Способ очистки рекомбинантного интерферона -1b



C07K1/36 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2392282:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (RU)
Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное агентство по науке и инновациям (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантного интерферона бета-1b человека. Предложенный способ очистки рекомбинантного интерферона бета-1b человека (рИФН бета-1b) предусматривает оптимизацию процессов отмывания тел включения, их растворения и рефолдинга целевого белка. Очистка рИФН бета-1b человека ведется с использованием в качестве основного детергента цвиттергента 3-14 для отмывки и растворения тел включения E.coli с последующим рефолдингом рИФН бета-1b, после чего осуществляют прехроматографическую обработку образца. Далее проводят хроматографию на Ceramic S, хроматографию на Source S30 и окисление с использованием смеси цистеамин/цистамин, после чего делают гель-фильтрацию на Superdex 75 Prep grade, хроматографию на Source Q30, гель-фильтрации на Sephacril S200HR и в конце осуществляют контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложенный способ очистки позволяет обеспечить 10% выход целевого белка и получить рИФН бета-1b человека, отвечающий требованиям нормативных документов с высоким уровнем удельной противовирусной активности. 5 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения рекомбинантного интерферона бета-1b человека, в частности к способу его очистки.

Интерфероны (ИФН) - гетерогенные гликопротеины иммунной системы, обладающие противовирусными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими эффектами и различающиеся между собой как источником клеточной продукции, так и проявлениями функциональной активности. ИФН бета с самых первых шагов внедрения его рекомбинантных препаратов был предназначен, главным образом, для противоопухолевой терапии [С. Angelucci et al. Recombinant human IFN-beta affects androgen receptor level, neuroendocrine differentiation, cell adhesion, and motility in prostate cancer cells. J. Interferon Cytokine Res., 2007, 27(8): 643-52; S. Kohashi et al. Interferon-beta inhibits liver metastases from murine colon 26 carcinoma and its highly metastatic variant. Surg. Today, 2007, 37(6): 474-481]. Помимо этого, препараты ИФН бета востребованы для лечения вирусных инфекций, в частности гепатита С, везикулярного стоматита и других [I.M. Pedersen et al. Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism. Nature, 2007, 449 (7164): 919-22; J. Feher, G. Lengyel. Interferon in the treatment of viral hepatitis. The interferon was discovered 50 years ago. Orv. Hetil., 2007, 148(33): 1539-43; M.D. Trottier, D.S. Lyles, C.S. Reiss. Peripheral, but not central nervous system, type I interferon expression in mice in response to intranasal vesicular stomatitis virus infection. J. Neurovirol., 2007, 13(5): 433-445]. В последние годы основным направлением применения рИФН бета-1b стали неврологические заболевания, в первую очередь рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания нервной системы, болезнь Бехтерева [М. Kremenchutzky, S. Morrow, С. Rush. The safety and efficacy of IFN-beta products for the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Drug Saf., 2007, 6(3): 279-88; S. Pay et al. Dendritic cell subsets and type I interferon system in Behçet's disease: does functional abnormality in plasmacytoid dendritic cells contribute to Th1 polarization? Clin. Exp. Rheumatol., 2007, 25 (4 Suppl 45): S34-40]. Отмечена клиническая эффективность рИФН бета-1b при терапии стероидоустойчивого язвенного колита, гломерулонефрита, хронического панкреатита [S.C. Satchell et al. Interferon-beta Reduces Proteinuria in Experimental Glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 2007, 18(11): 2875-84; R. Talukdar, R.K. Tandon. Pancreatic stellate cells: New target in the treatment of chronic pancreatitis. J. Gastroenterol. Hepatol., 2007].

