Способ оценки состояния иммунитета
Владельцы патента RU 2371727:
ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИЭМ СО РАМН) (RU)
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при оценке иммунного статуса здорового и больного организма. Для осуществления способа оценки состояния иммунитета отбирают исходный материал из периферической крови и из места воспаления организма, получают из него клеточную взвесь на основе среды 199, делят ее на две равные части. Вносят в одну часть клеточной взвеси стимулирующий агент Staphylococcus aureus из расчета 1:10 в концентрации 2×107 м.т./мл. Далее размещают стимулированную и не стимулированную клеточную взвесь в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов отдельно для каждого исследуемого показателя. Определяют активность катионных белков, ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, а также НСТ-тест. Определяют индекс стимуляции для каждого показателя. О состоянии иммунитета судят по значению индекса стимуляции, который при значениях меньше единицы указывает на недостаточность противоинфекционной защиты организма. При этом, чем больше значений индекса стимуляции меньше единицы по изучаемым параметрам, тем меньше организм способен противостоять внедрению инфекционного агента и тем тяжелее протекает заболевание. Использование способа позволяет достоверно оценить состояние антиинфекционной защиты организма. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, аллергологии, дерматологии, пульмонологии, инфекционной микробиологии, ветеринарии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса здорового и больного организма.
Первоначальное состояние противоинфекционной защиты организма оказывает влияние на развитие и степень тяжести заболевания, поэтому определение состояния иммунитета позволяет оценить, насколько организм способен противостоять внедрению инфекционного агента. К одному из таких показателей состояния относятся клеточные механизмы неспецифической защиты, которые характеризуются показателями фагоцитоза и функциональной активности фагоцитарных клеток. Выявление степени напряженности функционального состояния этих клеток, относящихся к системному и местному иммунитету организма, в силу их быстрой реакции в ответ на внедрение бактерий представляет особенное прогностическое значение. При этом существенное возрастание активности фагоцитирующих клеток в ответ на внесение стимулирующего агента in vitro может служить критерием, позволяющим максимально точно судить о состоянии иммунитета как при патологии, так и при характеристике относительно здорового организма. Однако используемые в настоящее время методы исследования не всегда достоверно выявляют наличие нарушения антиинфекционной защиты организма как одного из наиболее важных состояний иммунитета.
Известны способы оценки нарушений противомикробной защиты организмов при инфекционных заболеваниях с определением изменения состояния неспецифического иммунитета в сравнении с соответствующими показателями здоровых организмов:
1) При этом исследуют активность функционального потенциала нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических и аллергических заболеваниях на основе показателей внутриклеточного содержания катионных белков в крови больных. Вычислялся коэффициент реализации по этому ферменту при дополнительной нагрузке нейтрофилов (в качестве стимулирующего агента к клеткам вносился Staphylococcus aureus). По величине этого показателя судят о степени тяжести гнойно-септического и аллергического процессов (Нестерова В.И., Светличная М.А. Значение исследования функционального потенциала нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических и аллергических заболеваниях у детей // Педиатрия, 1989, №9, С.63-65).
2) Известен способ определения недостаточности противомикробной защиты, при котором у больного определяют фагоцитарную активность лейкоцитов крови одновременно с контрольным лицом (эталоном) с заранее установленным уровнем фагоцитоза по отношению к его среднему уровню в группе здоровых людей. В качестве показателя фагоцитоза дополнительно определяют отношение суммы объектов, поглощенных активными фагоцитами, к общему числу неактивных и малоактивных фагоцитов. По результатам исследования эталона рассчитывают средний уровень фагоцитоза у здоровых людей, и показатель фагоцитоза у больного выражают в процентах к этому среднему уровню. При величине фагоцитарного показателя ниже его минимального уровня у здоровых людей диагностируют недостаточность противомикробной защиты. (В.Н.Каплин. Нетрадиционная иммунология инфекций. - Пермь, изд-во Пермской гос. мед. академии, 1996, 163 с.).
Недостатками данных способов является то, что исследуется только один показатель активности фагоцитов системного иммунитета (кровь) и полученные результаты не отражают состояние местного иммунитета больных.
