Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине. Предложен способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности. Способ позволяет расширить диагностические возможности выявления дисбиотических нарушений, диагностировать состояние нормы, дисбаланс микробиоты и степень его выраженности в ранние сроки до развития системных осложнений. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления и диагностики патологических состояний и заболеваний, вызванных или сопровождающихся дисбалансом нормо- и условно-патогенной микробиоты различных биотопов человека, а также для установления факта дисбаланса, степени его выраженности и этиологического значения конкретных микроорганизмов в развитии данного дисбаланса у пациента.

В настоящее время медицинские проблемы, связанные с дисбалансом нормо- и условно-патогенной микробиоты (дисбиоз, дисбактериоз и т.д.) приобрели междисциплинарный характер, что определяет их актуальность и медико-социальное значение (Топчий Н.В. Проблема дисбиоза и здоровье семьи. // Фарматека. - №20 (154). - 2007. - С.80-86). Результаты многочисленных исследований отечественных и зарубежных авторов убедительно доказали патогенетическое значение нарушений количественного и качественного состава микробиоты в развитии патологических состояний различных органов и систем человека (желудочно-кишечный тракт, мочеполовая система, бронхолегочная система и т.д.), в формировании очагов хронической инфекции, развитии осложненных форм заболеваний.

Известно, что в процессе эволюции в различных биотопах человека, контактирующих с внешним инфекционным окружением, сформировался стабильный состав микроорганизмов, представляющих собой мощную противоинфекционную защиту, являясь фактором колонизационной резистентности. Микробиота каждого биотопа имеет строго определенные количественные и качественные характеристики, а также диапазон их вариабельности в зависимости от возраста, физиологического состояния и т.д. Однако, рассматривая состав микробиоты как динамическую «живую» систему, нельзя не учитывать экзо- и эндогенные влияния на нее. К экзогенным факторам традиционно относят экологические условия - химические загрязнения, радиационные воздействия, профессиональные вредности и т.д., к эндогенным - инфекционные и соматические заболевания, медикаментозная, особенно антибактериальная, терапия, врожденные или приобретенные нарушения функции иммунной системы.

Клинические симптомы дисбаланса нормо- и условно-патогенной микробиоты весьма разнообразны - колит, синдром мальабсорбции, диарея, запор, гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, кариес, гипо- и гипертензия, гипо- и гиперхолестеринемия, дисменорея; коагулопатия и т.д. Дисбаланс биоты может сопутствовать таким заболеваниям, как ревматоидный артрит, поражениям соединительной ткани, раку желудка, раку толстой кишки, раку молочной железы, мочекаменной болезни, бронхиальной астме, атопическому дерматиту, аллергии.

Проблема усугубляется отсутствием объективных методов лабораторных исследований, доступных практическому здравоохранению, позволяющих на ранних стадиях, в короткие сроки и до развития осложнений выявить дисбиотические нарушения и, соответственно, провести рациональную терапию.

Учитывая важность и актуальность решения проблемы объективной лабораторной диагностики дисбиотических расстройств для различных областей медицины, возникает настоятельная потребность в разработке и внедрении в практическое здравоохранение новых диагностических подходов, позволяющих своевременно, до развития осложнений, диагностировать дисбиотические процессы и степень их выраженности. Подобные новые диагностические подходы необходимы также для определения объема медикаментозного вмешательства, осуществления контроля эффективности лечения, определения критериев излеченности, прогноза исхода заболевания.

В настоящее время для диагностики дисбиотических расстройств используют методы клинической и лабораторной диагностики.

Клиническая диагностика включает выяснение и анализ жалоб, сбор анамнеза и физикальный осмотр пациента (Бодяжина В.И., Жмакин К.Н. Учебник гинекологии. Второе издание, переработанное и дополненное. Изд-во «Медицина», Москва - 1967. - с.32-55. Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н. и соавт. Гинекология. - М.: Медицина, 1985. - с.31-64).