Среди препаратов ИФН бета наибольшее признание на мировом фармацевтическом рынке заслужили рекомбинантный ИФН бета-1b, или Бетаферон (Schering AG, Germany), и в меньшей степени ИФН бета-1а, в частности Авонекс (Gedeon Richter, Hungary). Помимо особенностей фармакологического действия каждого из этих препаратов, имеющих свою фармакодинамику и свои показания для назначения пациентам, следует отметить, что у препарата ИФН бета-1b есть определенные преимущества, которые определили на него больший спрос. При оценке этих преимуществ исследователи отмечают, в частности, его неспособность, в отличие от ИФН бета-1а, к индукции нейтрализующих антител [Р. Barbero et al. Every-other-day interferon beta-1b versus once-weekly interferon beta-1a for multiple sclerosis (INCOMIN Trial) II: analysis of MRI responses to treatment and correlation with Nab. Mult. Scler., 2006, 12(1): 72-76], меньшую выраженность болевых ощущений и местной реакции на инъекционное введение ИФН бета-1b [К. Baum et al. Comparison of injection site pain and injection site reactions in relapsing-remitting multiple sclerosis patients treated with interferon beta-1a or 1b. Mult. Scler., 2007, 13(9): 1153-1160], а также различия в технологии получения этих препаратов: рекомбинантный ИФН бета-1а получают на клетках яичника китайских хомячков, то есть в эукариотической системе, а рекомбинантный ИФН бета-1b можно получать и в прокариотической системе с использованием штамма-продуцента E.coli [F.P. McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. United States Patent 5,795,779 August 18, 1998; A. Whitty et al. Interferon-beta fusion proteins and uses. United States Patent 6,800,735, October 5, 2004].

Технологии получения и очистки рИФНβ-1b посвящено много патентных исследований, в их числе: US Patent 5,795,779, August 18, 1998 (McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells); US Patent 6,323,006, November 27, 2001 (Peregrino Ferreira et al. Recombinant human beta-CIS interferon); US Patent 4,894,330, January 16, 1990 (Hershenson et al. Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC); US Patent 5,004,605, April 2, 1991 (Hershenson et al. Low pH pharmaceutical compositions of recombinant .beta.-interferon); US Patent 6,923,956, August 2, 2005 (Tschope et al. Liquid interferon-.beta. formulations); RU 2006 123 539 А (Парк Дзи-Соок и др. Способ очистки интерферона бета).

Известен способ получения рекомбинантного интерферона бета-1b (рИФН бета-1b) человека в нерастворимой форме - в виде тел включения (пат. РФ № 2261913, МПК C12N 15/22, опубл. 2005)

По сравнению с растворимой формой экспрессия белка в виде тел включения имеет ряд преимуществ - нерастворимые агрегаты белка не проявляют токсического действия, практически не атакуются протеазами, с высоким выходом выделяются центрифугированием. В то же время существуют проблемы низкого выхода активного корректно сложенного белка после проведения рефолдинга в процессе очистки рИФН бета-1b, что определяется пространственной структурой последнего [М. Karpusas et al. The crystal structure of human interferon b at 2.2-Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. Vol.94. P.1 1813-11818].

Известен способ очистки рИФН бета-1b и использованием детергента додецилсульфат натрия при его получении в нерастворимой форме (Патент США 4,530,787, 1985).

Однако при относительно низкой токсичности этого препарата использование додецилсульфата натрия в технологическом процессе сопряжено с целым рядом препятствий: это соединение вызывает значительную денатурацию целевого белка, его не удается удалить из раствора, что в свою очередь делает невозможной последующую ионообменную хроматографию, необходимую для дальнейшего процесса очистки рИФН бета-1b.

Известен способ очистки рИФН бета-1b, позволяющий избежать указанных недостатков применением в качестве детергента цвиттергента 3-14, который не обладает денатурирующими свойствами, не образует ионных связей, является рН-независимым, может быть удален из раствора, делает возможной ионообменную хроматографию [Russell-Harde D., Knauf M., Croze E. The use of Zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-beta Serl7 (Betaseron). // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol.15(1). - P.31-37].