Наиболее близким к заявляемому нами техническому решению является способ оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток для выявления повышенной чувствительности к инфекционным агентам (P.M.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов. Экологическая иммунология. - М., 1995, с.149-155).
При этом готовят взвесь клеток из периферической крови в концентрации 2 млн/мл (параметры системного иммунитета) человека и вносят ее в лунки плоскодонных планшетов для иммунологических анализов отдельно для каждого фермента и теста на адгезию, в триплетах для каждого образца. Для адгезии клеток планшет помещают в термостат на 45 мин, затем удаляют не адгезированные клетки, трижды отмывая фосфатным буфером (PBS, рН 7.2-7.4). К половине адгезированных клеток для стимуляции добавляют раствор зимозана, затем не стимулированные и стимулированные клетки в среде 199 помещают в термостат на 30 мин. После этого удаляют среду 199 и фиксируют клетки путем внесения 100 мкл 96% этилового спирта. Через 30 мин спирт удаляют и для активизации ферментов (миелоперокисидаза, кислая фосфатаза, катионные белки и нитросиний тетразолий) к клеткам добавляют соответствующие субстраты. После завершения реакции взаимодействия ферментов с субстратами клеточный монослой окрашивают красителем PBS, затем клетки трижды отмывают от не включившегося красителя, высушивают и растворяют внутриклеточно расположенный краситель 40 мМ раствором НСl в изопропаноле. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при соответствующей для каждого фермента длине волны.
Полученные показатели рассчитывают, учитывая количество адгезированных на пластик клеток, которое подсчитывают по формуле: Y=explnX2.09718556-9.78437829, где Y - количество адгезированных к пластику клеток, а X - оптическая плотность в ед × 10. Затем полученная при тестировании того или иного параметра функциональной активности клеток величина оптической плотности умножается на сто тысяч и делится на количество прилипших клеток, определяемое при тесте адгезии фагоцитирующих клеток на пластик.
Недостатком данного способа является то, что исследуются только показатели системного иммунитета (клеток крови), производится оценка параметров функциональной активности клеток только по отдельным ферментным системам клеток, сложность расчета показателей, при котором необходим дополнительный тест на адгезивную активность клеток, а также полученные результаты не отражают состояние местного иммунитета больных.
Задачей заявляемого технического решения является повышение точности и достоверности оценки состояния иммунитета за счет определения степени повреждения клеточных элементов иммунофагоцитарной системы организма.
Поставленная задача решается тем, что в способе оценки иммунитета, включающем сбор исходного материала из периферической крови, получение клеточной взвеси на основе среды 199, размещение ее в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов отдельно для каждого фермента, адгезирование клеток, отмывание клеток, деление их на две части, добавление в одну часть адгезированных клеток стимулирующего агента, инкубация стимулированных и не стимулированных клеток, удаление среды инкубации, фиксация клеток, внесение субстратов для определения ферментативной активности стимулированных и не стимулированных клеток по оптической плотности раствора и расчет показателя индекса стимуляции, согласно изобретению отбор исходного материала дополнительно осуществляют из места воспаления организма, клеточные взвеси делят на две равные части, стимулирующий агент вносят непосредственно в клеточную взвесь до размещения ее в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов, при этом в качестве стимулирующего агента используют Staphylococcus aureus из расчета 1:10 в концентрации 2×107 м.т./мл. Фиксацию клеток осуществляют парами формалина в течение 10-15 мин, определение ферментативной активности клеток осуществляют для 6-ти и более ферментов, а показатель индекса стимуляции определяют путем деления значения оптической плотности раствора стимулированных клеток на значение оптической плотности раствора не стимулированных клеток, о состоянии иммунитета судят по значению индекса стимуляции меньше или больше единицы.
При этом адгезирование стимулированных и не стимулированных клеток осуществляют путем инкубации в течение 45 мин при температуре 37°С. Клетки трижды отмывают фосфатным буфером (PBS, рН 7.2-7.4). Ферментативную активность клеток определяют для ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.
Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.