Результаты клинического субъективного и объективного осмотра позволяют установить наличие воспалительного процесса, степень его выраженности, топику поражений, наличие или отсутствие осложнений. Однако результаты клинической диагностики дают возможность только лишь предположить вероятность формирования дисбиотических нарушений, поскольку последние в подавляющем большинстве случаев не имеют патогномоничных специфических клинических симптомов. Кроме того, клиническое обследование не позволяет установить этиологическую структуру дисбиотических нарушений, которая определяет этиотропное лечение, поскольку этиологические факторы заболевания выявляются исключительно с помощью лабораторных методов исследования.

Проблема усугубляется отсутствием методов лабораторного исследования, позволяющих верифицировать дисбиотические процессы на ранней доклинической стадии и, соответственно, проводить адекватную коррекцию и лечение в соответствии с принципом «необходимости и достаточности» и с возможностью контроля лечебного воздействия.

В большинстве случаев дисбиотические процессы протекают длительно, характеризуются стертой клинической симптоматикой и диагностируются уже при наличии осложнений.

Известен микроскопический способ диагностики дисбиотических процессов. При микроскопии мазков, окрашенных по Граму (Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. / Клин. микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - №2. - Т.3 - с.101-105. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - М.: Мед. книга, Н.Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 336 с.) оценивают следующие параметры:

- состояние вагинального эпителия - преобладание клеток поверхностного, промежуточного или парабазального слоев, наличие «ключевых клеток»;

- лейкоцитарную реакцию - ее наличие, степень выраженности, проявление фагоцитоза, его завершенность;

- состав микробиоты - количественную и качественную оценку по морфотипам и морфотинкториальным свойствам.

При количественной оценке микробиоты используют критерии Nugent R.P. (Nugent R.P., Krohn M.A., Hillier S.L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is imprived by a standardized method of Gram stain interpretation. / J.Clin. Microbiol / 1991; 29:297) в модификации Анкирской А.С. (Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. / Клин. микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - №2. - Т.3 - с.101-105). Оценка общей микробной обсемененности вагинального отделяемого проводится по 4-х балльной системе - по числу микробных клеток, обнаруживаемых в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией. Данный способ количественной оценки - в значительной степени приблизительный и субъективный. Качественная оценка микробиоты включает дифференциацию не всех возможно присутствующих в биопробе микроорганизмов, а только 10-ти морфотипов (лактобациллы, гарднереллы, бактероиды, мобилункус, фузобактерии, лептотрихии, вейлонеллы, дрожжеподобные грибы, грамположительные кокки, колиформные палочки) по их тинкториальным свойствам без возможности видовой идентификации микроорганизма, что объясняется объективными ограничениями возможностей световой микроскопии.

Принципиальным недостатком метода является то, что при микроскопии можно выявить только те микроорганизмы, которые обладают достаточными размерами для визуализации при световой микроскопии, и их количество в биопробе должно превышать 105 КОЕ/мл. Кроме того, факультативно-анаэробные бактерии, нередко являющиеся ассоциантами дисбиотических процессов, могут проявлять свои патогенные потенции при сравнительно небольшом количестве (менее 105 КОЕ/мл), которое не выявляется при микроскопии. Даже если факультативно-анаэробные бактерии обнаруживаются в препарате, то эти морфотипы однотипны у многих видов и родов, тогда как их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Ряд анаэробных бактерий, например Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium и т.д., не визуализируются при микроскопии.

Недостатком микроскопического исследования мазков, окрашенных по Граму, является приблизительная неколичественная оценка состава микробиоты, а качественная оценка ограничена определением морфотипа без возможности видовой характеристики микроорганизмов. Микроскопия не позволяет идентифицировать ряд этиологически значимых для развития патологических процессов условно-патогенных возбудителей. Имеет место субъективизм и зависимость от профессиональной квалификации врача клинической лабораторной диагностики.

Известен также способ диагностики дисбиотических нарушений путем микробиологического (культурального) исследования (Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Грудинина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - Тверь: ООО Издательство «Триада», 2004. - 312 с.), позволяющего установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анаэробных бактерий, в том числе лакобацилл, и тем самым подтвердить принадлежность к роду лактобацилл лактомофотипов, обнаруженных при микроскопии биоматериала в мазках, окрашенных по Граму; дрожжевых грибов рода Candida. После количественной оценки роста микроорганизмов на питательных средах определяется их этиологическая значимость у конкретного пациента. Так, например, установлены критерии нормобиоты урогенитального тракта женщин при использовании культуральной диагностики: 1) общая микробная обсемененность не превышает 106-108 КОЕ/мл; 2) абсолютно преобладают лактобациллы; 3) условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (104 КОЕ/мл) или отсутствуют.

