между несколькими стеклянными флаконами, как описано в Примере 3, а затем обрабатывают посредством добавления EDTA или DTPA. EDTA и DTPA добавляют во флаконы с препаратом как твердые продукты. Несколько флаконов непосредственно анализируют на уровни обесцвечивания, агрегации и фрагментации, а несколько других идентичных флаконов также хранят в вертикальном положении при 40°C в течение 2, 4, 6, 8 и 10 недель.

Затем из обработанных и необработанных флаконов асептически отбирают образцы для измерения уровня агрегации и фрагментации антитела 11.2.1 в препаратах в моменты времени 2, 4, 6, 8 и 10 недель и наблюдают относительно обесцвечивания. Таблицы 12 и 13 приводят результаты.

Анализ внешнего вида препарата

Каждый препарат оценивают визуально после 0 (начальный), 2, 4, 6, 8 и 10 недель относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности. Визуальные наблюдения приведены в Таблице 12.

Таблица 12 Визуальные оценки обработок препаратов EDTA и DTPA
№	Обработка	0 недель Начальный	2 недели 40°C	4 недели 40°C	6 недель 40°C	8 недель 40°C	10 недель 40°C
26	Без обработки	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	Розовый	Розовый	Розовый
33	+ 0,01% Na₂EDTA. 2H₂O	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный
34	+ 0,01% DTPA	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный	прозрачный и бесцветный

Результаты в Таблице 12 показывают, что препараты без EDTA или DTPA проявляют розовое окрашивание во флаконе после хранения, по меньшей мере, в течение 6 недель при 40°C.

Анализ агрегации

Препараты антитела, обработанные в соответствии с Таблицей 12, хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 2, 6, 8 и 10 каждый препарат анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионную хроматографию осуществляют с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазы из 0,2 M натрий-фосфатного буфера при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и УФ детектировании на 214 нм. Таблица 13 показывает процент элюируемых высокомолекулярных масс частиц (то есть агрегатов антитела против CTLA-4 11.2.1), измеренных в соответствующие моменты временен для каждой обработки препарата. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц, как процента от общей площади пика (см. Таблица 13).

Как можно увидеть в Таблице 7, препараты, содержащие как EDTA, так и DTPA, показывают более низкие уровни агрегации, по сравнению с препаратом без EDTA или DTPA.

Пример 9

Осуществляют исследование для оценки воздействия EDTA и газообразного азота на стабильность антитела против CTLA-4 11.2.1.

Конкретно, влияние EDTA и газообразного азота на стабильность антитела 11.2.1 анализируют относительно обесцвечивания, агрегации, окисления, фрагментации и образования заряженных частиц в дополненных гистидиновым буфером препаратах, содержащих трегалозу и полисорбат 80.

Препараты, которые оценивают, перечислены в Таблице 13, ниже. Процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описано позже в Примере 10. Препараты хранят при 40°C и оценки стабильности осуществляют на 0, 4, 8, 12 и 24 неделях.

Для этого Примера приготавливают раствор 20 мг/мл антитела против CTLA-4 в 20 мМ гистидиновом буфере при pH 5,5 с 84 мг/мл трегалозы и 0,2 мг/мл полисорбата 80, как в Примере 10. Одну часть препарата приготавливают посредством разбавления концентрированного исходного раствора антитела с помощью исходных растворов трегалозы и полисорбата 80 до конечной композиции при 20 мг/мл антитела против CTLA-4. Вторую часть препарата приготавливают подобным же образом, за исключением дополнительной стадии добавления 10 мг/мл концентрата Na₂EDTA·2H₂O до достижения конечной концентрации 0,1 мг/мл. Затем препараты распределяют по 1 мл в 2 мл стеклянные флаконы. Половину флаконов каждого препарата затем помещают в лиофилизатор, и газы в пространстве над жидкостью заменяют азотом, после откачки. После загрузки флаконов азотом зарегистрированные измерения уровня кислорода в них составляют от примерно 1,5% до 1,6% кислорода, в то время как во флаконах с воздухом в пространстве над жидкостью регистрируется от примерно 19,7% до 20% кислорода.

Несколько флаконов анализируют непосредственно на уровни обесцвечивания, агрегации, фрагментации, окисления и образования заряженных частиц, а несколько других идентичных флаконов также хранятся в вертикальном положении при 40°C в течение 2, 4, 8, 12 и 24 недель. В каждый момент времени два сохраняемых флакона на каждую обработку вынимают из каждых условий для измерения уровня агрегации, фрагментации, окисления и образования заряженных частиц в препаратах антитела 11.2.1 и наблюдают на обесцвечивание. Таблицы 14-18 приводят результаты.

Таблица 13 Исследуемые препараты антитела
№	Пространство над жидкостью во флаконе	Буфер	Изотонический агент	Поверхностно-активное вещество	Хелатирующий агент
35	Воздух	Гистидин	Трегалоза	Полисорбат 80	-
36	Азот	Гистидин	Трегалоза	Полисорбат 80	-
37	Воздух	Гистидин	Трегалоза	Полисорбат 80	EDTA
38	Азот	Гистидин	Трегалоза	Полисорбат 80	EDTA

Анализ внешнего вида препаратов

Каждый препарат оценивают визуально после 0 (начальный), 4, 8, 12 и 24 недель относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности. Визуальные наблюдения приведены в Таблице 14.

Таблица 14 Визуальные оценки после обработок препаратов в Таблице 13
№	Обработка	0 недель Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
35	+ Воздух в пространстве над жидкостью	прозрачный, частиц нет	очень слабо розовый, меньше 3 частиц	очень слабо розовый, частиц нет	слабо розовый частиц нет	слабо розовый, частиц нет
36	+ Азот в пространстве над жидкостью	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	очень слабо розовый, частиц нет	очень слабо розовый, частиц нет
37	+ Воздух в пространстве над жидкостью + EDTA	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	прозрачный, меньше 3 частиц	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет
38	+ Азот в пространстве над жидкостью + EDTA	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет	прозрачный, частиц нет

Результаты в Таблице 14 показывают, что препарат без EDTA или газообразного азота проявляет розовое окрашивание после хранения в течение 4 недель при 40°C. Таблица 14 также показывает, что в препарате, имеющем пространство над жидкостью во флаконе, где воздух заменен газообразным азотом, замедляется наступление розового обесцвечивания до недели 12. Оба препарата, содержащие EDTA, не имеют видимого цвета обесцвечивания, по меньшей мере, в течение 24 недель.

Анализ агрегации

Препараты антител, приготовленные в соответствии с Таблицей 13, хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 4, 8, 12 и 24 каждый препарат анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Из флаконов с препаратами асептически отбирают образцы в каждый момент времени. Эксклюзионную хроматографию осуществляют на образцах с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазой из 0,2 M натрий-фосфатного буфера, при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и УФ детектировании на 214 нм. Таблица 15 показывает процент элюируемых высокомолекулярных частиц (то есть агрегатов антитела против CTLA-4 11.2.1), измеренный в соответствующие моменты времени, для каждой из обработок препарата. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процент от общей площади пика (см. Таблицу 15).

Таблица 15 Процент агрегации для препаратов в Таблице 13
№ Препарата	Обработка	0 недель Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
35	+ Воздух в пространстве над жидкостью	0,7%	0,9%	1,3%	1,5%	3,9%
36	+ Азот в пространстве над жидкостью	0,7%	0,6%	0,7%	1%	1,5%
37	+ Воздух в пространстве над жидкостью + EDTA	0,7%	0,6%	0,8%	0,9%	1,5%
38	+ Азот в пространстве над жидкостью + EDTA	0,7%	0,6%	0,6%	0,8%	1,1%

Как можно увидеть в Таблице 15, препарат, содержащий EDTA, препарат с газообразным азотом и препарат с EDTA плюс газообразный азот показывают более низкие уровни агрегации со временем, по сравнению с препаратом без EDTA и содержащим воздух в пространстве над жидкостью.