Известен наиболее близкий к заявленному способ очистки рИФН бета-1b из растворимого состояния с использованием аффинной хроматографии, катионно-обменной хроматографии и диафильтрации (Заявка РФ № 2006123543. «Способ очистки интерферона бета».

Однако в этом способе не учитывается возможность получения названного препарата из тел включения E.coli и не охарактеризованы связанные с этим особенности его очистки.

Изобретение решает задачу оптимизации условий очистки рИФН бета-1b на этапах отмывки и растворения тел включения E.coli, продуцирующей рекомбинантный интерферон бета-1b человека, в ходе технологического процесса рефолдинга целевого белка, а также при окислении последнего.

Заявляемый способ очистки рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli предусматривает следующие основные стадии: (1) отмывка тел включения; (2) растворение тел включения; (3) рефолдинг целевого белка; (4) прехроматографическая подготовка образца; (5) хроматография на Ceramic S; (6) хроматография на Source S30; (7) окисление; (8) гель-фильтрация на Superdex 75 Prep grade; (9) хроматография на Source Q30; (10) гель-фильтрация на Sephacril S200HR; (11) контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим стандартным определением его противовирусной активности.

Отличительными особенностями заявляемого способа являются:

- в ходе отмывки тел включения навеску размороженных тел включения ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14;

- раствор для рефолдинга целевого белка содержит 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% полиэтиленгликоль (PEG) 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% цвиттергента 3-14;

- в ходе предхроматографической подготовки образца используют буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонил-флуорида (PMSF);

- в процессе хроматографии используют буферы: (1) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (2) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (3) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl, 0,05% Цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF;

- для окисления целевого белка используют смесь цистеамин/цистамин в концентрации 1 мМ/0,1 мМ.

Контроль выхода и активности рекомбинантного интерферона бета-1b после очистки показал соответствие следующим критериям: выход 10%, мультимеры по гель-фильтрации <5%, родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии <5%, родственные белки по электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) <5%, белки штамма-продуцента по иммуноферментному анализу (ИФА) <5 нг/мг, эндотоксины по LAL-тесту (тесту с применением "Limulus Amebocite Lisate" - лизата клеток краба-мечехвоста) <5 ЭЕ/мг (эквивалентных единиц на 1 миллиграмм), удельная активность интерферона бета-1b 32 млн МЕ/мг (Международных Единиц на 1 миллиграмм).

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Оптимизация рефолдинга и окисления рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli с использованием цвиттергента 3-14

Целесообразность использования цвиттергента 3-14 в процессе растворения и рефолдинга рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli потребовала оптимизации условий их выполнения. С этой целью были составлены полуэмпирические формулы, и на их основе осуществлен подбор оптимального соотношения ингредиентов в процессе рефолдинга целевого белка и его окисления из предполагаемого интервала значений, как это представлено в таблицах 1-2 и формулах 1-2.

Таблица 1
Определение общего соотношения параметров ингредиентов в процессе рефолдинга рИФН бета-1b
Переменная Описание Верхнее значение Нижнее значение
A pH 7,5 9,0
B Полиэтиленгликоль 3550 0% 0,1%
C Мочевина 0 M
D NaCl 50 мМ 300 мМ
Е Цистеамин/цистамин 1 мМ/0,3 мМ 1 мМ/0,1 мМ
F Цвиттергент 3-14 25%
G Температура 10°C

Формула 1. Общее соотношение параметров ингредиентов с обозначением их взаимозависимости:

Таблица 2
Определение соотношения параметров ингредиентов в процессе окисления ИФН бета-1b
Переменная Описание Верхнее значение Нижнее значение
A pH 7,5 9,0
B Полиэтиленгликоль 3550 0% 0,1%
D NaCl 50 Мм 300 Мм
E Цистеамин/цистамин 1 Мм/0,3 Мм 1 Мм/0,1 Мм

Формула 2. Соотношение изолированной группы параметров с обозначением их взаимозависимости:

В конечном итоге были установлены следующие финальные параметры выполнения рефолдинга и окисления ИФН бета-1b:

- Цвиттергент 3-14: 0,05%;

- Трис-HCl, 10 мМ: рН 7,5;

- Температура: +10°С;

- Nacl: 50 мМ;

- ЭДТА-Na: 1 мМ;

- Цистеамин/цистамин: 1 мМ/0,1 мМ.