До настоящего времени этот метод остается «золотым стандартом» лабораторной диагностики любого инфекционно-воспалительного процесса, а также дисбиотических процессов.

Однако и он не лишен ряда серьезных недостатков. Условно-патогенная биота, являющаяся причиной разнообразных дисбиотических расстройств, главным образом, представлена анаэробными микроорганизмами. Для культивирования анаэробов требуются специальные лаборатории, оснащенные дорогостоящим лабораторным оборудованием для создания анаэробных условий, высококачественные селективные питательные среды и высококвалифицированные врачи-микробиологи. Подавляющее большинство лечебных учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют подобных высокотехнологичных лабораторий. Кроме того, в последние годы с помощью методов молекулярной диагностики были обнаружены этиологически значимые для развития дисбиотических нарушений виды микроорганизмов, такие как Atopobium vaginae, Mycoplasma genitalium и др., не дающие роста на известных питательных средах и, соответственно, идентификация которых пока невозможна культуральным методом исследования.

Существенным недостатком метода являются также длительные сроки культивирования (в среднем 7 дней) микроорганизмов и необходимость сохранения жизнеспособности микроорганизмов до момента поступления биоматериала в лабораторию, а также отсутствие возможности контроля качества преаналитического этапа, определяющего эффективность любого лабораторного анализа в целом.

В качестве ближайшего аналога по технической сущности принят метод молекулярной диагностики - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Суть метода ПЦР (Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am., 1990, 262, 56) состоит в том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной микроорганизм, вносятся синтезированные в лаборатории нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого микроорганизма. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с геномной ДНК (РНК) исследуемого микроорганизма. В процессе амплификации происходит нарастание концентрации специфических молекул ДНК в геометрической прогрессии и после 30-40 циклов она достигает значений, при которых становится возможной визуальная регистрация молекул ДНК после фракционирования в агарозном или акриламидном гелях.

Способ позволяет в короткие сроки (в течение нескольких часов) выполнить идентификацию любых аэробных и анаэробных условно-патогенных микроорганизмов и облигатных патогенов в биопробе, полученной из области патологического процесса. Так, например, в соответствии с данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем (2004), чувствительность ПЦР в диагностике хламидийной инфекции составляет 70-95%, специфичность 97-99%. К достоинствам метода следует отнести возможность тестирования большого количества образцов, использование как инвазивных, так и неинвазивных клинических образцов. Диагностическая ценность ПЦР признана во всем мире и данный метод широко используется в лабораторной практике, в том числе для идентификации условно-патогенной микробиоты урогенитального тракта - Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp.и т.д.

Однако ПЦР дает возможность только качественной характеристики (позволяет идентифицировать микроорганизмы до вида) без определения количественной характеристики исследуемого условно-патогенного микроорганизма, что не позволяет установить наличие дисбаланса микробиоты и степень его выраженности. Отсутствие достоверных и объективных данных о качественном и количественном составе микробиоты исследуемого биотопа приводит к диагностическим ошибкам и назначению нерациональной, патогенетически необоснованной терапии, в ряде случаев усугубляющей течение основного заболевания.

Кроме того, в процессе проведения ПЦР возможно получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. Ложноотрицательные результаты регистрируются из-за наличия в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Процент ошибочных результатов ПЦР-исследования повышается при использовании некачественных диагностических наборов и лабораторного оборудования, нарушении санитарно-эпидемиологического режима, а также при недостаточной квалификации персонала, выполняющего лабораторное исследование (Пособие для врачей. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций. Москва. - 2000. - 16 с.).