В качестве материала для исследования используют клеточную взвесь в концентрации 2 млн./мл, полученную одновременно из периферической крови и места воспаления человека или животного. Для чего венозную периферическую кровь и смыв из места воспаления (мокроту, смыв с раны) обрабатывают известным способом, а именно исходный материал в количестве 4 мл центрифугируют в течение 30 мин при 1500 об/мин, после чего отбирают надосадочную жидкость. Клеточную взвесь промывают 2 раза в 1 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса без фенолового красного при 1500 об/мин по 10 минут. В камере Горяева подсчитывают концентрацию ядросодержащих клеток. Разбавлением (добавление стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса без фенолового красного) получают необходимую для исследований клеточную взвесь в концентрации 2 млн в 1 мл.
Приготовленные клеточные взвеси (из периферической и смыв из места воспаления) на основе среды 199 делят на равные части и к каждой из половин добавляют стимулирующий агент. В качестве стимулирующего объекта фагоцитоза используют Staphylococcus aureus. Суспензию S.aureus разводят до концентрации 2×107 м.к./мл физиологическим раствором и вносят к взвеси клеток из расчета 10 бактерий на один фагоцит. Полученные стимулированные и не стимулированные клеточные взвеси размещают в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов отдельно для каждого фермента. Для адгезии и стимуляции клеток планшет помещают в термостат с температурой 37°С на 45 мин, затем удаляют неадгезированные клетки, трижды отмывая фосфатным буфером (PBS, рН 7.2-7.4). После этого удаляют среду 199 и фиксируют клетки парами формалина в течение 10-15 мин.
Для активизации ферментов миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков к клеткам добавляют соответствующие для исследуемого фермента субстраты. После завершения реакции взаимодействия ферментов с субстратами измеряют оптическую плотность стимулированных и не стимулированных растворов на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.
1) Прижизненный тест (НСТ-тест)
Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2×106 кл/мл на основе среды 199, включающей НСТ (nitro blue tetrazolium 0,5 мг/мл), делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2×107 м.к./мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от раствора НСТ и непоглощенных бактерий и высушивается. Монослой клеток фиксируется в парах формалина в течение 15 мин. Затем клетки разрушают путем добавления в лунки предварительно разогретого до 83°С диметилсульфамида (DMSO, производство «ICN») по 50 мкл. Оптическая плотность полученных растворов измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 540 нм.
2) Тесты на фиксированных образцах
Определение активности ферментов проводилось на фиксированных образцах, которые приготовляются следующим образом.
Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2×106 кл/мл делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2×107 м. к./мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от непоглощенных бактерий и высушивается. Затем фиксируют в парах формалина в течение 15 мин, после чего исследуют ферментативную активность клеток.
а) определение активности аденозинтрифосфатазы (АТФаза)
К адгезированным на пластике 96-луночного планшета и фиксированным нестимулированным и стимулированным клеткам взвеси добавляется по 50 мкл субстрата для АТФ 8 мг adenosine-5*-triphosphate (ICN) на 1 мл субстратного раствора, который готовится на основе 0,05 М трис-НСl-буфера (рН 7,8), путем растворения в 100 мл этого буфера 870 мг NaCl, 287 мг KCI и 52 мг MgCl2). Образцы оставляются в термостате при 37°С на 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученных субстратов на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 620 нм.
б) определение активности миелопероксидазы
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляем 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие адгезированные на пластик и фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность раствора определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм.
в) определение активности катионных белков
В лунки с фиксированными на пластике клетками вносится по 50 мкл раствора, содержащего 10 мг прочного зеленого ("Fast Green", "Serva"), растворенного в 10 мл метанолового трис-буфера (рН 8,0-8,2). Планшет инкубируется в течение 30 мин при 37°С. Затем невключившийся краситель отмывается раствором Хенкса дважды. Связанный с катионными белками клеток краситель растворяется добавлением диметилсульфоксида (50 мкл), предварительно разогретого на водяной бане до 80°С. Результаты учитываются с помощью спектрофотометра «Titertek Multiscan Plus» при длине волны 620 нм.