Анализ ферментации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 13, хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 4, 8, 12 и 24 каждый препарат анализируют на общие гидролитические примеси (то есть фрагментацию) с использованием восстановленного SDS-PAGE (rSDS-PAGE). Из флаконов с препаратами асептически отбирают образцы в каждый в момент времени и нагружают на 4-12% гели бис-Трис NuPAGE вместе с коллоидным голубым красителем (Кумасси). Восстановление геля достигается посредством использования восстанавливающего агента NuPAGE®. Процент примесей (то есть фрагментации) для каждой полосы образца в восстановленных гелях оценивают посредством сканирования либо на Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, либо Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Уровень фрагментации вычисляют как процент от общего объема полосы (см. Таблицу 16).

Таблица 16 Общий процент (примесей) фрагментации для препаратов в Таблице 13
№ Препарата	Обработка	0 недель Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
35	+ Воздух в пространстве над жидкостью	1,3%	4,1%	5,5%	8,0%	12,4%
36	+ Азот в пространстве над жидкостью	1,2%	3,5%	4,4%	6,3%	10,6%
37	+ Воздух в пространстве над жидкостью + EDTA	1,3%	3,2%	4,4%	5,9%	10,6%
38	+ Азот в пространстве над жидкостью + EDTA	1,3%	3,5%	4,1%	5,6%	10,2%

Как можно увидеть в Таблице 16, препарат, содержащий EDTA, препарат с газообразным азотом и препарат с EDTA плюс газообразный азот показывают более низкие уровни фрагментации со временем, по сравнению с препаратом без EDTA и содержащим воздух в пространстве над жидкостью.

Формирование кислотных и основных частиц

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 13, хранят при температуре 40°C. На неделях 0, 4, 12 и 24 каждый препарат анализируют на образование кислотных и основных частиц с использованием капиллярного электрофореза с анализом изображений (iCE). Капиллярный электрофорез с анализом изображений осуществляют с использованием анализатора Convergent Biosciences

iCE₂₈₀ для оценки гетерогенности заряда. Convergent iCE₂₈₀ представляет собой инструмент для капиллярного изоэлектрического фокусирования с анализом изображений (IEF), который позволяет пользователю получить изображения разделенного образца, содержащегося в капилляре.

Из флаконов с препаратом асептически отбирают образцы в каждый момент времени. Затем образцы приготавливают в смеси электрофоретических амфолитов, метилцеллюлозы, калибровочных маркеров и воды. Образцы вводятся в iCE₂₈₀ и прикладывается высокий потенциал/напряжение. Анализ IEF осуществляют с использованием приготовленных вручную 10,5 полиакриламидных гелей, pH 3, используя голубой краситель Кумасси. Белковые компоненты образца разделяются в соответствии с их относительными изоэлектрическими точками (pI) и их положением. Относительное количество каждого выделенного компонента наблюдают посредством получения изображений с помощью цифровой камеры. Затем данные обрабатывают и приводят как потери главного пика (то есть образование кислотных и основных частиц) с использованием обычного интегрирующего программного обеспечения для хроматографии (см. Таблицу 17).

Таблица 17 Потери главного пика для препаратов в Таблице 13
№ Препарата	Обработка	0 недель Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
35	+ Воздух в пространстве над жидкостью	65,3	50,3	---	28,8	15,5
36	+ Азот в пространстве над жидкостью	63,8	52,2	---	33,1	22,7
37	+ Воздух в пространстве над жидкостью + EDTA	62,3	55,4	---	37,0	23,4
38	+ Азот в пространстве над жидкостью + EDTA	63,9	56,6	---	40,0	24,8

Как можно увидеть в Таблице 17, препарат, содержащий EDTA, препарат с газообразным азотом и препарат EDTA плюс газообразный азот показывают более высокие уровни интактного главного пика со временем, по сравнению с препаратом без EDTA и содержащим воздух в пространстве над жидкостью. Таким образом, величина образования кислотных и основных частиц больше со временем в препаратах, где нет EDTA и/или газообразного азота в пространстве над жидкостью.

Анализ окисления аминокислот

Уровни окисления метиониновых остатков в положениях аминокислот 256 и 432 в антителе против CTLA-4 11.2.1 измеряют с помощью метода картирования лизина-C после хранения в течение 12 недель при 40°C.

Из флаконов, содержащих препараты из Таблицы 13, асептически отбирают образцы в момент времени 12 неделя. Затем образцы расщепляют с помощью фермента лизилэндопептидазы (Lys-C) в трис буфере при pH 8,0, при стандартных условиях, и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Разделение осуществляют с использованием аналитической колонки Grace Vydac Protein C4, с 0,1% TFA в воде и 0,085% TFA в ацетонитриле, в качестве градиента элюирования.

Таблица 18 Процент окисления метиониновых аминокислот в антителе против CTLA-4 11.2.1 в препаратах из Таблицы 13
№ Препарата	Обработка	Аминокислотный остаток	Процент окисления 0 недель	Процент окисления 12 недель
35	+ Воздух в пространстве над жидкостью	Met-432	1,6%	7,3%
Met-256	5%	17,9%
36	+ Азот в пространстве над жидкостью	Met-432	1,6%	3,3%
Met-256	5%	7,8%
37	+ Воздух в пространстве над жидкостью + EDTA	Met-432	1,6%	3,9%
Met-256	5%	9,7%
38	+ Азот в пространстве над жидкостью + EDTA	Met-432	1,6%	2,6%
Met-256	5%	5,9%

Результаты в Таблице 18 показывают, что добавление EDTA к препарату антитела 11.2.1 и/или добавление газообразного азота в пространство над жидкостью во флаконе уменьшает процент окисления на двух указанных метиониновых остатках, по сравнению с препаратом без EDTA и содержащим воздух в пространстве над жидкостью.

Пример 10

Осуществляют исследование для сравнения воздействия на стабильность препаратов антитела против CTLA-4 11.2.1, содержащих натрий-ацетатный буфер и хлорид натрия (то есть хлоридные ионы), по сравнению с препаратами, содержащими гистидиновый буфер и трегалозу.

Конкретно, воздействие на стабильность антитела 11.2.1 анализируют по отношению к обесцвечиванию, агрегации и фрагментации.

Препараты, которые оценивают, перечислены в Таблице 19, ниже. Процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описано в Примере 3.

Препараты в Таблице 19 приготавливают посредством использования 11,9 мг/мл исходного раствора антитела 11.2.1 в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,5, 140 мМ хлорида натрия и воздействия на него стадии ультрафильтрования/диафильтрования (UF/DF) в Millipore Lab Scale TFF System с 50 см² мембраной Pellicon XL PBTK 30K. Затем концентрированные растворы антитела 11.2.1 приготавливают в диапазоне 35-40 мг/мл, в 20 мМ натрий-ацетатном или 20 мМ гистидиновом буфере.

Концентраты изотонического агента приготавливают либо в натрий-ацетатном, либо в гистидиновом буфере, при концентрациях в три раза больших, чем целевые конечные концентрации. Концентрированный раствор полисорбата 80 приготавливают при 20 мг/мл, и 10 мг/мл Na₂EDTA.2H₂O в каждом из буферов. Индивидуальные препараты приготавливают посредством разбавления концентрированных растворов соответствующим образом. Затем препараты фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют в несколько идентичных флаконов. Объем заполнения 1 мл используют в 2-мл стеклянных флаконах типа 1. Флаконы закрывают пробками с покрытием Flurotec® Daikyo 777-1, заворачивают крышками на резьбе и хранят в вертикальном положении в камерах стабильности при 25°C и 40°C. Другой набор флаконов также размещают при -20°C в течение 4 недель, а еще один набор подвергают воздействию 4x циклов заморозки/оттаивания (коробка с флаконами, заполненными водой), как описано в Примере 4. Все препараты имеют pH 5,5 и концентрацию антитела против CTLA-4 11.2.1 20 мг/мл.

Несколько флаконов непосредственно анализируют на уровни обесцвечивания, агрегации и фрагментации, а несколько других идентичных флаконов также хранятся в вертикальном положении при 25°C и 40°C в течение 4, 8, 12, 18, 24 и 36 недель. В каждый в момент времени два сохраняемых флакона для каждого препарата вынимаются из каждого условия для измерения уровня агрегации, фрагментации, а также наблюдения обесцвечивания антитела 11.2.1. Таблицы 20-24 и Фигуры 3 и 4 приводят результаты.