Совершенствование методов молекулярно-генетических исследований привело к созданию метода ПЦР в «реальном времени». На современном этапе метод ПЦР в «реальном времени» применяется главным образом для количественного определения отдельных вирусов, таких как, например, цитомегаловирус (CMV) (ПЦР в «реальном времени». Multicentric evaluation of a new commercial cytomegalovirus real-time PCR quantitation assay. J Virol Methods. 2007 Dec; 146(1-2): 147-54), вирус гепатита В (Mazet-Wagner AA. Baclet MC. Loustaud-Ratti V. Denis F. Alain S. Real-time PCR quantitation of hepatitis В virus total DNA and covalently closed circular DNA in peripheral blood mononuclear cells from hepatitis В virus-infected patients. J Virol Methods. 2006 Dec; 138(1-2): 70-9) и т.д. Количество геномов рассчитывают по калибровочному образцу соответствующего вируса. Единичные исследования касаются количественной оценки отдельных представителей нормо- и условно-патогенной биоты (Zariffard, M.R., M. Saifuddin, В. Е. Sha and G.Т. Spear. 2002. Detection of bacterial vaginosis-related organisms by real-time PCR for lactobacilli, Gardnerella vaginalis and Mycoplasma hominis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 34: 277-281; De Backer Е. Verhelst R. Verstraelen H. Alqumber MA, Burton JP. Tags JR. Temmerman M. Vaneechoutte M. Quantitative determination by real-time PCR of four vaginal Lactobacillus species, Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae indicates an inverse relationship between L. gasseri and L. iners. BMC Microbiol. 2007 Dec 19; 7(1): 115), в которых расчет количества геномов микроорганизмов проводят по калибровочному образцу без учета общего количества бактерий в исследуемой биопробе.

Задачей изобретения является создание эффективного способа диагностики дисбаланса микробиоты и степени его выраженности, позволяющего расширить диагностические возможности выявления дисбиотических нарушений на ранней стадии и предупредить развитие системных осложнений

Сущность изобретения заключается в том, что способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности характеризуется тем, что с помощью метода полимеразной цепной реакции в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов бактерий, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты и при превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы, а при значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов бактерий, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты и при снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов бактерий в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-паогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса, а при превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более раз или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

ПНР в «реальном времени» в сравнении с используемыми в настоящее время методами лабораторной диагностики определения качественного и количественного состава микробиоты конкретного биотопа человеческого организма обладает более высокой информативностью (чувствительностью и специфичностью) и объективностью; позволяет контролировать качество выполнения преаналитического этапа лабораторного исследования, предотвращая тем самым вероятность диагностических ошибок.

Способ позволяет в течение суток получить объективную как количественную, так и качественную характеристику биоты любого биотопа человека, диагностировать дисбаланс нормо- и условно-патогенной биоты и степень его выраженности, определять этиологическую значимость конкретных представителей условно-патогенной биоты в развитии дисбаланса, контролировать преаналитический этап исследования. Метод дает возможность существенно объективизировать и ускорить диагностику патологических состояний, вызванных дисбалансом нормо- и условно-патогенной биоты, индивидуализировать лечение и проводить динамическое наблюдение за эффективностью проводимой терапии.

Предлагаемый способ ДНК-диагностики позволяет в течение короткого времени (несколько часов) получить объективный количественный результат о состоянии микробиоты любого биотопа человека.

Объективное определение степени выраженности дисбаланса впервые позволяет индивидуализировать терапевтические подходы с определением уровня необходимого лекарственного вмешательства в широких пределах: от местной терапии на уровне выявленных нарушений до системной лекарственной терапии.

Объективное определение этиологического значения конкретных микроорганизмов в развитии дисбаланса впервые позволяет в короткие сроки назначать адекватную направленную этиологическую терапию, то есть минимизировать лечение.

Предлагаемый способ впервые позволяет проводить объективное динамическое наблюдение за эффективностью проводимой терапии по восстановлению нормальной сбалансированной биоты.

Предусмотренный в предлагаемом способе исследования контроль качества получения клинического образца для лабораторного исследования впервые позволяет объективно оценивать работу медперсонала на преаналитическом этапе, не брать в исследование пробы с недостаточным клиническим материалом и тем самым значительно уменьшить число ложноотрицательных результатов лабораторного исследования.