г) определение активности кислой фосфатазы
В лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержавшего фиксированные клетки, вносится по 50 мкл раствора паранитрофенилфосфата (ПНФФ-раствор, ICN). Для его приготовления 0,09 г ПНФФ и 0,31 г NaCl растворялось в 37 мл 1М натрий-цитратного буфера (рН 5,5). Образцы инкубируются при 37°С в течение 30 мин. Затем добавлением 0,2 М раствора NaOH по 100 мкл на лунку реакция останавливается. Оптическая плотность раствора измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 405 нм.
д) определение активности цитохромоксидазы
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5, добавляем 20 мг 3,3*-diaminobenzidine (ICN), 100 мг MnCl2 и 300 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм.
д) определение активности лактатдегидрогеназы
К адгезированным и фиксированным на пластике клеткам добавляется 100 мкл раствора iodonitrotetrazolium violet (йоднитротетразолий, ЙНТ, производства ICN) с концентрацией 2 мг/мл. Для этого 20 мг ЙНТ растворяется сначала в 0,5 мл 70° спирта, а затем добавляется 9,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором ЙНТ инкубируется при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается. Расположенные внутриклеточно гранулы диформазана растворяют 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическая плотность раствора определяется на микроплатном рейдере при длине волны 492 нм.
е) определение активности сукцинатдегидрогеназы
Определение активности фермента проводится в МТТ-тесте, где в качестве субстрата используется 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN).
В лунки к фиксированным клеткам добавляется по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубируется при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается на воздухе. Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушаются добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl. Оптическая плотность определяется на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм.
Реакции ставятся в триплетах лунок плоскодонного 96-луночного планшета с не стимулированными и стимулированными клетками. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при соответствующей для каждого фермента длине волны.
Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражают в виде индекса стимуляции, который определяется как отношение оптической плотности раствора стимулированных клеток к оптической плотности раствора не стимулированных клеток.
Значение индекса стимуляции больше единицы указывает на способность организма противостоять возбудителям заболеваний, тогда как значение меньше единицы означает нарушение иммунитета по изучаемым параметрам. Комплексная оценка состояния системного и местного иммунитета при сопоставлении всех значений полученных индексов стимуляции позволяет судить о степени нарушения противоинфекционной защиты организма. Чем больше значений индекса стимуляции меньше единицы по изучаемым параметрам, тем меньше организм способен противостоять внедрению инфекционного агента и тем тяжелее протекает его заболевание.
Таким образом, данный способ оценки состояния иммунитета позволяет сделать объективные точные выводы о степени нарушения защиты организма не только при различных патологических состояниях (заболевание), но и у относительно здоровых лиц.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в следующем.
1. В качестве материала для исследования клеток одновременно используют периферическую кровь (системный иммунитет) и смыв с места воспаления (рана, индуцированная мокрота или место заражения - местный иммунитет). Этот материал, максимально точно отражает параметры системного и местного иммунитета, при сопоставлении таких показателей можно объективно судить о защите организма от возбудителей заболеваний.
2. Стимулирующий агент вносят непосредственно в клеточную взвесь до размещения ее в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов. Это позволяет более однородно распределить стимулирующий агент в клеточной взвеси, а также сократить трудоемкость этого процесса и избежать предварительной стимуляции клеток в процессе адгезии.
3. В качестве стимулирующего агента вносится бактерия S. aureus, которая физиологически более приближена к специфическим стимуляторам клеток в организме из расчета 1:10 в концентрации 2×107 м.т./мл.
4. Фиксацию клеток осуществляют парами формалина в течение 10-15 мин, что позволяет сохранить первоначальную активность ферментов для более точного определения внутриклеточной концентрации ферментов.
5. Стимулирование активности ферментов в клетках осуществляют для 6-ти и более ферментов, что способствует увеличению точности определения состояния иммунитета исследуемого организма.
6. Показатель индекса стимуляции определяют путем деления значения оптической плотности раствора стимулированных клеток на значение оптической плотности раствора не стимулированных клеток.
7. О состоянии иммунитета судят по значению индекса стимуляции, который при значениях меньше единицы указывает на недостаточность противоинфекционной защиты организма. При использовании этого показателя способ определения состояния иммунитета организма упрощается, повышается его информативность и достоверность.
Примеры конкретного выполнения
Нами проведены исследования функциональной активности клеток системного (периферическая кровь) и местного (рана, индуцированная мокрота) иммунитета здоровых и больных людей, а также животных. Материалы для исследования от больных внебольничной пневмонией средней и тяжелой степени и острым бронхитом, а также и здоровых людей были получены в пульмонологических отделениях Главного госпиталя Тихоокеанского флота (г.Владивосток) и Госпиталя ТОРПУ ФПС РФ (г.Владивосток) в период с 2002 по 2004 г. Диагноз внебольничной пневмонии устанавливался на основании общепринятых критериев (Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике / А.Г.Чучалин, А.И.Синопальников, С.В.Яковлев и др.- Смоленск: Авентис, 2003. - 54 с.). Оценка тяжести состояния больных на момент поступления проводилась по критериям, предложенным Л.И. Дворецким в 1996 году (Окороков A.Н. Диагностика болезней органов дыхания / А.Н.Окороков. - М.: Мед. лит., 2000. - 448 с.). Материалы от здоровых и больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой и гнойно-асептическим воспалением, вызванным стафилококком, животных исследовались в лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.
Пример №1
Здоровый доброволец К., возраст 19 лет.
Пациенту проводились ингаляции 3-5% стерильного гипертонического солевого раствора с помощью компрессионного небулайзера "Omron CX-3" (Япония) сеансами по 7 минут. Затем он полоскал рот и откашливал мокроту в стерильную полимерную одноразовую чашку Петри диаметром 90 мм (GREINER BIO-ONE, Германия). После этого индуцированную мокроту с помощью стерильного одноразового 10 мл шприца переносили в центрифужные градуированные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой. Добавляли 0,1% раствор дитиотреитола в соотношении 1:1. Встряхивали смесь в течение 10 минут и фильтровали через нейлоновую марлю.
Отфильтрованную индуцированную мокроту центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут, затем супернатант сливали, а клеточную взвесь промывали 3 раза по 10 минут в 1 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса без фенолового красного при 1200 об/мин. В камере Горяева подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток. Разбавлением (добавлением стерильного физиологического раствора) получали необходимую для исследований клеточную взвесь в концентрации 2×106 кл/мл, в половину проб вносили S.aureus в концентрации 2×107 м. к./мл.
Из локтевой вены брали 4,0 мл крови, центрифугировали в течение 30 мин при 1500 оборотов, после чего отбирали надосадочную жидкость. Клеточную взвесь промывали 2 раза в 1 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса без фенолового красного при 1200 об/мин по 10 минут. В камере Горяева подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток. Разбавлением (добавлением стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса без фенолового красного) получали клеточную взвесь в концентрации 2 млн в 1 мл, в половину проб вносили S.aureus в концентрации 2×107 м.к./мл.
Полученные стимулированные и не стимулированные клеточные взвеси размещали в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов отдельно для каждого фермента. Для адгезии клеток планшет помещали в термостат с температурой 37°С на 45 мин, затем удаляли неадгезированные клетки, трижды отмывая фосфатным буфером (PBS, рН 7.2-7.4). После этого фиксировали клетки парами формалина в течение 15 мин.
Для определения активности ферментов миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков к клеткам добавляли соответствующие данным ферментам субстраты. После завершения реакции взаимодействия ферментов с субстратами оценивали ферментативную активность фагоцитов с помощью спектрофотометрического определения оптической плотности растворов.
Реакции ставили в триплетах лунок для каждого образца плоскодонного 96-луночного планшета с не стимулированными и стимулированными клетками.