Таблица 19 Исследуемые препараты антитела
№	Ацетат (мМ)	Гистидин (мМ)	Tween 80 (мг/мл)	Хлорид натрия (мг/мл)	Маннит (мг/мл)	Трегалоза (мг/мл)	Глицин (мг/мл)	EDTA (мг/мл)	PEG 3350 (мг/мл)	Метионин (мг/мл)
26	20	---	0,2	8,2	---	---	---	---	---	---
39	20	---	0,2	5,0	18	---	---	0,1	---	---
40	-	20	0,2	---	---	84	---	---	---	---
37	-	20	0,2	---	---	84	---	0,1	---	---
41	-	20	0,2	---	---	84	---	0,1	---	2
42	-	20	0,4	---	---	84	---	0,1	---	---
43	-	20	0,2	---	41	10	---	---	---	---
44	-	20	0,2	---	41	10	---	0,1	---	---

Анализ внешнего вида препарата

Каждый препарат оценивают визуально после 1) начального смешивания препарата, 2) заморозки препарата при -20°C в течение 4 недель и 3) после 4 циклов заморозки/оттаивания (от -70°C до 5°C в коробке вместе с заполненными водой флаконами, как описано в Примере 4). Каждый препарат оценивают визуально после 0 (начальный), 8, 12 и 24 недель относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности. Препараты оценивают относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности, и результаты приведены в Таблице 20 (заморозка/оттаивание), Таблица 21 (хранение при 25°C) и Таблица 22 (хранение при 40°C).

Результаты в Таблицах 20-22 показывают, что препараты антитела 11.2.1, содержащие EDTA, имеют пониженное обесцвечивание, пониженную мутность и пониженное образование частиц, по сравнению с препаратами без EDTA. В целом, препараты, содержащие хлорид натрия, имеют повышенное обесцвечивание, мутность и образование частиц, по сравнению с препаратами, содержащими EDTA, но без хлорида натрия.

Анализ агрегации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 19, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 12, 24 и 36 препараты, сохраняемые при 25°C, анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. На неделях 4, 8, 12 и 24 препараты, сохраняемые при 40°C, анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Из флаконов с препаратом асептически отбирают образцы в каждый момент времени. Эксклюзионную хроматографию осуществляют на образцах с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазой из 0,2 M натрий-фосфатного буфера, при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и с помощью УФ детектирования на 214 нм. Таблицы 23(a) и 23(b) показывают процент агрегации антитела 11.2.1, измеренный в соответствующие моменты времени для каждой из обработок препарата. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процент от общей площади пика (см. Таблицы 23(a) и 23(b)).

Таблица 23(a) Процент агрегации для препаратов в Таблице 19 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	12 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C	36 недель 25°C
26	0,7%	0,9%	0,9%	1,1%	1,8%	1,8%	3,0%
39	0,7%	0,8%	0,8%	1,1%	---	---	---
40	0,6%	0,6%	0,7%	0,9%	0,95%	0,8%	0,9%
37	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%	0,7%	0,8%
41	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%	0,7%	0,7%
42	0,6%	0,6%	0,6%	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%
43	0,6%	0,6%	---	---	0,7%	0,8%	0,9%
44	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%	0,8%	0,8%

Таблица 23(b) ниже приводит данные по агрегации, которые графически представлены на Фигуре 3.

Таблица 23(b) Процент агрегации для препаратов в Таблице 19 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
26	0,7%	1,0%	1,3%	2,8%	4,7%
39	0,6%	1,0%	1,0%	1,4%	---
40	0,6%	0,7%	0,9%	1,0%	1,4%
37	0,6%	0,6%	0,6%	0,8%	1,1%
41	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,8%
42	0,6%	0,6%	0,6%	0,8%	1,1%
43	0,6%	0,8%	---	---	1,7%
44	0,6%	0,6%	0,6%	0,8%	0,9%

Как можно увидеть в Таблицах 23(a), 23(b) и на Фигуре 3, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни агрегации, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащими ацетатный буфер и хлорид натрия, после хранения при 25°C и 40°C. Кроме того, препарат, содержащий гистидиновый буфер (без EDTA), имеет пониженную величину агрегации, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащим ацетатный буфер и хлорид натрия.

Анализ ферментации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 19, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 12, 18 и 36 недель каждый препарат анализируют на общие гидролитические примеси (то есть фрагментацию) с использованием восстановленного SDS-PAGE (rSDS-PAGE). Из флаконов с препаратами асептически отбирают образцы в каждый момент времени и загружают на 4-12% гели бис-Трис NuPAGE с коллоидным голубым красителем (Кумасси). Восстановление геля достигается посредством использования восстанавливающего агента NuPAGE®. Процент примеси (то есть фрагментации) полосы каждого образца в восстановленных гелях оценивают посредством сканирования либо на Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, либо на Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Уровень фрагментации вычисляют как процент от общего объема полосы (см. Таблицы 24(a) и 24(b)).

Таблица 24(a) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 19 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	12 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недель 25°C	36 недель 25°C
26	1,8%	1,6%	2,6%	2,4%	1,3%	3,5%	3,7%
39	1,6%	1,4%	2,4%	1,5%	---	---	---
40	1,6%	1,7%	2,6%	1,4%	1,4%	3,3%	3,2%
37	1,6%	1,6%	2,5%	1,4%	1,4%	3,3%	3,1%
41	1,6%	1,6%	2,6%	1,4%	1,2%	3,3%	2,9%
42	1,9%	1,8%	2,5%	1,6%	1,2%	3,0%	2,9%
43	1,8%	1,8%	---	---	1,2%	3,2%	3,1%
44	1,7%	1,7%	2,6%	1,4%	1,3%	3,1%	2,8%

Таблица 24(b), ниже, приводит данные по фрагментации, которые графически представлены на Фигуре 4.

Таблица 24(b) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 19 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недель 40°C	8 недель 40°C	12 недель 40°C	24 недели 40°C
26	1,8%	5,2%	6,1%	7,8%	11,7%
39	1,6%	5,3%	6,7%	6,5%	---
40	1,6%	5,3%	6,8%	6,2%	10,0%
37	1,6%	5,2%	6,6%	5,5%	10,2%
41	1,6%	5,2%	5,0%	5,5%	10,0%
42	1,9%	5,3%	5,1%	5,8%	9,7%
43	1,8%	5,3%	---	---	11,0%
44	1,7%	4,5%	5,2%	5,5%	9,5%

Как можно увидеть в Таблицах 24(a), 24(b) и Фигуре 4, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни фрагментации, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащим ацетатный буфер и хлорид натрия, после хранения при 25°C и 40°C.

Пример 11

Осуществляют исследование для сравнения воздействия различных концентраций EDTA на стабильность препаратов антитела против CTLA-4 11.2.1. Также исследуются альтернативы для препарата с гистидиновым буфером - трегалозой, посредством замены части трегалозы маннитом.

Конкретно, воздействие на стабильность антитела 11.2.1 анализируют относительно обесцвечивания, агрегации, фрагментации и окисления.

Препараты, которые оценивают, перечислены в Таблице 25, ниже. Процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описано в Примере 10.

Препараты в Таблице 25 приготавливают посредством использования 11,9 мг/мл исходного раствора антитела 11.2.1 в 20 мМ натрий-ацетатного буфера pH 5,5, 140 мМ хлорида натрия и воздействия на него стадий ультрафильтрования/диафильтрования (UF/DF) в Millipore Lab Scale TFF System с 50 см² мембраной Pellicon XL PBTK 30K. Затем приготавливают концентрированные растворы антитела 11.2.1 в диапазоне от 35 до 40 мг/мл, в 20 мМ натрий-ацетатном или 20 мМ гистидиновом буфере.