Технический результат достигается за счет того, что для диагностики дисбаланса нормо- и условно-патогенной биоты человека авторами впервые использован метод ПЦР в реальном времени с учетом сравнительного анализа общего количества геномов микроорганизмов с количеством геномов представителей нормобиоты и количеством геномов представителей условно-патогенной биоты; впервые установлены значения данных соотношений, дифференцирующие состояния нормы и дисбаланса биоты, а также степени его выраженности. Данный способ позволяет в короткие сроки (в течение суток) объективно оценить: качественный и количественный состав микробиты различных биотопов человека; дифференцировать состояния физиологического равновесия микобиоты и паологического процесса; выявлять дисбаланс микробиоты на ранних стадиях до развития осложнений и определять степень его выраженности; оптимизировать и индивидуализировать лекарственную терапию в соответствии с выявленными этиологически значимыми микроорганизмами; эффективность лекарственной терапии в процессе лечения; критерии излеченности и прогноз исхода заболевания; качество получения биопробы для лабораторного анализа.

В основу способа положена впервые предлагаемая авторами комплексная количественная оценка микробиоты человека методом ПЦР в «реальном времени» с проведением сравнительного анализа конкретных представителей нормо- и условно-патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов с целью определения дисбаланса биоты, степени его выраженности при условии контролирования качества получения исследуемой биопробы.

На основании сопоставлений клинико-анамнестических данных, результатов лабораторных исследований и результатов статистического анализа авторами впервые разработаны количественные и качественные критерии состояния микробиоты исследуемого биотопа человека, позволяющие констатировать состояния нормы и диагностировать дисбаланс микробиоты и степень его выраженности.

Ранее метод ПЦР в реальном времени использовался для качественного определения нормобиоты и условно-патогенной биоты с их относительной количественной характеристикой, что не позволяло диагностировать их дисбаланс и степень его выраженности, а также проводить мониторинг эффективности лечения и индивидуализировать терапию.

Способ осуществляется следующим образом.

Биоматериал из конкретных биотопов получают при помощи стерильных одноразовых инструментов и помещают в отдельные одноразовые пластиковые пробирки типа Эппендорф с транспортной средой. Из полученных образцов любыми стандартными методами, обеспечивающими достаточную очистку от веществ, ингибирующих ПЦР, выделяют суммарные нуклеиновые кислоты. Полимеразная цепная реакция выполняется на приборах, обеспечивающих техническую возможность постановки реакции ПЦР в режиме «реального времени» с наборами реагентов, обеспечивающих возможность исследования конкретных биотопов (кишечный, урогенитальный и т.д.): 1) реагенты для определения общего количества микроорганизмов; 2) реагенты для определения представителей нормобиоты (например, Lactobacillus spp для урогенитального биотопа, Bifidobacterium spp для кишечного биотопа и т.д.); 3) реагенты для определения представителей условно-патогенной биоты (например, Atopobium vaginae для урогенитального биотопа, Enterobacteriaceae - для кишечного и т.д.); 4) реагенты для определения геномной ДНК человека (например, гена гормона роста).

По номеру цикла ПЦР в режиме «реального времени», на котором значения флуоресценции начинают фиксироваться прибором (чем больше искомой ДНК микроорганизма в образце, тем раньше флуоресцентный сигнал фиксируется прибором для проведения ПЦР в режиме «реального времени»), определяют количество геномов того или иного микроорганизма и генома человека в исследуемом образце.

Для удобства сравнения количеств геномов представителей биоты математическим путем значения номера цикла переводят в значения Log10 геномов по формуле 50-Ct/3,4. В результате этой операции количество геномов микроорганизмов будет выражено в привычной для врача форме 10n. Например: общее количество бактерий - 108, Lactobacillus spp. - 107 и т.д.

Состояние сбалансированности биоты оценивают методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. В исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного заданного биота. Затем определяют количество геномов нормобиоты и число геномов условно-патогенной биоты. Сравнивают полученные величины. Определяют соотношение между числом геномов представителей нормобиоты и геномов представителей условно-патогенной биоты при одновременном контроле качества получения клинического образца для исследования. При превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы. При значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты. При снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-паогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса. При превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз, а также превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 и более раз или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса.