Соблюдение этих условий позволяло добиваться 70% выхода целевого белка после осуществления рефолдинга и 10% выхода после полного цикла очистки.

Пример 2. Очистка рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli

Отмывка, растворение и рефолдинг тел включения. В процессе растворения и рефолдинга тел включения использовался буфер А следующего состава: 7 М гуанидин хлорид, 20 мМ дитиотреитол (DTT), 0,5 мМ PMSF.

Навеску размороженных тел включения (500 мг) ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14, суспензию перемешивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре и центрифугировали при ускорении 500g и температуре 4°С 15 минут. Супернатант удаляли и повторяли процедуру центрифугирования. Выход по белку на этой стадии ~50-60%.

250 мг отмытых телец включения ресуспендировали в 2,5 мл буфера А, суспензию инкубировали 2 часа при 60°С. Нерастворившийся материал удаляли центрифугированием с ускорением 12000g при температуре 4°С 10 мин.

Готовили раствор для рефолдинга (указаны конечные концентрации компонентов, конечный объем 50 мл) - 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% PEG 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ ЭДТА, 0,05% цвиттергент 3-14 - и добавляли в него растворенные в буфере А тела включения. Полученный раствор перемешивали и инкубировали при 10°С в течение ночи.

Предхроматографическая подготовка образца. Использовался буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.

Полученный в растворе образец разбавляли буфером Б в 6 раз, выпавший осадок удаляли центрифугированием (14000g, 20 мин, 4°С). В супернатанте доводили pH и проводимость до соответствующих значений буфера Б, после чего его концентрировали до исходного объема на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10) и затем центрифугировали (14000g, 10 мин, 4°С).

Хроматографическая очистка рИФН бета-1b, его окисление и гелъ-филътрация. Для стабильности процесса очистки на данном этапе использовались буферы: Б - 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; В - 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; Г - 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.

Подготовленный образец растворенных тел включения вводили (3 мл/мин) на колонку HyperD Ceramic S (Ciphergen, 10/100 мм, максимальное давление 30 атм), уравновешенную 10 объемами буфера Б. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Проскок в объеме нанесенного образца (50 мл) собирали и связавшиеся примесные вещества удаляли промывкой 3 объемами буфера Г. Колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б).

Порцию образца (10 мл) наносили на колонку Source S30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм, 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера Б, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера Б и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (0-500 мМ, 5 объемов колонки, 3 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 150-200 мМ NaCl. Перед нанесением следующей порции образца колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б). Процедуру повторяли для объединенного проскока с колонки Source S30.

Собранные фракции рИФН бета-1b объединяли и в полученный раствор добавляли цистеамин/цистамин до концентрации 1 мМ/0,1 мМ. Образец инкубировали в течение ночи при 4°С, центрифугировали (12000g, 4°С, 10 мин) и супернатант концентрировали до 1,5 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).

Образец окисленного рИФН бета-1b (1,5 мл) вводили на колонку Superdex 75 Prep grade (16/500 мм, 13000 т.т./м, максимальное давление 5 атм), уравновешенную буфером В Разделение вели в буфере В, на скорости 30 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм (нанометров). Собирали основную фракцию (время удерживания 39,25 мин).

Образец рИФН бета-1b наносили на колонку Source Q30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм (атмосфер), 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера В, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера В и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (50-1000 мМ, 10 объемов колонки, 4 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 200-300 мМ NaCl. Колонку регенерировали промывкой 1 объемом 100 мМ HCl. Собранную фракцию концентрировали до 1 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).