1) Прижизненный тест (НСТ-тест)
Выделенную клеточную взвесь в концентрации 2×106 кл/мл на основе среды 199, включающей НСТ (nitro blue tetrazolium 0,5 мг/мл), делили на две части и в половину из проб вносили S.aureus в концентрации 2×107 м. к./мл. Затем клеточную взвесь с бактериями и без них разносили по 100 мкл в лунки планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывали теплым раствором Хенкса без фенолового красного от раствора НСТ и непоглощенных бактерий и высушивали. Монослой клеток фиксировали в парах формалина в течение 15 мин.
Затем клетки разрушали путем добавления в лунки предварительно разогретого до 83°С диметилсульфамида (DMSO, производство «ICN») по 50 мкл. Оптическая плотность полученных субстратов измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 540 нм.
2) Тесты на фиксированных образцах
Определение активности ферментов проводилось на фиксированных образцах, которые приготавливали следующим образом: после инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывали теплым раствором Хенкса без фенолового красного от непоглощенных бактерий и высушивали. Фиксировали в парах формалина в течение 15 мин.
а) определение активности аденозинтрифосфатазы (АТФаза)
К адгезированным на пластике 96-луночного планшета и фиксированным нестимулированным и стимулированным клеткам добавляли по 50 мкл субстрата для АТФ 8 мг adenosine-5*-triphosphate (ICN) на 1 мл субстратного раствора, который готовили на основе 0,05 М трис-НСl-буфера (рН 7,8), включавшем 870 мг NaCl, 287 мг KCl и 52 мг МgСl2. Образцы оставляли в термостате при 37°С на 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученных субстратов на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 620 нм.
б) определение активности миелопероксидазы (МПО)
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляли 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносили в лунки планшета, содержащие адгезированные на пластик и фиксированные клетки. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакцию останавливали добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм.
в) определение активности катионных белков (КБ)
В лунки с фиксированными на пластике клетками вносили по 50 мкл раствора, содержащего 10 мг прочного зеленого ("Fast Green", "Serva"), растворенного в 10 мл метанолового трис-буфера (рН 8,0-8,2). Планшет инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем невключившийся краситель отмывали раствором Хенкса дважды. Связанный с катионными белками клеток краситель растворяли добавлением диметилсульфоксида (50 мкл), предварительно разогретого на водяной бане до 80°С. Результаты учитывали с помощью спектрофотометра «Titertek Multiscan Plus» при длине волны 620 нм.
г) определение активности кислой фосфатазы (КФ)
В лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержавшего фиксированные клетки, вносили по 50 мкл раствора паранитрофенилфосфата (ПНФФ-раствор, ICN). Для его приготовления 0,09 г ПНФФ и 0,31 г NaCl растворялось в 37 мл 1М натрий-цитратного буфера (рН 5,5). Образцы инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 0,2 М раствора NaOH по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 405 нм.
д) определение активности цитохромоксидазы (ЦXO)
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5, добавляем 20 мг 3,3*-diaminobenzidine (ICN), 100 мг MnCl2 и 300 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносили в лунки планшета, содержащие фиксированные клетки. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакцию останавливали добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм.
д) определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
К адгезированным и фиксированным на пластике клеткам добавляли 100 мкл раствора iodonitrotetrazolium violet (йоднитротетразолий, ЙНТ, производства ICN) с концентрацией 2 мг/мл. Для этого 20 мг ЙНТ растворяли сначала в 0,5 мл 70° спирта, а затем добавляли 9,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором ЙНТ инкубировали при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляли, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и высушивали. Расположенные внутриклеточно гранулы диформазана растворяли 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическую плотность раствора определяли на микроплатном рейдере при длине волны 492 нм.
е) определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ)
Определение активности фермента проводили в МТТ-тесте, где в качестве субстрата использовали 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN).
В лунки к фиксированным клеткам добавляли по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора МnСl2. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубировали при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляли, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и высушивали на воздухе. Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушали добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl. Оптическую плотность определяли на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм.
Показатель индекса стимуляции определяли путем деления значения оптической плотности раствора стимулированных клеток на значение оптической плотности раствора не стимулированных клеток.
Результаты представлены в табл.1.
| Таблица 1 | ||
| Показатели индекса стимуляции клеток индуцированной мокроты и крови здорового добровольца | ||
| Исследуемые ферменты | Значение индексов стимуляции для клеток индуцированной мокроты | Значение индексов стимуляции для клеток крови |
| НСТ-тест | 1,206745 | 1,362218 |
| АТФаза | 1,0941315 | 0,939959 |
| МПО | 1,037406 | 1,068123 |
| КБ | 1,063939 | 1,047014 |
| КФ | 1,250909 | 1,030239 |
| ЦХО | 1,56321 | 1,03528 |
| ЛДГ | 1,15603 | 1,14563 |
| СДГ | 1,82411 | 1,65324 |
Значение индекса стимуляции для всех клеток здорового добровольца было больше единицы, что указывало на способность организма противостоять возбудителям заболеваний и свидетельствовало об отсутствии нарушения противоинфекционной защиты организма.
Пример №2
Больной В., возраст 19 лет.
Диагноз: Внебольничная пневмония средней степени тяжести.
Состояние параметров системного и местного иммунитета больного оценивалось аналогично примеру №1. Данные представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Показатели индекса стимуляции клеток индуцированной мокроты и крови больного внебольничной пневмонией средней степени тяжести | ||
| Исследуемые ферменты | Значение индексов стимуляции для клеток индуцированной мокроты | Значение индексов стимуляции для клеток крови |
| НСТ-тест | 1,100629 | 1,082969 |
| АТФаза | 1,102564 | 1,139591 |
| МПО | 0,713415 | 0,765412 |
| КБ | 0,951731 | 1,032768 |
| КФ | 0,96977 | 1,153571 |
| ЦХО | 0,87456 | 0,78923 |
| ЛДГ | 0,79562 | 1,02657 |
| СДГ | 1,23567 | 1,009546 |
Значения индекса стимуляции для клеток крови больного внебольничной пневмонией средней степени тяжести преимущественно были больше единицы, тогда как для клеток индуцированной мокроты (факторы местного иммунитета) меньше этого значения. Сопоставление полученных параметров системного и местного иммунитета указывало на недостаточную способность организма противостоять возбудителю заболевания и свидетельствовало о наличии частичного нарушения противоинфекционной защиты организма.
При сравнении полученных показателей со значениями индекса стимуляции, полученных в результате исследования системного и местного иммунитета больного тяжелой внебольничной пневмонией (табл.3), можно судить о степени тяжести заболевания. Преимущественно, у последнего были получены значения индекса стимуляции меньше единицы, что свидетельствовало об отсутствии противоинфекционной защиты организма.
Больной С., возраст 19 лет.
Диагноз: Внебольничная пневмония тяжелой степени.
| Таблица 3 | ||
| Показатели индекса стимуляции клеток индуцированной мокроты и крови больного тяжелой внебольничной пневмонией | ||
| Исследуемые ферменты | Значение индексов стимуляции для клеток индуцированной мокроты | Значение индексов стимуляции для клеток крови |
| НСТ-тест | 0,678937 | 0,748447 |
| АТФаза | 1,021484 | 1,189655 |
| МПО | 0,857043 | 0,515102 |
| КБ | 0,643931 | 0,790894 |
| КФ | 0,874317 | 0,89392 |
| ЦХО | 0,423645 | 0,954123 |
| ЛДГ | 0,654312 | 0,564712 |
| СДГ | 0,789965 | 0,678912 |
Пример №3
Морская свинка с гнойно-септической раной
Состояние параметров системного и местного иммунитета животного оценивалось аналогично примеру №1. Данные представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||
| Показатели индекса стимуляции клеток места воспаления (рана) и крови животного | ||
| Исследуемые ферменты | Значение индексов стимуляции для клеток раны | Значение индексов стимуляции для клеток крови |
| НСТ-тест | 0,929454 | 1,23564 |
| АТФаза | 0,641791 | 0,862197 |
| МПО | 0,903716 | 0,755435 |
| КБ | 0,85432 | 1,12472 |
| КФ | 0,929661 | 0,938395 |
| ЦХО | 1,017157 | 0,803493 |
| ЛДГ | 0,995556 | 0,51423 |
| СДГ | 1,086364 | 0,879641 |
Значение индекса стимуляции для клеток животного с гнойно-септической раной преимущественно ниже единицы, что указывает на недостаточную способность организма противостоять возбудителю заболевания и свидетельствует о наличии нарушения противоинфекционной защиты организма.
Пример №4
Морская свинка, больная дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой, внутрибрюшинное введение бактерий, для исследования клеток места воспаления взят перитонеальный экссудат.
Состояние параметров системного и местного иммунитета животного оценивалось аналогично примеру №1. Данные представлены в таблице 5.
| Таблица 5 | ||
| Показатели индекса стимуляции клеток места воспаления (перитонеальный экссудат) и крови животного, больного дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой | ||
| Исследуемые ферменты | Значение индексов стимуляции для клеток перитонеального экссудата | Значение индексов стимуляции для клеток крови |
| НСТ-тест | 0,769817 | 1,091447 |
| АТФаза | 1,107339 | 1,091712 |
| МПО | 1,030097 | 1,027063 |
| КБ | 0,836939 | 0,917153 |
| КФ | 0,993098 | 0,817337 |
| ЦХО | 1,023654 | 1,23145 |
| ЛДГ | 0,715614 | 0,67851 |
| СДГ | 0,975102 | 1,142361 |
Значения индекса стимуляции для клеток крови животного, больного дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой, преимущественно были больше единицы, тогда как для клеток перитонеального экссудата (факторы местного иммунитета) меньше этого значения. Сопоставление полученных параметров системного и местного иммунитета указывало на недостаточную способность организма противостоять возбудителю заболевания и свидетельствовало о наличии частичного нарушения противоинфекционной защиты организма.
Таким образом, предлагаемый нами способ оценки состояния иммунитета, а именно - степени повреждения клеточных элементов иммунофагоцитарной системы организма не менее чем по шести критериям после их дополнительной нагрузки, позволяет достоверно оценить состояние антиинфекционной защиты организма. Данное состояние этого параметра иммунитета необходимо учитывать как при характеристике относительно здорового организма, так и при характеристике организма с наличием повреждающих инфекционных факторов, выявляя при этом степень тяжести патологических процессов.
1. Способ оценки состояния иммунитета путем определения показателя индекса стимуляции клеток, включающий сбор исходного материала из периферической крови, получение клеточной взвеси на основе среды 199, ее размещение в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов отдельно для каждого фермента, адгезирование клеток, отмывание клеток, деление их на две части, добавление в одну часть адгезированных клеток стимулирующего агента, инкубацию стимулированных и нестимулированных клеток, удаление среды инкубации, фиксацию клеток, внесение субстратов для определения ферментативной активности клеток по оптической плотности раствора стимулированных и нестимулированных клеток и расчет индекса стимуляции, отличающийся тем, что отбор исходного материала дополнительно к периферической крови осуществляют из места воспаления организма, получают клеточную взвесь, делят ее на две равные части, стимулирующий агент вносят непосредственно в клеточную взвесь до размещения ее лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов, при этом в качестве стимулирующего агента используют Staphylococcus aureus из расчета 1:10 в концентрации 2×107 м.т./мл, а инкубацию клеток проводят одновременно с адгезией при 37°С в течение 45 мин, фиксацию клеток осуществляют парами формалина в течение 10-15 мин, оценивают активность катионных белков, ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфотазы, сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, кислой фосфотазы, а также НСТ-тест (тест восстановления нитросинего тетразолия), показатель индекса стимуляции определяют путем деления значения оптической плотности раствора стимулированных клеток на значение оптической плотности раствора нестимулированных клеток, а о состоянии иммунитета и тяжести патологических процессов судят по значению индекса стимуляции, который при значениях меньше единицы указывает на недостаточность противоинфекционной защиты организма, при этом, чем больше значений индекса стимуляции меньше единицы по изучаемым параметрам, тем меньше организм способен противостоять внедрению инфекционного агента и тем тяжелее протекает заболевание.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.