Определение общего количества геномов микроорганизмов позволяет выявить повышенную, пониженную или нормальную заселенность микроорганизмами конкретного биотопа. Затем определяют разницу порядков между общим количеством геномов микроорганизмов, количеством геномов представителей нормобиоты и количеством геномов представителей условно-патогенной биоты. Сравнение порядков (Log 10) позволяет определить, какую часть биоты составляет нормобиота, а какую часть - условно-патогенная биота в выраженном дисбалансе.

Условием проведения сравнительной оценки дисбаланса биоты является определение геномной ДНК человека в количестве, не менее чем 105 геномов. В противном случае результат считается недостоверным вследствие нарушения техники получения биоматериала и непригодности биопробы для проведения лабораторного анализа.

Пример 1. Женщина 36 лет, обратилась к врачу с жалобами на выделения из влагалища с неприятным запахом. На основании результатов клинического осмотра был установлен диагноз хронического кольпита, экзо- и эндоцервицита. Проба с 10% КОН положительная, рН отделяемого заднего свода влагалища 7,0. В мазках, окрашенных по Граму, обнаружены «ключевые клетки» при отсутствии лейкоцитарной реакции. В соответствии с критериями Amsel R. (1983) установлен диагноз бактериального вагиноза. Результаты бактериологического посева на селективные питательные среды для выращивания анаэробов оказались малоинформативными, выявлены следующие микроорганизмы: лактобактерии - 105 КОЕ/мл, бифидобактерии - 103 КОЕ/мл; этиологическую структуру заболевания культуральным методом установить не удалось. Предлагаемым способом диагностики определили, что биоматериал взят в достаточном количестве - 105; общее количество бактерий составило 108, на фоне нормального содержания лактобактерий (107) обнаружено увеличение количеств 4-х «этиологически значимых» условно-патогенных облигатно-анаэробных микроорганизмов в диагностически значимых титрах. Их количества отличались от количества лактобактерий менее чем в 10 раз, были равны и превышали количество лактобактерий в 10 раз. Полученные данные свидетельствуют о совпадении результатов исследования стандартными методами и предлагаемым способом. В отличие от стандартных методов диагностики с помощью предлагаемого метода удалось установить: выраженную степень дисбаланса биоты урогенитального тракта; назначить рациональную терапию с помощью лекарственных препаратов местного действия группы 5-нитроимидазолов; избежать необоснованного назначения антибактериальных лекарственных препаратов широкого спектра действия.

Пример 2. Женщина 56 лет, менопауза 5 лет, обратилась к врачу с жалобами на пенистые выделения из влагалища. На основании результатов клинического осмотра установлен диагноз атрофического кольпита. Проба с 10% КОН положительная, рН отделяемого заднего свода влагалища 9,0. Результаты микроскопии мазков, окрашенных по Граму, в пределах нормы. Результаты культурального исследования - в пределах возрастной нормы: энтерококки - 102 КОЕ/мл; стафилококки - 103 КОЕ/мл; лактобактерии - 5×104 КОЕ/мл, бифидобактерии - 5×104 КОЕ/мл. Этиологический диагноз с использованием стандартных методов лабораторной диагностики не установлен. Предлагаемым способом диагностики определено, что биоматериал взят в достаточном количестве - 106; на фоне снижения общего количества бактерий до 105, количество лактобактерий определено как 104, а количество двух «этиологически значимых» анаэробных условно-патогенных микроорганизмов составило соответственно 103 и 104. С помощью предлагаемого способа диагностики достоверно и объективно установлено: наличие выраженного дисбаланса микробиоты урогенитального тракта; проведена адекватная комплексная лекарственная терапия с применением 5-нитроимидазолов и антибактериальных препаратов широкого спектра действия с эффектом.