Приготавливают концентраты изотонического агента либо в натрий-ацетатном, либо в гистидиновом буфере, при концентрациях в три раза больших, чем целевые конечные концентрации. Приготавливают концентрированный раствор полисорбата 80 при 20 мг/мл, и Na₂EDTA·2H₂O, при 10 мг/мл, в каждом из буферов. Индивидуальные препараты приготавливают посредством соответствующего разбавления концентрированных растворов. Концентрации EDTA (в виде Na₂EDTA·2H₂O) исследуют в пределах 0-0,1 мг/мл. Затем препараты фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют в несколько идентичных флаконов. Объем заполнения 1 мл используют в 2-мл стеклянных флаконах типа 1.

Флаконы закрывают пробками с покрытием Flurotec® Daikyo 777-1, заворачивают крышками на резьбе и хранят в вертикальном положении в камерах стабильности при 25°C и 40°C. Другой набор флаконов подвергают воздействию 4 циклов заморозки/оттаивания, как описано в Примере 10. Все препараты имеют pH 5,5 и концентрацию антитела против CTLA-4 11.2.1 20 мг/мл.

Несколько флаконов непосредственно анализируют относительно уровней обесцвечивания, агрегации, фрагментации и окисления, а несколько других идентичных флаконов также хранят в вертикальном положении при 25°C и 40°C в течение 4, 8, 13, 18 и 24 недель. В каждый момент времени два сохраняемых флакона для каждого препарата из каждых условий вынимают для измерения уровня агрегации, фрагментации антитела 11.2.1, а также наблюдают относительно обесцвечивания. Таблицы 26-31 и Фигуры 5-10 приводят результаты.

Таблица 25 Исследуемые препараты антитела
№	Ацетат (мМ)	Гистидин (мМ)	Tween 80 (мг/мл)	Маннит (мг/мл)	Трегалоза (мг/мл)	EDTA (мг/мл)	Хлорид натрия (мг/мл)
26	20	---	0,2	---	---	---	8,4
40	---	20	0,2	---	84	---	---
45	---	20	0,2	---	84	0,001	---
46	---	20	0,2	---	84	0,005	---
47	---	20	0,2	---	84	0,01	---
48	---	20	0,2	---	84	0,05	---
37	---	20	0,2	---	84	0,1	---
49	---	20	0,2	10	70	0,001	---
50	---	20	0,4	10	70	0,01	---
51	---	20	0,2	10	70	0,1	---
52	---	20	0,2	20	50	0,001	---
53	---	20	0,2	20	50	0,01	---
54	---	20	0,2	20	50	0,1	---

Анализ внешнего вида препаратов

Каждый препарат оценивают визуально после 1) начального смешивания препарата, 2) после 4 циклов заморозки/оттаивания и 3) после хранения при 25°C и 40°C в течение 4, 8, 13, 18 и 24 недель. Препараты оценивают относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности, и данные приведены в Таблицах 26-28.

Таблица 26 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 25 после заморозки/оттаивания
№ Препарата	Начальный	После 4X циклов заморозки/оттаивания
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо затуманенный, нет частиц
40	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный бесцветный, меньше 3 частиц
45	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
46	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
47	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
48	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, больше, меньше 3 частиц
37	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
49	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, больше, меньше 3 частиц
50	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
51	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
52	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
53	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
54	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц

*Y6 и Y4 представляют собой обозначения шкалы цветов на EP Yellow scale. Y6 является менее желтым, чем Y4 (ссылка: PhEur 5,0, 2005 Monograph 2,2.2).

Таблица 28 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 25 после хранения при 40°C
№	Начальный	8 недель 40°C	13 недель 40°C	18 недель 40°C	24 недели 40°C
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо розовый, частиц нет	очень слабо розовый, нет частиц	розовый, частиц нет	розовый, нет частиц
40	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо розовый, частиц нет	очень слабо розовый, нет частиц	---	прозрачный, Y4*, нет частиц
45	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
46	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
47	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
48	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
37	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
49	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
50	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
51	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
52	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
53	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
54	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц

Результаты в Таблицах 26-28 показывают, что препараты антитела 11.2.1, содержащие все исследуемые концентрации EDTA, имеют пониженное обесцвечивание, пониженную мутность и пониженное образование частиц, по сравнению с препаратами без EDTA.

В целом, препараты, содержащие хлорид натрия, имеют пониженную защиту при заморозке/оттаивании, что доказывается повышением обесцвечивания, мутности и образования частиц, по сравнению с препаратами, содержащими EDTA, но без хлорида натрия.

Анализ агрегации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 25, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 13, 18 и 24, 25°C и 40°C препараты анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Из флаконов асептически отбирают образцы в каждый момент времени. Эксклюзионную хроматографию осуществляют на образцах с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазой из 0,2 M натрий-фосфатного буфера при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и УФ детектировании на 214 нм. Таблица 29(a) показывает процент агрегации антитела 11.2.1, измеренный после хранения при 25°C в соответствующие моменты времени, для каждого из препаратов. Таблица 29(b) показывает процент агрегации антитела 11.2.1, измеренный после хранения при 40°C. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процент от общей площади пика (см. Таблицы 29(a) и 29(b)).

Таблица 29(a) Процент агрегации для препаратов в Таблице 25 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	13 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C
26	0,8%	---	---	1,1%	1,6%	---
40	0,7%	---	---	0,7%	0,8%	0,8%
45	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%
46	0,7%	---	---	0,6%	0,7%	0,7%
47	0,7%	0,7%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%
48	0,7%			0,6%	0,7%	0,7%
37	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	0,7%	0,7%
49	0,7%	---	---	0,6%	---	---
50	0,7%	---	---	0,6%	---	---
51	0,7%	---	---	0,6%	---	0,7%
52	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	---
53	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	0,7%
54	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	---

Таблица 29(b) ниже приводит данные по агрегации, которые графически представлены на Фигуре 5.

Таблица 29(b) Процент агрегации для препаратов в Таблице 25 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	13 недель 40°C	18 недель 40°C	24 недели 40°C
26	0,8%	---	3,1%	4,3%	5,2%	---
40	0,7%	---	0,9%	1,2%	1,8%	2,7%
45	0,7%	0,6%	0,8%	0,8%	1,0%	1,4%
46	0,7%	---	0,7%	0,8%	1,0%	1,3%
47	0,7%	0,6%	0,7%	0,8%	0,8%	1,1%
48	0,7%	---	0,7%	0,8%	0,9%	1,3%
37	0,7%	0,7%	0,7%	0,8%	1,0%	1,1%
49	0,7%	---	0,8%	0,8%	---	---
50	0,7%	---	0,7%	0,8%	---	---
51	0,7%	---	0,8%	0,8%	---	1,2%
52	0,7%	0,6%	0,7%	0,8%	---	---
53	0,7%	0,7%	0,7%	0,7%	---	1,2%
54	0,7%	0,6%	0,8%	0,7%	---	---

Как можно увидеть в Таблицах 29(a), 29(b) и на Фигуре 5, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни агрегации при всех исследуемых концентрациях EDTA, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащими ацетатный буфер и хлорид натрия, после хранения при 25°C и 40°C. Фигура 7 графически показывает уменьшение процента агрегации для препаратов из Таблицы 25 как функцию концентраций EDTA.

Анализ ферментации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 25, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 13, 18 и 24, 25°C и 40°C препараты анализируют на общие гидролитические примеси (то есть на фрагментацию) с использованием восстановленного SDS-PAGE (rSDS-PAGE). Из флаконов с препаратами асептически отбирают образцы в каждый момент времени и загружают на 4-12% гели бис-Трис NuPAGE с коллоидным голубым красителем (Кумасси). Восстановление геля достигается посредством использования восстанавливающего агента NuPAGE®. Процент примеси (то есть фрагментации) полосы каждого образца в восстановленных гелях оценивают посредством сканирования либо на Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, либо на Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Уровень фрагментации вычисляют как процент от общего объема полосы (см. Таблицы 30(a) и 30(b)).

Таблица 30(a) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 25 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	13 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C
26	1,3%	---	---	3,3%	3,7%	---
40	1,1%	---	---	2,6%	3,1%	3,1%
45	1,5%	2,7%	2,3%	3,1%	3,0%	3,4%
46	1,0%	---		2,5%	3,1%	2,9%
47	2,5%	2,5%	2,3%	3,1%	3,0%	3,3%
48	3,1%	---	---	2,5%	3,2%	2,9%
37	3,6%	2,6%	2,3%	3,1%	3,0%	3,3%
49	1,0%	---	---	2,6%	---	---
50	1,1%	---	---	2,7%	---	---
51	1,2%	---	---	2,7%	---	2,9%
52	2,4%	2,7%	2,3%	3,1%	---	---
53	1,6%	2,4%	2,3%	2,9%	---	3,4%
54	1,6%	2,7%	2,2%	3,2%	---	---

Таблица 30(b), ниже, приводит данные по фрагментации, которые графически представлены на Фигуре 6.

Таблица 30(b) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 25 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	13 недель 40°C	18 недель 40°C	24 недели 40°C
26	---	---	6,2%	7,3%	8,7%	10,1%
40	---	---	3,9%	6,9%	8,2%	7,2%
45	---	2,9%	4,3%	4,2%	6,7%	6,7%
46	---	---	4,1%	5,6%	7,1%	6,1%
47	---	1,9%	2,8%	3,4%	5,4%	5,6%
48	---	---	2,0%	4,2%	5,0%	4,0%
37	---	0,7%	1,5%	2,2%	5,0%	4,5%
49	---	---	4,1%	5,8%	---	---
50	---	---	3,7%	5,5%	---	---
51	---	---	3,7%	5,5%	---	5,4%
52	---	1,8%	2,4%	3,1%	---	---
53	---	2,4%	3,3%	4,1%	---	6,6%
54	---	2,3%	3,1%	3,8%	---	---

Как можно увидеть в Таблицах 30(a), 30(b) и на Фигуре 6, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни фрагментации, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащим ацетатный буфер и хлорид натрия, после хранения при 25°C и 40°C. В дополнение к этому, препараты, содержащие гистидин и трегалозу без EDTA, показывают пониженную фрагментацию, по сравнению с препаратом, содержащим хлорид натрия, без EDTA.

Фигура 8 графически показывает уменьшение процента фрагментации для препаратов из Таблицы 25 как функцию концентрации EDTA.

Анализ окисления аминокислот

Уровни окисления определенных метиониновых остатков в положениях аминокислот 256 и 432 в антителе против CTLA-4 11.2.1 измеряют посредством метода картирования лизина-C. Из флаконов, содержащих препараты из Таблицы 25, асептически отбирают образцы в моменты времени на 18 неделе и 24 неделе после хранения при 40°C. Затем образцы расщепляются с помощью фермента лизилэндопептидазы (Lys-C) в трис буфере, при pH 8,0, при стандартных условиях, и анализируются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Разделение осуществляют с использованием аналитической колонки Grace Vydac Protein C4 с 0,1% TFA в воде и 0,085% TFA в ацетонитриле, в качестве градиента элюированию. Таблица 31 приводит результаты.

Таблица 31 Процент окисления метиониновых аминокислот в антителе против CTLA-4 11.2.1 в препаратах из Таблицы 25
№	Остаток аминокислоты	Начальный	18 недель	24 недели
26	Met 432	1,6%	5,5%	6,9%
	Met 256	5%	12,8%	13,6%
40	Met 432	1,6%	5,6%	8,8%
	Met 256	5%	14,0%	16,1%
45	Met 432	1,6%	4,8%	6,2%
	Met 256	5%	11,6%	12,8%
46	Met 432	1,6%	3,5%	6,1%
	Met 256	5%	8,8%	12,5%
47	Met 432	1,6%	3,4%	4,2%
	Met 256	5%	8,4%	8,3%
48	Met 432	1,6%	2,8%	5,7%
	Met 256	5%	7,6%	12,6%
37	Met 432	1,6%	4,5%	4,7%
	Met 256	5%	11,0%	9,4%

Как можно увидеть в Таблице 31, присутствие EDTA в препарате антитела 11.2.1 понижает уровень окисления метионина, которое происходит со временем.

Пример 12

Осуществляют исследование для сравнения воздействия маннита и сорбита на стабильность препаратов антитела против CTLA-4 11.2.1. В этом Примере исследуют альтернативы препарату с гистидином-трегалозой посредством замены части трегалозы различными концентрациями маннита и/или сорбита (Таблица 32). Концентрации EDTA (в виде Na₂EDTA·2H₂O) исследуют в диапазоне от 0 до 0,1 мг/мл.

Препараты, которые оценивают, перечислены в Таблице 32, ниже. Процедура, используемая для приготовления препаратов, является такой же, как описано в Пример 10.

Препараты в Таблице 32 приготавливают посредством использования 11,9 мг/мл исходного раствора антитела 11.2.1 в 20 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,5, 140 мМ хлорида натрия и воздействия на него стадий ультрафильтрования/диафильтрования (UF/DF) в Millipore Lab Scale TFF System с 50 см² мембраной Pellicon XL PBTK 30K. Затем приготавливают концентрированные растворы антитела 11.2.1 в диапазоне от 35 до 40 мг/мл, в 20 мМ натрий-ацетатном или 20 мМ гистидиновом буфере.

Приготавливают концентраты изотонического агента либо в натрий-ацетатном, либо в гистидиновом буфере, при концентрациях, в три раза больших, чем целевые конечные концентрации. Приготавливают концентрированный раствор полисорбата 80 при 20 мг/мл, и Na₂EDTA·2H₂O, при 10 мг/мл, в каждом из буферов. Индивидуальные препараты приготавливают посредством соответствующего разбавления концентрированных растворов. Затем препараты фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют в несколько идентичных флаконов. Объем заполнения 1 мл используют в 2-мл стеклянных флаконах типа 1.

Несколько флаконов непосредственно анализируют относительно уровней обесцвечивания, агрегации, фрагментации и окисления, а несколько других идентичных флаконов также хранят в вертикальном положении при 25°C и 40°C в течение 4, 8, 13, 18 и 24 недель. В каждый момент времени два сохраняемых флакона для каждого препарата, из каждых условий, вынимают для измерения уровня агрегации, фрагментации антитела 11.2.1, а также наблюдают обесцвечивание. Таблицы 33-37 и Фигуры 10-11 приводят результаты.

Таблица 32 Исследуемые препараты антитела
№	Ацетат натрия (мМ)	Гистидин (мМ)	Tween 80 (мг/мл)	Маннит (мг/мл)	Сорбит (мг/мл)	EDTA (мг/мл)	Хлорид натрия (мг/мл)
26	20	---	0,2	---	---	---	8,4
55	---	20	0,2	---	45	0,001	---
56	---	20	0,2	---	45	0,01	---
57	---	20	0,2	---	45	0,1	---
58	---	20	0,2	5	40	0,001	---
59	---	20	0,2	5	40	0,01	---
60	---	20	0,2	5	40	0,1	---
61	---	20	0,2	15	30	0,001	---
62	---	20	0,2	15	30	0,01	---
63	---	20	0,2	15	30	0,1	---

Анализ внешнего вида препарата

Каждый препарат оценивают визуально после 1) начального смешивания препарата, 2) после 4 циклов заморозки/оттаивания (от -70°C до 5°C в коробке вместе с заполненными водой флаконами, из Примера 4) и 3) после хранения при 25°C и 40°C в течение 8, 13 и 24 недель. Препараты оценивают относительно образования частиц, изменения цвета и изменения мутности, и данные приведены в Таблицах 33-35.

Таблица 33 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 32 после заморозки/оттаивания
№	Начальный	После 4 циклов заморозки/оттаивания
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо затуманенный, нет частиц
55	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
56	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
57	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
58	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
59	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
60	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц
61	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
62	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
63	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц

Таблица 34 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 32 после хранения при 25°C
№	Начальный	13 недель 25°C	24 недели 25°C
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---
55	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
56	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
57	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
58	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
59	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
60	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
61	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
62	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
63	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц

Таблица 35 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 25 после хранения при 40°C
№	Начальный	8 недель 40°C	13 недель 40°C	24 недели 40°C
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо розовый, нет частиц	очень слабо розовый, нет частиц	розовый, нет частиц
55	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
56	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
57	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
58	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
59	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
60	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
61	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
62	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
63	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц

Результаты в Таблицах 33-35 показывают, что препараты антитела 11.2.1, содержащие хлорид натрия, но без EDTA, имеют пониженную защиту при заморозке/оттаивании, что доказывается повышением обесцвечивания, мутности и образования частиц, по сравнению с препаратами, содержащими EDTA, но без хлорида натрия. Результаты также показывают, что препараты антитела 11.2.1, содержащие все исследуемые концентрации EDTA, имеют пониженное обесцвечивание, пониженную мутность и пониженное образование частиц, по сравнению с препаратами без EDTA.

Анализ агрегации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 32, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 13, 18 и 24, 25°C и 40°C препараты анализируют на агрегацию с использованием эксклюзионной хроматографии. Из флаконов асептически отбирают образцы в каждый момент времени. Эксклюзионную хроматографию осуществляют на образцах с использованием колонки с гелем TSK G3000SWXL-G2000SWXL, подвижной фазой из 0,2 M натрий-фосфатного буфера, при pH 7,0, скорости потока 1 мл/мин и УФ детектированием на 214 нм. Таблица 36(a) показывает процент агрегации антитела 11.2.1, измеренный после хранения при 25°C в соответствующие моменты времени, для каждого из препаратов. Таблица 36(b) показывает процент агрегации антитела 11.2.1, измеренный после хранения при 40°C. Уровни агрегации вычисляют посредством интегрирования площадей под пиками хроматограммы для каждого препарата и выражения интегральных площадей под пиками высокомолекулярных частиц как процент от общей площади пика (см. Таблицы 36(a) и 36(b)).

Таблица 36(a) Процент агрегации для препаратов в Таблице 32 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	13 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C
26	0,8%	---	---	1,1%	1,6%	---
55	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	---
56	0,7%	0,6%	0,7%	0,6%	---	---
57	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	0,7%
58	0,7%	---	---	0,6%	---	---
59	0,7%	---	---	0,6%	---	---
60	0,7%	---	---	0,6%	---	---
61	0,7%	0,7%	0,6%	0,6%	---	---
62	0,7%	0,6%	0,6%	0,6%	---	---
63	0,7%	0,6%	0,8%	0,6%	---	---

Таблица 36(b), ниже, приводит данные по агрегации, которые графически представлены на Фигуре 9.

Таблица 36(b) Процент агрегации для препаратов в Таблице 32 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	13 недель 40°C	18 недель 40°C	24 недели 40°C
26	0,8%	3,1%	4,3%	5,2%	6,4%	---
55	0,6%	0,7%	0,8%	0,8%	---	---
56	0,6%	0,7%	0,8%	0,7%	---	---
57	0,7%	0,7%	0,8%	0,8%	---	1,2%
58	0,7%	---	0,8%	0,8%	---	---
59	0,7%	---	0,8%	0,8%	---	---
60	0,6%	---	0,7%	0,8%	---	---
61	0,7%	0,7%	0,7%	0,8%	---	---
62	0,6%	0,7%	0,8%	0,8%	---	---
63	0,7%	0,7%	0,7%	0,8%	---	---

Как можно увидеть в Таблицах 36(a), 36(b) и на Фигуре 9, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни агрегации при всех исследуемых концентрациях EDTA, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащим ацетатный буфер и хлорид натрия (то есть хлоридные ионы), после хранения при 25°C и 40°C. Фигура 9 графически показывает уменьшение процента агрегации для препаратов из Таблицы 32.

Анализ ферментации

Препараты антитела, приготовленные в соответствии с Таблицей 32, хранят при температуре 25°C и 40°C. На неделях 0 (начальный), 4, 8, 13, 18 и 24, 25°C и 40°C препараты анализируют на общие гидролитические примеси (то есть фрагментацию) с использованием восстановленного SDS-PAGE (rSDS-PAGE). Из флаконов с препаратами асептически отбирают образцы в каждый момент времени и загружают на 4-12% гели бис-Трис NuPAGE с коллоидным голубым красителем (Кумасси). Восстановление геля достигается посредством использовани восстанавливающего агента NuPAGE®. Процент примеси (то есть фрагментации) для полосы каждого образца в восстановленных гелях оценивают посредством сканирования либо на Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, либо на Bio-Rad GS800 Imaging Densitometer. Уровень фрагментации вычисляют как процент от общего объема полосы (см. Таблицы 37(a) и 37(b)).

Таблица 37(a) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 32 после хранения при 25°C
№	Начальный	4 недели 25°C	8 недель 25°C	13 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C
26	1,3%	---	---	3,3%	3,7%	---
55	1,6%	---	---	2,9%	---	---
56	1,6%	---	---	2,5%	---	---
57	1,6%	---	---	2,4%	---	2,9%
58	1,0%	---	---	2,5%	---	---
59	1,1%	---	---	2,6%	---	---
60	1,2%	---	---	2,6%	---	---
61	1,1%	---	---	2,5%	---	---
62	1,0%	---	---	2,5%	---	---
63	1,1%	2,3%	2,1%	2,6%	---	---

Таблица 37(b), ниже, приводит данные по фрагментации, которые графически представлены на Фигуре 10.

Таблица 37(b) Процент фрагментации для препаратов в Таблице 32 после хранения при 40°C
№	Начальный	4 недели 40°C	8 недель 40°C	13 недель 40°C	18 недель 40°C	24 недели 40°C
26	---	---	6,2%	7,3%	8,7%	10,1%
55	---	1,6%	2,3%	5,7%	---	---
56	---	1,9%	2,3%	4,8%	---	---
57	---	2,0%	2,6%	4,7%	---	5,3%
58	---	---	3,7%	5,6%	---	---
59	---	---	3,6%	5,7%	---	---
60	---	---	3,5%	5,3%	---	---
61	---	2,5%	3,3%	5,5%	---	---
62	---	2,6%	3,6%	5,9%	---	---
63	---	2,6%	3,6%	5,3%	---	---

Как можно увидеть в Таблицах 37(a), 37(b) и на Фигуре 10, препараты, содержащие EDTA, показывают пониженные уровни фрагментации, по сравнению с препаратом, где нет EDTA, но содержащим ацетатный буфер и хлорид натрия (то есть хлоридные ионы), после хранения при 25°C и 40°C.

Пример 13

Этот пример иллюстрирует получение жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорид моногидрат, дигидрат динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, дигидрат α,α-трегалозы и полисорбат 80.

Жидкая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению образуется посредством получения следующих компонентов: антитело против CTLA-4 тицилимумаб (доступное из линии клеток гибридом 11.2.1,4, находящейся в ATCC под № PTA-5169, в соответствии с Примером 1, или рекомбинантно получаемое из линии клеток млекопитающих в соответствии с Примером 2), L-гистидин моногидрохлорид моногидрат (доступный от Ajinomoto, Raleigh, NC), L-гистидин (доступный от Ajinomoto, Raleigh, NC), дигидрат динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты (доступный как Titriplex III от Merck KgaA, Darmstadt, Germany), дигидрат α,α-трегалозы (доступный как Product Number T-104-1-MC, от Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) и полисорбат 80 (доступный как Crillet 4 HP, от Croda Inc., Mill Hall PA).

Жидкую фармацевтическую композицию приготавливают посредством, сначала, приготовления нескольких исходных растворов антитела против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, дигидрата динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, дигидрата α,α-трегалозы и полисорбата 80. 20 мМ гистидиновый буфер, pH 5,5, приготавливают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина в воде. Буфер для 1х препарата получают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 84 мг/мл (222 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 0,1 мг/мл (0,268 мМ) дигидрата динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Буфер для 2х препарата получают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 168 мг/мл (444 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 0,2 мг/мл (0,536 мМ) дигидрата динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Исходный раствор антитела против CTLA-4 тицилимумаб получают в соответствии с Примером 2 и концентрируют до 42-55 мг/мл (целевая концентрация - 45 мг/мл) в гистидиновом буфере с использованием процесса ультрафильтрования, осуществляемого с помощью мембраны типа 50 кДа (Biomax PES).

Для приготовления фармацевтической композиции равные объемы концентрированного исходного раствора антитела против CTLA-4 тицилимумаб и буфера для 2х препарата добавляют в контейнер, пригодный для тщательного перемешивания жидких композиций. После смешивания извлекается малый объем раствора, и концентрацию антител определяют с помощью метода спектрометрии в ультрафиолетовом видимом свете (UV-Vis) с использованием коэффициента экстинкции 1,43 (мг/мл)^-1 см^-1 (ожидаемый диапазон от 21 до 27,5 мг/мл, целевая концентрация 22,5 мг/мл). Наконец, соответствующим образом вычисленный объем буфера для 1х препарата добавляют и смешивают для доведения антитела до целевой концентрации 20 мг/мл (в диапазоне 18-22 мг/мл).

Затем фармацевтические композиции фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют во флаконы. Номинальный объем заполнения 20 миллилитров используют в 20 миллилитровых стеклянных флаконах типа 1. Флаконы закрывают пробками с покрытием Flurotec® Daikyo 777-1 и заворачивают крышками на резьбе. Стеклянные флаконы стерилизуют, как есть, 20 мм серологическими пробками Daikyo 777-1.

Каждая отдельная единица флакона содержит примерно 400 мг антитела против CTLA-4 тицилимумаб, 65,4 мг L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, 13,6 мг L-гистидина, 2 мг дигидрата динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, 1680 мг дигидрата α,α-трегалозы и 4 мг полисорбата 80.

Пример 14

Этот пример иллюстрирует возможное получение жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорид моногидрат, кальций динатрий этилендиаминтетрауксную кислоту, дигидрат α,α-трегалозы и полисорбат 80.

Жидкая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть образована посредством получения следующих компонентов: антитела против CTLA-4 тицилимумаб (доступного из линии клеток гибридом 11.2.1.4, находящейся в ATCC под № PTA-5169, в соответствии с Примером 1, или рекомбинантно полученного от линии клеток млекопитающих в соответствии с Примером 2), L-гистидин моногидрохлорида моногидрата (доступного от Ajinomoto, Raleigh, NC), L-гистидина (доступного от Ajinomoto, Raleigh, NC), кальций динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты (доступной от Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), дигидрата α,α-трегалозы (доступной как Product Number T-104-1-MC, от Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) и полисорбата 80 (доступного как Crillet 4 HP, от Croda Inc., Mill Hall PA ).

Жидкая фармацевтическая композиция может быть получена посредством, сначала, приготовления нескольких исходных растворов антитела против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, дигидрат динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, дигидрата α,α-трегалозы и полисорбата 80. 20 мМ гистидиновый буфер, pH 5,5, может быть получен посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина в воде. Буфер для 1х препарата может быть получен посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 84 мг/мл (222 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 0,1003 мг/мл (0,268 мМ) кальций динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Буфер для 2х препарата может быть получен посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 168 мг/мл (444 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 0,2006 мг/мл (0,536 мМ) кальций динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Исходный раствор антитела против CTLA-4 тицилимумаб может быть получен в соответствии с Примером 2 и концентрирован до 42-55 мг/мл (целевая концентрация 45 мг/мл) в гистидиновом буфере с использованием процесса ультрафильтрования, осуществляемого с помощью мембраны типа 50кДа (Biomax PES).

Для получения фармацевтической композиции равные объемы концентрированного исходного раствора антитела против CTLA-4 тицилимумаб и буфера для 2х препарата могут добавляться в контейнер, пригодный для тщательного перемешивания жидких композиций. После смешивания малый объем раствора может извлекаться, и концентрацию антитела определяют посредством метода спектрометрии в ультрафиолетовом видимом свете (UV-Vis) с использованием коэффициента экстинкции 1,43 (мг/мл)^-1 см^-1 (ожидаемый диапазон 21-27,5 мг/мл, целевая концентрация 22,5 мг/мл). Наконец, соответствующим образом вычисленный объем буфера для 1х препарата может добавляться и смешиваться для доведения антитела до целевой концентрации 20 мг/мл (в диапазоне 18-22 мг/мл).

Затем фармацевтические композиции фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют во флаконы. Номинальный объем заполнения 20 миллилитров используют в 20 миллилитровых стеклянных флаконах типа 1. Флаконы закрывают пробками с покрытием Flurotec® Daikyo 777-1 и заворачивают крышками на резьбе. Стеклянные флаконы стерилизуют, как есть, с 20 мм серологическими пробками Daikyo 777-1.

Каждая отдельная единица флакона содержит примерно 400 мг антитела против CTLA-4 тицилимумаб, 65,4 мг L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, 13,6 мг L-гистидина, 2,006 мг кальций динатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, 1680 мг дигидрата α,α-трегалозы и 4 мг полисорбата 80.

Пример 15

Этот пример иллюстрирует возможное получение жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорид моногидрат, тринатрий этилендиаминтетрауксную кислоту, дигидрат α,α-трегалозы и полисорбат 80.

Жидкая фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть образована посредством получения следующих компонентов: антитела против CTLA-4 тицилимумаб (доступного из линии клеток гибридом 11.2.1.4, находящейся в ATCC под № PTA-5169, в соответствии с Примером 1, или рекомбинантно полученной от линии клеток млекопитающих в соответствии с Примером 2), L-гистидин моногидрохлорида моногидрата (доступного от Ajinomoto, Raleigh, NC), L-гистидина (доступного от Ajinomoto, Raleigh, NC), тринатрий этилендиаминтетрауксной кислоты (доступной от Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), дигидрата α,α-трегалозы (доступной как Product Number T-104-1-MC, от Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) и полисорбата 80 (доступного как Crillet 4 HP, от Croda Inc., Mill Hall PA).

Жидкая фармацевтическая композиция может быть получена посредством, сначала, приготовления нескольких исходных растворов антитела против CTLA-4 тицилимумаб, L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, тринатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, дигидрата α,α-трегалозы и полисорбата 80. 20 мМ гистидиновый буфер pH 5,5 получают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина в воде. Буфер для 1х препарата получают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 84 мг/мл (222 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 0,096 мг/мл (0,268 мМ) тринатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Буфер для 2х препарата получают посредством растворения 3,27 мг/мл (15,6 мМ) L-гистидин HCl моногидрата и 0,68 мг/мл (4,4 мМ) L-гистидина, 168 мг/мл (444 мМ) дигидрата α,α-трегалозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 0,192 мг/мл (0,536 мМ) тринатрий этилендиаминтетрауксной кислоты в воде. Исходный раствор антитела против CTLA-4 тицилимумаб получают в соответствии с Примером 2 и концентрируют до 42 и 55 мг/мл (целевая концентрация 45 мг/мл) в гистидиновом буфере с использованием процесса ультрафильтрования, осуществляемого с помощью мембраны типа 50 кДа (Biomax PES).

Для получения фармацевтической композиции равные объемы концентрированного исходного раствора антитела против CTLA-4 тицилимумаб и буфер для 2х препарата могут добавляться в контейнер, пригодный для тщательного перемешивания жидких композиций. После смешивания малый объем раствора может извлекаться, и концентрацию антитела определяют посредством метода спектрометрии в ультрафиолетовом видимом свете (UV-Vis), с использованием коэффициента экстинкции 1,43 (мг/мл)^-1 см^-1 (ожидаемый диапазон 21-27,5 мг/мл, целевая концентрация 22,5 мг/мл). Наконец, соответствующим образом вычисленный объем буфера для 1х препарата может добавляться и смешиваться для доведения антитела до целевой концентрации 20 мг/мл (в диапазоне 18-22 мг/мл).

Затем фармацевтические композиции фильтруют через 0,2 мкм стерилизующие фильтры и заполняют во флаконы. Номинальный объем заполнения 20 миллилитров используют в 20 миллилитровых стеклянных флаконах типа 1. Флаконы закрывают пробками с покрытием Flurotec® Daikyo 777-1 и заворачивают крышками на резьбе. Стеклянные флаконы стерилизуют, как есть, с 20 мм серологическими пробками Daikyo 777-1.

Каждая отдельная единица флакона содержит примерно 400 мг антитела против CTLA-4 тицилимумаб, 65,4 мг L-гистидин моногидрохлорида моногидрата, 13,6 мг L-гистидина, 1,92 мг тринатрий этилендиаминтетрауксной кислоты, 1680 мг дигидрата α,α-трегалозы и 4 мг полисорбата 80.

1. Композиция для лечения новообразований, содержащая:
по меньшей мере, один хелатирующий агент и,
по меньшей мере, одно антитело, которое специфически связывается с CTLA-4 человека, содержащее:
последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:2, и
последовательность аминокислот, которая является, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности аминокислот легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:4,
где композиция имеет, по меньшей мере, одно свойство, которое является улучшенным по сравнению с идентичной в остальном композиции, в которой отсутствует хелатирующий агент, выбранное из группы, состоящий из:
а) уровень агрегации антител;
б) уровень фрагментации антител;
в) уровень нестабильности антител к замораживанию/оттаиванию;
г) уровень изменения цвета композиции; и
д) уровень деамидирования антител.

2. Композиция по п.1, где композиция представляет собой жидкую композицию, и антитело представляет собой антитело IgG2 человека.

3. Композиция по п.1, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, по меньшей мере, на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, по меньшей мере, на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:4.

4. Композиция по п.1, где антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, которая содержит вариабельную область SEQ ID NO:2, и последовательность аминокислот легкой цепи, которая содержит вариабельную область SEQ ID NO:4.

5. Композиция по п.1, где антитело содержит моноклональное антитело против CTLA-4 IgG2, имеющее последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи тицилимумаб.

6. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA.

7. Композиция по п.1, где композиция содержит хелатирующий агент и буфер.

8. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA и гистидин.

9. Композиция по п.1, где композиция содержит хелатирующий агент, буфер и поверхностно-активное вещество.

10. Композиция по п.1, где композиция содержит хелатирующий агент, буфер, поверхностно-активное вещество и изотонический агент.

11. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA, буфер, поверхностно-активное вещество и изотонический агент.

12. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA, гистидин, поверхностно-активное вещество и изотонический агент.

13. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA, гистидин, полисорбат 80 и изотонический агент.

14. Композиция по п.1, где композиция содержит EDTA, гистидин, полисорбат 80 и трегалозу.

15. Композиция по п.1, где композиция содержит:
от примерно 1 мг/мл до примерно 200 мг/мл антитела,
от примерно 0,01 мМ до примерно 5,0 мМ хелатирующего агента и
от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина.

16. Композиция по п.1, где композиция содержит:
от примерно 1 мг/мл до примерно 200 мг/мл антитела,
от примерно 0,01 мМ до примерно 5,0 мМ EDTA и
от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина.

17. Композиция по п.1, где композиция содержит:
от примерно 1 мг/мл до примерно 100 мг/мл антитела,
от примерно 0,01 мМ до примерно 1,0 мМ EDTA,
от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ гистидина,
от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10 мг/мл полисорбата 80 и
от примерно 100 мМ до примерно 300 мМ
изотонического агента.

18. Композиция по п.1, где композиция содержит:
от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл антитела,
от примерно 0,001 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл EDTA,
от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ гистидина,
от примерно 0,01 мг/мл до примерно 5 мг/мл полисорбата 80 и
от примерно 10 мг/мл до примерно 200 мг/мл трегалозы.

19. Композиция по п.1, где композиция содержит:
примерно 20 мг/мл антитела,
примерно 0,27 мМ EDTA,
примерно 20 мМ гистидина,
примерно 0,2 мг/мл полисорбата 80 и
примерно 222 мМ трегалозы.

20. Композиция по п.1, где композиция содержит:
примерно 20 мг/мл антитела,
от примерно 0,1 мг/мл EDTA,
примерно 20 мМ гистидина,
примерно 0,2 мг/мл полисорбата 80 и
примерно 84 мг/мл трегалозы.

21. Композиция по п.1, у которой после хранения композиции в течение периода примерно 24 нед при температуре примерно 40°С уменьшение между площадью пиков агрегатов хроматограммы для стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей моноклональные антитела против CTLA-4 и хелатирующий агент, и площадью пиков агрегатов хроматограммы для идентичной в остальном композиции, в которой нет хелатирующего агента, которая хранится в течение периода примерно 24 нед при температуре примерно 40°С, составляет, по меньшей мере, примерно 2%.

22. Композиция по п.2 в жидкой форме, где молярная концентрация антител находится в пределах от примерно 0,0006 мМ до примерно 1,35 мМ и молярная концентрация хелатирующего агента находится в пределах от примерно 0,003 мМ до примерно 50 мМ и где молярное отношение антитела к хелатирующему агенту находится в пределах от примерно 0,00001 до примерно 450.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. .

Способы лечения рака с использованием ингибиторов hdac // 2356547

Одноцепочечное цикличное триспецифическое антитело // 2355705

Полиморфные и аморфная формы фосфатной соли 8-фтор-2-{4-[(метиламино)метил]фенил}-1,3,4,5-тетрагидро-6н-азепино[5.4.3-cd]индол-6-она // 2355691

Кристаллическая полиморфная форма бисульфатной соли антагониста тромбинового рецептора // 2355689

Изобретение относится к новому соединению, представляющему собой кристаллическую полиморфную форму бисульфатной соли со свойствами антагониста тромбиновых рецепторов, которая показывает в порошке картину дифракции рентгеновских лучей, практически идентичную представленной на фиг.1, или которая показывает график дифференциальной сканирующей калориметрии, практически идентичный представленному на фиг.3, и которое представлено формулой для соединения 2: а также к способу получения соединения 2.

Производные пиразола, полезные в качестве ингибиторов протеинкиназы // 2355688

Антитело к cd40: препарат и способы // 2355421

Фармацевтическая композиция // 2355418

Изобретение относится к медицине и биохимии и описывает парентеральные фармацевтические композиции, включающие аналог соматостатина и винную кислоту. .

Противоопухолевые композиции, содержащие производное рапамицина и ингибитор ароматазы // 2355399

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении рака груди у млекопитающего. .

Способ локо-регионарной химиотерапии опухолей головного мозга // 2355330

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. .

Одноцепочечное цикличное триспецифическое антитело // 2355705

Способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов // 2355422

Антитело к cd40: препарат и способы // 2355421

Штамм риккетсий генотипа "candidatus rickettsia tarasevichiae" - кандидат в новый вид, используемый для идентификации риккетсий и получения диагностических препаратов // 2354691

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Фармацевтические композиции, направленные на рецепторы erbb1 // 2354402

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для лечения опухолей. .

Способы лечения болезни альцгеймера с использованием антител, направленных против пептида амилоида-бета, и их композиций // 2353389

Композиция антагониста vegf и антипролиферативного средства // 2353353

Способ приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов // 2352358

Изобретение относится к процессу получения лечебных препаратов из плазмы крови, а именно к способу очистки препаратов иммуноглобулинов, получаемых промышленным способом спиртового фракционирования, от примесей растворителя и детергента, применяемого на стадии дополнительной инактивации вирусов.

Анти-nogo антитела ("11с7") и их фармацевтическое использование // 2350623

Конъюгаты антрациклин-антитело // 2349343

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунотерапии. .

Терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами // 2357974

Таблица 27 Визуальные оценки препаратов из Таблицы 25 после хранения при 25°C
№	Начальный	13 недель 25°C	18 недель 25°C	24 недели 25°C
26	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо розовый, нет частиц
40	прозрачный, бесцветный, нет частиц	очень слабо розовый, нет частиц	---	прозрачный, Y6*, нет частиц
45	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
46	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
47	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
48	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
37	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц
49	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
50	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
51	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
52	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
53	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, нет частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц
54	прозрачный, бесцветный, нет частиц	прозрачный, бесцветный, меньше 3 частиц	---	прозрачный, бесцветный, нет частиц