Образец рИФНβ-1b (1 мл) вводили на колонку Sephacryl S200HR (16/600 мм, >5000 т.т./м, максимальное давление 1,5 атм), уравновешенную буфером В. Разделение вели в буфере В на скорости 15 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали основную фракцию (время удерживания 95,3 мин).

Пример 3. Контроль эффективности способа очистки рекомбинантного интерферона β-1b из тел включения E.coli

Эффективность предложенного способа очистки рИФНβ-1b контролировалась в процессе получения 11 партий опытных образцов препарата с последующим определением их противовирусной активности. Протоколы получения даух опытных партий представлены в таблицах 3 и 4.

При получении опытной партии S4/2401 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 500 мг, после отмывки - 230 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 1,88 мг (10%).

В процессе получения опытной партии S4/1301 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 1000 мг, после отмывки - 460 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 3,76 мг (10%).

Оценку биологической (антивирусной) активности 11 образцов рекомбинантного ИНФ бета-1b проводили в диплоидной культуре фибробластов человека М27 (НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН). В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в количестве 100 ЦТД50 (цитотоксическая доза, вызывающая цитотоксический эффект у 50% образцов клеточных культур). За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, при которой наблюдается 50% защита клеток от цитодеструктивного действия, вызванного репликацией тест-вируса. Контролем служил образец препарата «Бетаферон» (Schering AG, USA). Протокол титрования представлен в таблице 5.

Таблица 3
Протокол получения опытной партии S4/2401 рИФН бета-1b
№ п/п Объем, мл Стадия процесса Чистота по ВЭЖХ, % Кол-во по ВЭЖХ, мг Выход стадии по ВЭЖХ, % Общий выход, % LAL, ЕЭ/мг Белки E.coli, нг/мг
1 20 Исходные тела включения - 18,8 - 100% - -
2 9 Отмытые тела включения - 11,1 59% 59% - -
3 211 Солюбилизация в цвиттергенте 3-14 - 5,6 51% 30% - 29472
4 40 Хроматография на Source S30 - 4,0 72% 22% - 1705,1
5 40 Окисление 91% 3,9 96% 21% - 897,63
6 15 Гель-фильтрация на Superdex 75 95,6% 2,4 62% 13% - 1532,6
7 24 Хроматография на Source Q30 95,1% 2,4 97% 12% - 1645,6
8 8 Гель-фильтрация на Sephacril S200HR 97,9% 2,1 88% 11% - 1413,7
9 50 Хроматография на Source C4/G25 - 1,88 71% 10% - -
10 Готовая форма 3 3,4
Таблица 4
Протокол получения опытной партии S4/1301 рИФН бета-1b
№ п/п Объем, мл Стадия процесса Чистота по ВЭЖХ, % Кол-во по ВЭЖХ, мг Выход стадии по ВЭЖХ, % Общий выход, % LAL, ЕЭ/мг Белки E.coli, нг/мг
1 40 Исходные тела включения - 37,6 - 100% - -
2 18 Отмытые тела включения - 22,2 59% 59% - -
3 200 Рефолдинг - 18,2 82% 48% - -
4 200 Обессоливание/ концентрирование - 16,3 90% 43% - 29472
5 20 Хроматография на Source S30 - 11,3 69% 30% - 1705
6 5,5 Окисление/концентрирование 59,8 12,0 107% 32% - 897,6
7 27 Гель-фильтрация на Superdex 75 90,7 8,4 70% 22% - 1533
8 30 Хроматография на Source Q30 87,9 6,7 79% 18% - 1646
9 7,5 Гель-фильтрация на Sephacril S200HR 97,0 4,7 71% 13% - 1414
10 4,5 Хроматография на Source C4/G25 96,5 3,76 68% 10% - -
11 5 Готовая форма 3 3,4
Таблица 5
Результаты титрования образцов рИФHβ-1b
Образцы рИФНр-1b Содержание ИФН В объеме Титр интерферона, Ед/0,2 мл Средняя удельная активность
№1 0,023 мг 0,5 мл 6,4×105
№2 0,023 мг 0,5 мл 7,56×105
№3 0,023 мг 0,5 мл 6,4×105
№4 0,023 мг 0,5 мл 7,56×105
№5 0,023 мг 0,5 мл 8,2×105
№6 0,023 мг 0,5 мл 7,56×105 32×106 МЕ/мг
№9 0,023 мг 0,5 мл 7,56×105
№10 0,023 мг 0,5 мл 7,56×105
№11 0,023 мг 0,5 мл 6,4×105
Контроль (Бетаферон) 0,023 мг 0,5 мл 6,4×105 30×106 МЕ/мг

Как показывают протоколы исследований, предлагаемый оптимизированный способ очистки позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b в полной мере отвечающей требованиям нормативных документов, при этом полученный рИФН бета-1b по удельной противовирусной активности не уступает зарубежному аналогу Бетаферону. В целом предлагаемый способ очистки тел включения E.coli позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b со следующими показателями:

- выход целевого белка: 10%;

- мультимеры по гель-фильтрации: <5%;

- родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии: <5%;

- родственные белки по ДСН-ПААГ: <5%;

- белки штамма-продуцента по ИФА: <5 нг/мг;

- эндотоксины по ЛАЛ-тесту: <5 ЭЕ/мг;

- удельная активность: 32 млн МЕ/мг.

Способ очистки рекомбинантного интерферона β-1b из тел включения E.coli, включающий отмывку тел включения в 10 мл 2%-ного водного раствора цвиттергента 3-14 с последующим удалением нерастворившегося материала центрифугированием с использованием промывочного буферного раствора с pH 7,5, растворение тел включения в буфере, содержащем 7 М гуанидинхлорида, 20 мМ дитиотреитола и 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, рефолдинг целевого белка в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 9,0, 0,2% полиэтиленгликоля 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона, 1 мМ окисленного глутатиона, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,05% Цвиттергента 3-14 с последующими прехроматографической подготовкой образца с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергент 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Ceramic S с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Source S30 с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, окислением смесью цистеамина с цистамином в концентрации 1 мМ/0,1 мМ соответственно, гель-фильтрацией на Superdex 75 Prep grade с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Source Q30 с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида и гель-фильтрацией на Sephacril S200HR с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50
мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, а контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующим стандартным определением его противовирусной активности.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии и вирусологии и предназначено для оценки транскрипционных уровней активности генов интерферонов (ИФ), ИФ-зависимых и пролиферативных цитокинов.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для удаления белков и аминного азота из водных растворов. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области медицины и касается применения пролинспецифичных эндопротеаз для гидролиза пептидов и белков. .

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в качестве биохимического инструмента в коагулометрии и онкологии или для получения фармацевтической композиции для лечении состояний, сопровождающихся гиперактивацией свертывающей системы под действием тромбина и/или гиперпролиферацией.

Изобретение относится к селективному способу получения ингибитора АХЭ периндоприла с использованием в качестве исходного вещества стереоспецифической аминокислоты N-/1-(S)-этоксикарбонилбутил/-(S)-аланина, которая активируется тетраметилурониевыми солями в присутствии третичного органического основания, с последующей реакцией с (2S,3aS,7aS)-октагидроиндоло-2-карбоновой кислотой или ее сложным эфиром и проводимым после завершения реакции удалением защитной группы гидрированием, межфазным гидрированием или экстракцией.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для удаления белков и аминного азота из водных растворов. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области медицины и касается применения пролинспецифичных эндопротеаз для гидролиза пептидов и белков. .

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в качестве биохимического инструмента в коагулометрии и онкологии или для получения фармацевтической композиции для лечении состояний, сопровождающихся гиперактивацией свертывающей системы под действием тромбина и/или гиперпролиферацией.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантного интерферона бета-1b человека

Наверх