Пример 3. Женщина 23 лет, была обследована во время профилактического осмотра. Жалоб при обращении не предъявляла. В анамнезе отмечены хронический кольпит, хронический сальпингит. При осмотре в зеркалах обнаружены незначительной степени выраженности отек и гиперемия слизистых оболочек влагалища и наружной порции шейки матки, незначительные мутные выделения в заднем своде влагалища. Результаты микроскопии мазков, окрашенных по Граму, в пределах нормы. В бактериологическом посеве обнаружены энтерококки - 105; стафилококки - 104; лактобактерии - 5×104. На основании результатов стандартными методами диагностики этиологический диагноз установить не удалось. Предлагаемым способом диагностики определено, что биоматериал взят в достаточном количестве - 105. Общее количество бактерий составило 108. На фоне высокого содержания лактобактерий - 108 количество одного из «этиологически значимых» условно-патогенных микроорганизмов было определено как 106, что свидетельствует о наличии дисбаланса урогенитального тракта слабой степени выраженности. Проведена местная терапия с применением иммуномодулирующих препаратов с эффектом.

Информативная ценность предлагаемого способа диагностики дисбиотических нарушений оценивалась на основании сравнительного анализа с результатами микроскопического исследования мазков, окрашенных по Граму, и результатами культурального исследования.

Обследовано 39 женщин в возрасте от 15 до 47 лет (средний возраст составил 26,8 лет), обратившихся в КВД №19 г. Москвы преимущественно с профилактической целью или для обследования перед планируемой беременностью, а также с жалобами на незначительные выделения из влагалища и/или чувство дискомфорта в области мочеполовой системы. В результате стандартного обследования 7 (17,9%) женщин были признаны практически здоровыми, у 11-ти (28,2%) женщин верифицирован диагноз бактериального вагиноза (БВ), у 21-й (53,9%) пациентки диагноз не установлен в силу стертости клинической симптоматики и отрицательных результатов стандартных методов лабораторной диагностики. В спектр обязательных диагностических мероприятий входило обследование на облигатные патогены - гонококки, трихомонады, хламидии, генитальные микоплазмы, вирус простого герпеса 1, 2 типов, вирус папилломы человека, возбудители сифилиса, ВИЧ, гепатитов В, С; результаты были отрицательными.

С помощью тест-систем для ПЦР в «реальном времени», разработанных НПФ ДНК-технология, было исследовано отделяемое влагалища 39-ти женщин. Результаты исследования продемонстрировали наличие дисбаланса нормобиоты у 23-х (59,0%) из числа обследованных женщин (n=39; 100%). Среди 7-ми женщин, отнесенных в группу практически здоровых, у 2-х установлено наличие дисбаланса микробиоты. Во всех случаях верифицированного диагноза БВ результаты ПЦР в «реальном времени» совпадали с критериями R.Amsel (1983). В группе женщин с неясным клиническим диагнозом и отсутствием лабораторных признаков воспаления (n=21) у 12-ти (57,1%) подтверждено наличие дисбаланса микробиоты, 9 (42,9%) пациенток признаны практически здоровыми.

Таким образом, ПЦР в «реальном времени» позволяет (PCR RT) дифференцировать состояние здоровья и выявлять дисбаланс микробиоты на ранних стадиях, когда изменения ее количественного и качественного состава еще не сопровождаются выраженной клинической симптоматикой и достаточным может быть использование местнодействующих лекарственных средств per vaginae. Соответственно, ранняя диагностика и своевременная терапия позволяют избежать назначения системных лекарственных препаратов, тем самым избегать неизбежного развития побочных эффектов лекарственной терапии. Результаты сравнительного анализа информативной ценности диагностики дисбаланса микробиоты предлагаемым методом (PCR RT) и стандартными методами продемонстрировали: 1) 100% совпадение результатов предлагаемого метода (PCR RT) с результатами критериев R. Amsel (Amsel R., Totten P.A., Spiegel C.A. et al. Nonspecific vaginitis: diagnostic criteria and microbial and epidemiologic association // Amer.J.Med. - 1983. - Vol.74. - №1. - P.14-22) у больных с клинически выраженными формами БВ; 2) повышение выявления дисбаланса микробиоты у пациенток со стертой клинической симптоматикой методом PCR RT на 57,1%.

Сравнительный анализ информативной ценности стандартных методов дисбаланса нормобиоты (в том числе бактериального вагиноза) и PCR RT приведен в таблице.

Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности, характеризующийся тем, что с помощью метода полимеразной цепной реакции в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты и при превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы, а при значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты и при снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса, а при превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз, и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса.