Способ получения продигиозина
Владельцы патента RU 2384615:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина" (ГОУ ВПО КГУ) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в промышленности в качестве красителя для пластмасс, маркера нефтепродуктов, в медицине как новое семейство противоопухолевых препаратов и иммунодепрессант. Штамм Serratia marcescens BKM В - 851 культивируют в условиях аэрации на жидкой питательной среде, содержащей колламин (гидролизат коллагена), глицерин, K2SO4, MgCl2 и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Проводят экстракцию пигмента из клеток подкисленным 96% этанолом с последующим отделением пигмента от бактериальной биомассы. Изобретение позволяет увеличить выход продигиозина. 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения бактериальных пигментов, в частности ярко-красного пигмента продигиозина, синтезируемого энтеробактериями Serratia marcescens, который может быть использован в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя для пластмасс, маркера нефтепродуктов. В медицине продигиозин и продигиозинподобные пигменты рассматриваются как новое семейство противоопухолевых препаратов и иммунодепрессанты. Применение пигмента в промышленности тормозится из-за его высокой стоимости.
Известны способы получения продигиозина с использованием различных штаммов-продуцентов и различных питательных сред [1, 2, 3, 4, 5].
Недостатком этих способов является потеря способности к образованию продигиозина штаммами продуцентами при длительном хранении в лабораторных условиях, низкий выход пигмента, наличие в питательной среде в качестве источника азота дорогостоящих пептона и других органических источников, длительное выращивание бактерий, использование в отдельных случаях агаризованной среды, что ограничивает применение пигмента.
Наиболее близким к предлагаемому, выбранному в качестве прототипа по совокупности признаков и достигаемому результату, является способ получения продигиозина, описанный Трутко и Акименко [3].
Serratia marcescens BKM В-851 выращивают в колбах на качалках с перемешиванием при 200 об/мин при температуре 29°С на жидкой питательной среде Кинга А [3].
Недостатком прототипа является низкий выход целевого продукта, использование в питательной среде в качестве источника азота высокого содержания дорогостоящего пептона, что не реально в условиях промышленного получения пигмента, ввиду дороговизны способа.
Задачей или техническим результатом заявляемого изобретения является повышение выхода целевого продукта (продигиозина).
Сущность заявляемого способа заключается в том, что с целью повышения выхода бактериального пигмента продигиозина, в условиях, предусматривающих культивирование при аэрации и перемешивании культуры на жидкой питательной среде, содержащей источник азота, глицерин, K2SO4, MgCl2, в качестве продуцента пигмента штамм Serratia marcescens BKM В-851, экстракцию пигмента из клеток, отделение пигмента от бактериальной массы, в качестве источника азота питательная среда содержит колламин (гидролизат коллагена), при следующем содержании компонентов, г/литр дистиллированной воды:
Колламин - 5,0
Глицерин - 10,0
K2SO4 - 10,0
MgCl2 - 1,4, a экстракцию проводят подкисленным 96% этанолом.
Штамм Serratia marcescens BKM B-851 отобран в результате исследования пигментообразования 22 штаммов Serratia marcescens из коллекции микроорганизмов, хранящихся на кафедре микробиологии Казанского государственного университета. Исследованные штаммы были получены в различные годы из различных коллекций, а также выделены из воздуха и почвы. Штамм Serratia marcescens BKM B-851 отличается от других изученных штаммов высоким выходом продигиозина. Кроме того, для штамма Serratia marcescens BKM B-851, в отличие от других исследованных штаммов, характерно сохранение способности к пигментообразованию при длительном хранении в лабораторных условиях в коллекции без пересева (в течение четырех лет).
В работе использовали «колламин 80 пищевой» гидролизат коллагена (сырье для производства БАД, СПП) (ТУ9186-002-18045931-07), изготовленный ЗАО «Биопрогресс» (141142, Московская обл., Щелковский р-н, п. Биокомбинат, ВНИТИБП). Источник получения колламина 80 - коллагеновый слой кожи млекопитающих. Колламин 80 является протеолитическим гидролизатом коллагена и содержит все аминокислоты этого белка (в том числе незаменимые) в природно-сбалансированном соотношении: аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, валин, гистидин, глицин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, оксилизин, орнитин, лизин, метионин, пролин, серин, тирозин, треонин, триптофан, фенилаланин, цистеин, оксипролин, таурин.
Колламин 80 представляет собой смесь аминокислот, ди-, три-, и тетрапептидов. Водорастворимая фракция составляет 100%, где 45% - свободные аминокислоты, ди-, три- и тетрапептиды около 52%, полипептиды с молекулярной массой более или равной 2000D - менее 1%.
В препарате, согласно паспорту, массовая доля влаги, %, не более 2,41; массовая доля аминного азота, %, не менее 4,2; рН 1% раствора - 5,15 [http://www.kollamin80.ru/].
Изобретение позволяет существенно увеличить выход продигиозина и соответственно удешевить его стоимость.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Приготовление питательной среды
В 0,5 литра дистиллированной воды растворяют последовательно: колламин (гидролизат коллагена) - 5,0 г; глицерин - 10,0 г; K2SO4 - 10,0 г; MgCl2 - 1,4 г, и среду доводят дистиллированной водой до литра. рН среды доводят до 7,6-7,8 при помощи NaOH. Полученную таким образом среду разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 0,5-0,7 атм.
Подготовка посевного материала
Культуру Serratia marcescens BKM B-851 выращивают в течение суток в пробирках со скошенной агаризованной средой при температуре 28±0,1°С.
Выросшие клетки смывают 0,5% физиологическим раствором из расчета 5 мл физиологического раствора на пробирку. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 1% от объема среды в колбах.
Постановка опыта
Посевной материал засевают в конические колбы с питательной средой. Отношение объема питательной среды к объему колбы - 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при 28±0,1°С в течение 48 часов. Затем бактериальные клетки собирают центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин.
Экстракция пигмента из клеток
Экстракцию пигмента из клеток проводят подкисленным 96% этанолом (9 мл 96% этанола + 1 мл 1N HCl). 2 г биомассы заливают 40 мл подкисленного этанола и встряхивают в течение 1 часа. Затем центрифугированием либо отстаиванием клетки отделяют от надосадочной жидкости, содержащей пигмент, и вторично заливают новой порцией этанола, обработку клеток этанолом повторяют дважды. Затем бактериальную массу отделяют, и пигмент высушивают в вакуумном шкафу при температуре 30°С. Полученный пигментный препарат растворяется в нефтепродуктах, этаноле, ацетоне, метаноле, неполярных растворителях и не растворяется в воде.
Определение содержания пигмента в полученных препаратах
Для этого полученный пигмент растворяют в подкисленном этаноле (9 мл 96% этанола + 1 мл 1N HCl). Количество пигмента рассчитывают по коэффициенту абсорбции продигиозина на спектрофотометре при длине волны 535 нм в 1 см кюветах. При длине волны 535 нм коэффициент абсорбции продигиозина составляет 51,5*103 мг/мл/см2 (пятьдесят одна целая и пять десятых, умноженное на десять в третьей степени мг/мл) [6].
Выход пигмента составляет 0,90-0,92 г/л питательной среды (таблица 1).
Пример 2. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют агаризованную овсяную среду [4]
Пример 3. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют пептон-глицериновую среду [2]. Пептон-глицериновая среда широко используется различными авторами для получения пигмента - продигиозина.
Пример 4. Проводят аналогичным образом, кроме того, что в качестве питательной среды используют среду Кинга А (прототип) [3].
Пример 5. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 20 г/л.
Пример 6. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 10 г/л.
Пример 7. Проводят аналогичным образом, кроме того, что содержание колламина в среде составляет 2,5 г/л.
Пример 8. Проводят аналогичным образом за исключением того, что бактерии выращивают в течение 144 ч, в процессе роста из опытной колбы отбирают пробы через каждые 24 часа в течение 144 часов.
Сравнительное изучение биосинтеза пигмента штаммом Serratia marcescens BKM В-851 на предлагаемой и известных средах показывает, что на предлагаемой среде выход пигмента выше в 2,4 - 5,0 раза в зависимости от сравниваемой среды, а стоимость 1 г продигиозина (из расчета стоимости среды) удешевляется в 8 раз по сравнению с пептон-глицериновой средой, в 28 раз по сравнению с агаризованной овсяной средой, в 20 раз по сравнению с прототипом (таблица 1).
| Таблица 1 | ||
| питательная среда | пигмент (г/л) | Стоимость литра среды (рубли) |
| предлагаемая | 0,920±0,078 | 7,0 |
| известная, агаризованная овсяная (4) | 0,380±0,050 | 75,0 |
| известная, пептон-глицериновая (2) | 0,185±0,006 | 11,0 |
| известная, Кинга А прототип (3) | 0,230±0,040 | 36,0 |
Значения относительного выхода продигиозина при использовании штамма Serratia marcescens BKM В-851 в зависимости от соотношения компонентов среды (колламина, г/л Н2О) представлены в таблице 2. Снижение либо повышение концентрации колламина относительно оптимального его количества (5 г/л среды) приводит к снижению выхода пигмента.
Результаты изучения времени культивирования, необходимого для получения максимального количества пигмента, представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, на рекомендуемой среде максимальное количество пигмента штаммом Serratia marcescens BKM В-851 образуется на 48 час роста бактерий.
| Таблица 3 | |
| Время культивирования продуцента на рекомендуемой среде, ч | Количество продигиозина, % от оптимального значения |
| 24 | 94 |
| 48 | 100 |
| 72 | 78 |
| 96 | 60 |
| 120 | 51 |
| 144 | 50 |
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Предлагаемый способ имеет изобретательский уровень, так как не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с его отличительными признаками и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в полупроизводственных условиях и в промышленности посредством использования стандартных устройств, например ферментеров и лабораторного оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Литература
1. Williams R.P. Studies on pigmentation of Serratia marcescens. / R.P. Williams, C.L.Gott, J.A.Green // J. Bacteriol. - 1961. - V.81, №3. - P.376-379.
2. Katz D.S. Detection of pigment precursors in white clinical strains of Serratia marcescens/ D.S. Katz, R.J. Sobleski // J. Gen. Microbiol. - 1979. - V.9, №2. - P.301-303.
3. Трутко С.М. Роль процесса биосинтеза продигиозина в регуляции окислительного обмена продуцента / С.М.Трутко, В.К.Акименко // Микробиология. - 1989. - Т.58, №3. - С.723-729.
4. Гарейшина А.З. Композиция, включающая нефтепродукт и маркер, способ и раствор для маркирования нефтепродукта, способ идентификации нефтепродукта и способ получения маркера / А.З.Гарейшина, Е.В.Петухова, Д.В.Юсупова, Н.А.Лебедев, Т.Н.Чертилина, А.З.Пономарева // Патент на изобретение RU №2218381, C10L 1/00, С10М 159/02, C10N 30:20, приоритет от 22.07.02. - 2003. Бюл. №34.
5. Wei J.H. Enhanced production of prodigiosin - like pigment from Serratia marcescens SM delta R by medium improvement and oil - supplementation strategies / J.H. Wei, W.C. Chen // J. BiosciBioeng. - 2005, №6. - P.616-622.
6. Williams R.P. Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens // R.P.Williams, C.L.Gott, S.M.Qadri // J.Bacteriol. - 1971, - V.106, №2. - P.438-443.
7. Колламин 80 [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://www.kollamin80.ru/ - Дата доступа: 09.10.2008.
Способ получения продигиозина, предусматривающий культивирование штамма Serratia marcescens BKM В-851 в условиях аэрации на жидкой питательной среде, содержащей источник азота, глицерин, K2SO4, MgCl2, экстракцию пигмента из клеток, отделение пигмента от бактериальной биомассы, отличающийся тем, что в качестве источника азота питательная среда содержит колламин, при следующем содержании компонентов дистиллированной воды, г/л.
| колламин | 5,0 |
| глицерин | 10,0 |
| K2SO4 | 10,0 |
| MgCl2 | 1,4 |
а экстракцию проводят подкисленным 96% этанолом.
