Способ очистки крови от днк-содержащих иммунных комплексов с помощью иммобилизированного гранулированного магнитоуправляемого препарата
Владельцы патента RU 2356585:
Симакова Екатерина Станиславовна (RU)
Гонтарь Илья Петрович (RU)
Трофименко Андрей Степанович (RU)
Зборовский Александр Борисович (RU)
Шилова Людмила Николаевна (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии, иммунологии и биотехнологии. Сущность изобретения включает способ снижения содержания ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов путем пропускания крови через предварительно полученный гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированной ДНК-азой I на основе полиакриламидных гранул с магнитными свойствами, полученный методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота. Преимущество изобретения заключается в повышении эффективности сорбента. 2 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии, иммунологии и биотехнологии, и может быть использовано для совершенствования лечения системной красной волчанки и других аутоиммунных заболеваний.
Известно, что иммунные комплексы (ИК) оказывают выраженное влияние на тяжесть течения и прогноз различных заболеваний. В частности, доказана важная роль ДНК-содержащих ИК в прогрессировании поражения почек при системной красной волчанке и, тем самым, в формировании прогноза жизни при данном заболевании. Показано, что ИК с высокомолекулярной ДНК наиболее патогенны, в отличие от ИК, содержащих ДНК малых размеров.
В настоящее время наиболее распространенными методами воздействия на иммунокомплексное звено патогенеза являются плазмаферез, гемосорбция, а также иммуносорбция плазмы крови с использованием колонок с иммобилизированными антителами к Fc-фрагменту IgG. Основным недостатком всех этих методов является низкая избирательность, приводящая к элиминации из организма как патогенных, так и непатогенных антител. Это вызывает, в частности, существенное повышение частоты возникновения тяжелых бактериальных и вирусных инфекций, чему также способствует стандартная для лечения данных заболеваний медикаментозная иммуносупрессия.
Известен метод разрушения ДНК-содержащих ЦИК с помощью ДНК-азы I, иммобилизированной на нейлоновых микрокапсулах диаметром около 1 мм посредством активации глутаральдегидом [Terman D.S., Tavel A., Tavel Т. et al. Degradation of circulating DNA by extracorporeal circulation over nuclease immobilized on nylon microcapsules // J. Clin. Invest. - 1976. - Vol.52, №5. - P.1201-1212]. В дальнейшем данный метод обозначается как прототип. Прототип был испытан на крови лабораторных животных (собаки породы Mongrel), которым перед перфузией вводили искусственные ИК, содержащие ДНК с радиоизотопной меткой. Прототип проявлял свою ферментативную активность как in vitro, так и in vivo, не требовал наличия высоких концентраций магния, не высвобождался с поверхности капсул в заметных количествах и не вызывал значимого повреждения эритроцитов и тромбоцитов крови. Недостатком прототипа является возможность значительной инактивации иммобилизируемого фермента за счет вовлечения активного центра последнего в формирование ковалентных связей. Недостатком прототипа также является сравнительно небольшая сорбционная емкость, ограниченная, во-первых, конечным числом реакционноспособных групп на поверхности носителя, способных с помощью глутаральдегида связывать ДНК-азу I, и, во-вторых, достаточно большим диаметром частиц носителя, что резко снижает рабочую площадь такого препарата. Кроме того, при применении прототипа наблюдалось умеренное снижение содержания лейкоцитов в крови.
Решаемая задача состоит в разработке способа снижения содержания ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов путем пропускания крови через предварительно полученный методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота оригинальный гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированной ДНК-азой I (далее - препарат), что обеспечивает более значительное снижение концентрации патогенных циркулирующих иммунных комплексов крови, содержащих высокомолекулярную ДНК, а также уменьшение травматизации лейкоцитов перфузируемой крови по сравнению с прототипом.
Технический результат заявляемого изобретения представляет собой увеличение эффективности по сравнению с прототипом за счет более высокой удельной ферментативной активности и более высокой рабочей площади препарата. Технический результат заявляемого изобретения представляет собой также и упрощение манипуляций с препаратом за счет его магнитоуправляемости, равно как и уменьшение расхода препарата за счет возможности эффективной многократной регенерации препарата. Технический результат достигается путем применения полиакриламидного носителя с магнитными свойствами в качестве структурного элемента иммобилизированной ДНК-азы I, который вводят в гранулированный препарат методом эмульсионной полимеризации.
Способ очистки крови от ДНК-содержащих иммунных комплексов с помощью иммобилизированных гранулированных магнитоуправляемых препаратов осуществляют следующим образом.
Получение препарата производится следующим способом. В сосуд, содержащий гексан и эмульгатор, подается под давлением по трубке химически инертный газ таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание. В колбу для полимеризации вносится раствор окиси железа с гидрофильными свойствами и персульфат аммония, затем добавляется раствор, содержащий мономеры акриламида, метиленбисакриламида, ДНК-азы I и NNN'N'-тетраметилэтилендиамина. После завершения полимеризации гранулы отмываются от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. В колонку вносятся гранулы и через нее перфузируется нативная гепаринизированная кровь. Регенерация препарата производится путем пропускания через колонку 0,1 М буфера глицин-HCl рН 2,2 два раза по 10 мин.
Пример 1. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизированной ДНК-азой I
В 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида (Реанал, Венгрия), а также 0,6 мг бычьей панкреатической ДНК-азы I (Merck, ФРГ). Выбор концентрации антигена 0,3 мг/мл (в 2 мл - 0,6 мг) обусловлен тем, что в прототипе использовалась именно эта концентрация фермента.
В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора рН 7,4 с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, ДНК-азы I и 20 мкл NNN'N'-тетраметилэтилендиамина.
После завершения полимеризации гранулы в течение 10-15 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель: железо = 2:1 (в пересчете на сухую массу).
Под микроскопом (объектив 8, окуляр 10) подсчитывали количество гранул в 0,05 мл 50%-ной взвеси. Средний диаметр гранул определен экспериментально и равен 55±6,2 мкм. Далее рассчитывали площадь поверхности гранул, соответствующую объему 40 мл (так как в прототипе использовалась колонка такого же объема). В результате расчетная площадь поверхности гранул прототипа составила 11,4 см2, заявляемого образца - 259,3 см2.
Пример 2. Перфузия крови через препарат.
В колонку объемом 40 мл (что соответствует прототипу) вносили гранулы и перфузировали через нее со скоростью 10 мл/ч по 20 мл нативной гепаринизированной крови, полученной от больных системной красной волчанкой и содержащей антитела к нативной ДНК. Далее препарат отмывали от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором рН 7,4 и проводили элюцию 0,1 М буфером глицин-HCl рН 2,2 два раза по 10 мин. Определяли содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови двукратно (исходно и после перфузии) методом преципитации в полиэтиленгликоле-6000 по Haskova в модификации Лемперта (1988), содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) до и после перфузии.
По данной методике проведена обработка нативной гепаринизированной крови 10 больных системной красной волчанкой (СКВ). В качестве контроля использовали образцы нативной гепаринизированной крови 10 здоровых лиц. Динамика концентрации ДНК-содержащих ИК в сыворотке крови в ходе осуществления заявляемого способа приведена в таблице 1, динамика концентрации форменных элементов крови - в таблице 2. Из приведенных значений следует, что перфузия через препарат вызывает снижение содержания ИК до уровня, близкого к нормальному, в то время как при помощи прототипа достигалось снижение содержания ИК лишь на 60-65% от введенного количества. При использовании заявляемого способа содержание форменных элементов крови достоверно не меняется.
После использования препарат регенерировали 0,1 М глицин-HCl буфером, рН 2,2. После первой регенерации потеря активности составила 10%, при последующих повторных регенерациях (до 10 раз) потери активности не происходило.
| Таблица 1. Изменение содержания иммунных комплексов в сыворотке крови в результате перфузии через гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированной ДНК-азой I |
|||
| Показатель | Содержание ИК у доноров | Содержание ИК у больных СКВ | |
| Исходно | После перфузии | ||
| Заявляемый образец | |||
| М±m, Ед | 1,63±0,4** | 7,1±4,4* | 1,55±1,2 |
| % | 21,8 | ||
| Прототип, % | - | - | 45,0* |
| * Достоверность различия с содержанием ИК после перфузии через заявляемый образец ** Недостоверность различия с содержанием ИК после перфузии через заявляемый образец |
| Таблица 2. Содержание форменных элементов в крови больных системной красной волчанкой до и после перфузии через гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированной ДНК-азой I |
||||||
| Показатель | Эритроциты, × 1012 л-1 | Лейкоциты, × 109 л-1 | Тромбоциты, × 109 л-1 | |||
| Исходно | После перфузии | Исходно | После перфузии | Исходно | После перфузии | |
| Заявляемый образец, М±m % |
3,5±1,1 100 |
3,3±1,5** 94,3 |
5,2±1,6 100 |
4,7±1,0** 90,1 |
170,5±56,1 100 |
167,3±40,5** 98,1 |
| Прототип, М±m % |
4,5±1,7 100 |
4,1±1,3 91,1 |
9,1±1,2 100 |
6,2±1,6* 68,1 |
152,3±86,1 100 |
147,9±64,3 97,1 |
| * Достоверность различия с исходным содержанием форменных элементов ** Недостоверность различия с исходным содержанием форменных элементов |
Способ снижения содержания ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов, включающий пропускание крови через гранулированный препарат с иммобилизированной ДНК-азой I, отличающийся тем, что для иммобилизации ДНК-азы I используют полиакриламидный носитель с магнитными свойствами, при соотношении носитель : железо 2:1, который гранулируют методом эмульсионной полимеризации.
