Твердые формы анти-egfr антител

Изобретение относится к кристаллическим формам антител против рецептора EGF, в частности Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000), которые в результате обеспечивают получение биологически активного белка антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде. Также изобретение относится к способу получения кристаллических форм анти-EGFR антител. Сущность способа заключается в том, что антитело и/или один из его вариантов и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водном растворе, осаждают с помощью осаждающего реагента. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим, по крайней мере, одну кристаллическую форму Mab C225 (цетуксимаба) или Mab h425 (EMD 72000), и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества и/или дополнительные фармацевтически активные ингредиенты. Фармацевтические композиции с антителами Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000), полученными посредством растворения или суспендирования в водной среде имеют повышенную стабильность к стрессовым условиям, таким как повышенная температура, атмосферная влажность и не содержат токсичных вспомогательных веществ. 6 н. и 4 з.п. ф-лы.

 

Предпосылки изобретения

Изобретение относится к твердым формам антител против рецептора EGF (EGFR), в частности к преципитатам и кристаллам моноклональных антител против рецептора EGF, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) и Mab h425 (EMD 72000), которые приводят к получению биологически активного белка антитела при растворении или суспендировании в водной или неводной среде, получаемых с помощью осаждения антитела и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водной среде при использовании осаждающего реагента. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, включающим, по крайней мере, одну твердую форму упомянутых выше антител в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной, или суспендированной форме, и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества, и/или дополнительные фармацевтические активные ингредиенты, а также к способу получения твердых форм анти- EGFRантител в соответствии с изобретением.

Успехи в области биотехнологии сделали возможным в течение последних 10 лет получение ряда белков для фармацевтического применения с помощью методик рекомбинантной ДНК. Белковые лекарственные средства, такие, как моноклональные антитела, используются, например, в терапии опухолей, например, для специфической иммунотерапии или опухолевой вакцинации. Терапевтические белки являются более крупными и более сложными, чем традиционные органические и неорганические активные ингредиенты, они имеют сложные трехмерные структуры и многочисленные функциональные группы, которые определяют биологическую активность белка или, альтернативно, могут вызывать нежелательные эффекты. В процессе получения, хранения и транспортировки белковые лекарственные средства подвергаются многочисленным экзогенным воздействиям, которые могут оказывать снижающее стабильность действие на белковый активный ингредиент. Таким образом, является необходимым досконально изучить случаи и механизмы специфических реакций разложения для того, чтобы сделать возможной стабилизацию белка, например, посредством прибавления определенных стабилизирующих вспомогательных веществ (смотри, например, Manning M.C., Patel К., и Borchardt R.T. (1989) Стабильность белковых лекарственных средств. Pharm. Res. 6, 903-918).

Литературные источники раскрывают многочисленные композиции терапевтических белков. Однако требования к композициям фармацевтических препаратов белковых активных ингредиентов могут быть весьма различными, и в общем случае не является возможным применять уже имеющиеся белковые композиции для новых белковых активных ингредиентов по причине специфических физико-химических свойств и реакций разложения различных белков. Приемлемые фармацевтические композиции и стабильные формы этих новых активных ингредиентов, таким образом, остаются основной проблемой.

Химическая нестабильность отличается ковалентными модификациями белка. Первичная структура белка изменяется при разрыве, образовании или повторном образовании химических связей. Вновь образованное вещество в общем случае полностью отличается по биологической активности от исходного природного белка. Физическая нестабильность модифицирует пространственное расположение молекулы (вторичная, третичная и четвертичная структура) при отсутствии разрушения ковалентных связей. Эта нестабильность может быть разделена на денатурацию, ассоциацию, агрегацию, осаждение или адсорбцию. Физическая нестабильность представляет собой частое явление, в частности, в случае относительно больших белков. Преципитаты представляют собой макроскопически видимый эквивалент агрегатов и образуются механистическим образом кластерами агрегатов или ассоциатов. При превышении границы растворимости и благодаря осаждению хлопья становятся видимыми, начиная от диаметра приблизительно 10 мкм, с помощью светового микроскопа и, начиная от приблизительно 50 мкм, невооруженным глазом. Агрегация белков может представлять собой обратимый или необратимый процесс (смотри, например, Cleland J.L., Powell M.F. и Shire S.J. (1993) Разработка стабильных белковых композиций: широкий взгляд на агрегацию белков, дезамидирование и окисление. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 10, 307-377).

Хотя существующая литература описывает осаждение белков с солями, полимерами и органическими растворителями в качестве стандартного способа для очистки белков (Scopes R.K. (1997) Разделение с помощью преципитации. В:

Очистка белков: Правила и практика (ред. Scopes R.K.), 2-ое изд., стр. 41-71. Springer Verlag, New York), однако использование этого способа обычно приводит, особенно в случае иммуноглобулинов, к денатурации, ассоциированному с этим снижению активности и незначительному количественному выходу, в частности, при использовании солей и органических растворителей (Phillips A.P., Martin K.L., и Horton W.H. (1984) Выбор способов для очистки иммуноглобулина IgG: Выход, чистота и активность антитела. Journal of Immunological Methods 74, 385-393). При использовании полиэтиленгликоля (ПЭГ), в противовес этому, были достигнуты лучшие результаты (A.Poison, G.M.Potgieter, J.F.Largier, и G.E.F.Joubert, F.J.Mears. Фракционирование белковых смесей при использовании линейных полимеров с высокой молекулярной массой. Biochim. Biophys. Acta 82: 463-475, 1964).

Кристаллы белков являются известными для процессов очистки (технология производства и выделения целевого продукта), предпочтительно ферментов, и для определения третичной структуры белков с помощью рентгеноструктурного анализа (R.К.Scopes. Анализ на чистоту: кристаллизация. В: Очистка белков: правила и практика. Под ред. R.К.Scopes, New York: Springer Verlag, 1997, p. 284-301). При этом происходит образование по-новому упорядоченных внутримолекулярных связей между белками. Это является медленным процессом с пониженной мобильностью. Во время этого процесса понижается концентрация белка в растворе.

Несмотря на то, что литературные источники описывают кристаллизацию белков с солями, полимерами и органическими растворителями в качестве стандартного способа определения структуры иммуноглобулинов (Harris L.J., Skaletsky Е., и McPherson A. (1995) Кристаллизация интактных моноклональных антител. Белки: структура, функция и генетика. 23, 285-289; Harris L.J., Skaletsky Е., и McPherson A. (1998) Кристаллографическая структура интактного IgG1 моноклонального антитела. Journal of Molecular Biology 275, 861-872; Edmundson А.В., Guddat L.W., и Andersen K.N. (1993) Кристаллическая структура интактных IgG антител. ImmunoMethods 3, 197-210), кристаллизация интактных, например, гликозилированных антител, однако является крайне сложной, так как размер белка, различные модели гликозилирования индивидуальных молекул антитела, а также ассоциированная с этим микрогетерогенность и структурная гибкость иммуноглобулина делают упорядоченное встраивание в кристаллическую решетку более сложным или даже препятствуют ему (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Кроме того, молекулы антитела демонстрируют тенденцию к агрегации, что, вероятно, вызывает большие трудности при кристаллизации (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). В дополнение, риск денатурации антител во время процессов кристаллизации делает кристаллизацию терапевтических антител непривлекательной для квалифицированного специалиста в данной области. Таким образом, до настоящего времени только несколько интактных антител были кристаллизованы для изучения структуры, и всего лишь три антитела были до сих пор подвергнуты кристаллизации в препаративных масштабах. Таким образом, иммуноглобулины, приведенные в базе данных кристаллизации биологических макромолекул (Gilliland, G.L., Tung, M., Blakeslee, D.M. и Ladner, J. 1994., База данных кристаллизации биологических макромолекул. Редакция 3.0: Новые характеристики, данные и архив NASA для данных относительно выращивания кристаллов белков. Acta Crystallogr. D50 408-413), которые уже были кристаллизованы, в основном представляют собой Fab и Fc фрагменты.

WO 02072636 описывает кристаллы антитела, которые, однако, были получены при использовании сложного процесса внесения и использования детергентов, которых следует избегать, по мере возможности, в фармацевтических композициях, и вспомогательных веществ, некоторые из которых являются токсикологически неприемлемыми. Кроме того, в описанном процессе нельзя контролировать размер частиц. В контрольном эксперименте (смотри Пример 8) оказалось возможным продемонстрировать факт, что описанные кристаллы игольчатой формы получают как из раствора белка, так и из негативного контроля (при отсутствии белка), используя процесс, описанный в WO 02072636. Из этого факта понятно, что эти кристаллы, по-видимому, в лучшем случае представляют собой белковые включения в кристаллах осаждающего реагента.

По упомянутым выше причинам является понятным, что кристаллизация антител является крайне сложной для специалиста в данной области, и способы кристаллизации, раскрытые в литературе, не могут быть применены ко всем известным антителам по причине значительной гетерогенности различных известных антител в отношении первичной, вторичной и третичной структуры, их гликозилирования и структурной гибкости. Более того, для квалифицированного специалиста в данной области является неприемлемым по указанным выше причинам получать преципитаты терапевтических антител, поскольку, в частности, можно ожидать необратимую денатурацию.

Задача настоящего изобретения, таким образом, заключалась в том, чтобы отыскать стабильные формы, например, преципитатов или кристаллов для терапевтических белков, в частности, антител, так, чтобы их эффективность сохранялась в процессе получения, хранения, транспортировки и применения. Поскольку, как было упомянуто выше, уже существующие композиции белка в общем случае не могут быть использованы для новых белковых активных ингредиентов, дополнительной задачей настоящего изобретения являлось отыскание новых стабильных композиций для моноклональных антител против рецептора EGF, например, Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000). Несмотря на то, что композиции, включающие Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), описываются в WO 03053465 и WO 03/007988, композиции, раскрытые в WO 03053465 имеют, однако, относительно низкую концентрацию белка и не являются стабильными в течение длительного периода хранения при комнатной температуре, а композиции, раскрытые в WO 03007988, также имеют низкую концентрацию белка и препарата (лиофилизата), который должен восстанавливаться перед употреблением. Следовательно, дополнительная задача настоящего изобретения заключалась в отыскании стабильного фармацевтического препарата, который имеет высокую концентрацию упомянутых выше антител.

Процесс лиофилизации для стабилизации композиций белка раскрыт, например, в WO 9300807 и WO 9822136, но существенные недостатки лиофилизированных препаратов заключаются в том, что пользователь должен восстанавливать лиофилизат перед употреблением, что представляет собой значительный источник ошибки при получении его перед применением. Поскольку по сравнению с жидкими композициями прибавляется дополнительный процесс получения, этот процесс является нецелесообразным в отношении осуществления дополнительной работы для проведения процесса (подтверждение стабильности в процессе лиофилизации), приготовления (цены препарата и длительности) и, например, его аттестации.

Задача настоящего изобретения, таким образом, заключалась в отыскании жидких форм и композиций для указанных выше антител, которые имеют повышенную стабильность к стрессовым условиям, таким, как повышенная температура, атмосферная влажность и/или сдвиговые силы, и не содержат никаких токсикологически неприемлемых вспомогательных веществ.

Короткое изложение сути изобретения

Неожиданное было обнаружено, что твердые формы и композиции, приготовленные из них, не имеют недостатков, упомянутых в характеристике уровня техники. Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, описанные ниже, и/или композиции, приготовленные из них, неожиданным образом отличаются одним или более преимуществами, выбранными из: высокой стабильности, контролируемого размера частиц, возможности получения нативного и биологически активного белка после повторного растворения или суспендирования, высокой чистоты, отсутствия фармацевтически неприемлемых агентов и, таким образом, высокой безопасности, хорошей переносимости и возможности непосредственного применения, низкой тенденции к агрегации и, таким образом, возможности получения высококонцентрированных композиций, а также низкой вязкости как композиции, так и белковой суспензии, по сравнению с раствором. Процесс получения в соответствии с изобретением, описанный ниже, неожиданным образом отличается одним или более преимуществами, выбранными из: простоты, сохранения времени и средств, применения фармацевтически приемлемых агентов, высокого выхода. Процесс в соответствии с изобретением может, таким образом, предпочтительно осуществляться с помощью значительно способа, который является более легким, сохраняет время и эффективен в отношении затрачиваемых средств, по сравнению с методами, описанными в литературе, поскольку только прибавление одного осаждающего реагента является необходимым.

В дополнение, осаждающий реагент прибавляется к раствору антитела в приемлемой буферной системе, то есть стабилизация реакционных растворов с помощью дополнительных вспомогательных веществ, таких, как, например, детергенты, не является необходимой. Применения детергентов в препаратах для парентерального введения следовало бы, как правило, избегать или минимизировать, поскольку они имеют значительный токсический и иммуногенный потенциал (Sweetana S. и Akers M.J. (1996) Принципы растворимости и практика для разработки парентеральных дозированных форм лекарственных средств. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330-342), они также могут приводить к изменению во вторичной структуре белков (Vermeer A.W.P. и Norde W. (2000) Влияние связывания сурфактантов с низким молекулярным весом на термальную стабильность и вторичную структуру IgG. Коллоиды и поверхности А: Физико-химический и инженерный аспекты 161, 139-150). Таким образом, полученные твердые формы анти-EGFR антител могут непосредственно использоваться в лекарственных средствах, и дополнительная очистка для удаления фармакологически неприемлемых агентов не является необходимой. В противовес этому, кристаллы, полученные в WO 02072636, должны быть освобождены от фармакологически неприемлемых агентов, например, CHES, имидазола, Трис, хлорида марганца (II), хлорида цинка (II), сульфата меди (II), 2-пропанола, 2-метоил-2,4-пентандиола, HEPES, сульфата лития, этоксиэтанола или детергентов, таких, как полисорбат 80 или 20, при использовании сложного процесса, иногда бывает даже невозможно полностью удалить упомянутые выше неприемлемые агенты.

Неожиданно было обнаружено, что предпочтительно стабильные твердые формы получают в случае, если антитела против рецептора EGF (анти-EGFR антитела), предпочтительно моноклональные анти-EGFR антитела, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), инкубируют при приемлемом значении рН и приемлемой температуре в присутствии приемлемого буфера при использовании определенных осаждающих реагентов, выбранных из полимеров, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), солей, предпочтительно, сульфата аммония, или органических растворителей, предпочтительно этанола, или их смесей.

Неожиданно было обнаружено, что твердые формы анти-EGFR антител, предпочтительно моноклональных анти-EGFR антител, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), и/или их варианты или фрагменты, полученные с помощью процесса в соответствии с изобретением, являются преимущественно нативными после повторного растворения, а также, что их преимущественно получают с высоким выходом.

Изобретение, таким образом, относится к твердым формам анти-EGFR антител и/или их вариантам или фрагментам, которые приводят к получению биологически активного белка антитела при растворении или суспендировании в водной среде, получаемым с помощью осаждения антитела и/или его вариантов и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водной среде с помощью осаждающего реагента, выбранного из полимеров, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), солей, предпочтительно, сульфата аммония, или органических растворителей, предпочтительно этанола, или их смесей, в присутствии приемлемого буфера, при приемлемом значении рН и приемлемой температуре.

Твердые формы анти-EGFR антител:

Выражение «твердые формы анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением» предпочтительно взято для обозначения преципитатов или кристаллов, которые приводят к получению биологически активного антитела посредством растворения или суспендирования в водной или неводной среде.

Твердые формы в соответствии с изобретением получают с помощью осаждения антитела, растворенного или суспендированного в водной среде в соответствии с процессом, описанным ниже. Твердые формы в соответствии с изобретением могут иметь размеры, находящиеся в пределах микрометрового и нанометрового диапазона.

«Преципитаты»: для целей настоящего изобретения термин «преципитаты» взят для обозначения твердых форм в аморфной некристаллической структуре или в состоянии агрегации или ассоциации.

«Кристаллы»: для целей настоящего изобретения термин «кристаллы» взят для обозначения твердых форм в кристаллической структуре. Кристаллические структуры могут быть определены при использовании следующих процессов.

«Осажденный»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной форме, то есть в форме преципитата или кристалла, в зависимости от условий процесса.

«Осажденный кристаллический»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный кристаллический» или «кристаллический» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в упорядоченной кристаллической структуре.

«Осажденный некристаллический»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный некристаллический» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в аморфной некристаллической структуре или в состоянии агрегации и ассоциации.

«Растворенный»: для целей настоящего изобретения термин «растворенный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением, которые являются растворенными или повторно растворенными в растворе в соответствии с изобретением.

«Суспендированный»: термин «суспендированный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением, которые являются суспендированными или повторно суспендированными в растворе в соответствии с изобретением.

Для целей настоящего изобретения термин «водная среда» взят для обозначения воды или смесей воды с приемлемыми инертными растворителями или другими агентами, упомянутыми в Примере 1, такими, как, например, буферы, стабилизаторы или вспомогательные вещества, которые обладают свойством, таким, что водная среда в соответствии с изобретением сама по себе не приводит к осаждению или кристаллизации антитела, а вместо этого осаждение или кристаллизация происходят только при прибавлении осаждающих реагентов в соответствии с изобретением.

Для целей настоящего изобретения термин «неводная среда» взят для обозначения масел или смесей масел с водой или другими приемлемыми инертными растворителями или другими агентами, упомянутыми в Примере 1, такими, как, например, стабилизаторы или вспомогательные вещества, которые обладают свойством, таким, что неводная среда в соответствии с изобретением сама по себе не приводит к осаждению или кристаллизации антитела, а вместо этого осаждение или кристаллизация происходят только при прибавлении осаждающих реагентов в соответствии с изобретением.

В отношении анти-EGFR антител в соответствии с изобретением и для целей настоящего изобретения термины «биологически активный», «нативный» и «эффективный» взяты для обозначения факта, что анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением способны выявлять свой биологический эффект даже после превращения в твердые формы в соответствии с изобретением и последующего повторного растворения или ресуспендирования, в частности, связывание с EGFR, ингибирование связывания лигандов, в частности, EGF, с EGFR, модуляцию, в частности, ингибирование опосредованной EGFR сигнальной трансдукции, и эффект в отношении профилактики или терапии заболеваний, опосредованных EGFR.

В частности, непосредственное получение кристаллов анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, таким образом, не предполагалось, поскольку антитела в основном имеют высокую тенденцию к агрегации, что делает упорядоченное введение в кристаллическую решетку более сложным или даже предотвращает ее образование (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Несмотря на трудности, которые поджидают специалиста в данной области при кристаллизации антител в соответствии с изобретением по причине упомянутой выше негомогенности в отношении белковой структуры, гликозилирования и структурной сегментальной гибкости, которая существует даже в пределах видов антител, неожиданно отличные результаты были достигнуты с помощью процесса в соответствии с изобретением.

Высокая стабильность полученных кристаллов антител в соответствии с изобретением также не характеризуется ни изменением формы частиц, ни диапазоном размеров частиц, который следует рассматривать как критический в отношении иммуногенных побочных эффектов, ни изменениями первичной структуры или вторичной структуры получаемого белка. Способ в соответствии с изобретением, таким образом, обеспечивает преимущество, которое заключается в том, что размер полученных кристаллов является преимущественно контролируемым, при этом преимущественно получают стабильные трехмерные кристаллы. Размер кристаллов может находиться в микрометровом и нанометровом диапазоне.

«Анти-EGFR антитела»: анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением предпочтительно представляют собой моноклональные антитела и такие, которые имеют происхождение от мыши или человека, а также химерные или гуманизированные антитела. Антитело, направленное против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), в частности, представляет собой Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их варианты или фрагменты. Дополнительные антитела против EGFR описаны, например, в ЕР 0586002 и в J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528).

Mab C225 (цетуксимаб. Эрбитукс™): Mab C225 (цетуксимаб) представляет собой клинически одобренное антитело, которое связывается с рецептором EGF. Mab C225 (цетуксимаб) представляет собой химерное антитело, вариабельные участки которого имеют мышиное происхождение, а константные участки - происхождение от человека. Это антитело было впервые описано Naramura и др., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 и в WO 96/40210 Al.

Mab h425 (EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (Mab), полученное из мышиного анти-EGFR антитела 425 (Mab 425) (ЕР 0531472). Мышиное моноклональное антитело Mab 425 было разработано на линии клеток карциномы человека А431, поскольку здесь оно связывается с внеклеточным эпитопом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Было обнаружено, что оно ингибирует связывание EGF (Murthy и др., 1987). Повышенная экспрессия EGFR была обнаружена в злокачественных тканях, полученных из различных источников, и, следовательно, Mab 425 является возможным активным ингредиентом для диагностики и терапевтического лечения опухолей человека. Так, было обнаружено, что Mab 425 опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro и супрессирует опухолевый рост линии клеток эпидермоидных и колоректальных карцином in vitro (Rodeck и др., 1987). В дополнение к этому, было показано, что Mab 425 связывается с ксенотрансплантатами человеческих злокачественных глиом у мышей (Takahashi и др., 1987). Гуманизированные и химерные формы этого антитела были раскрыты, например, в ЕР 0531472; Kettleborough и др.. Белковая инженерия, 1991, 4: 773-783; Bier и др., Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier и др., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46: 167-173. Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманнизированное антитело (h425), которое находится на клинической фазе I/II, его константные участки состоят из κ и человеческой γ-1 цепи (ЕР 0531472).

Человеческое анти-EGFR антитело может быть получено с помощью методики XenoMouse, как описано в WO 9110741, WO 9402602 и WO 9633735. Антитело, которое проходит в настоящее время клинические испытания и было получено в соответствии с этой методикой, представляет собой, например, АВХ-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).

Антитело: антитело или иммуноглобулин используется в самом широком смысле для целей настоящего изобретения и относится, в частности, к поликлональным антителам и мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и, в частности, предпочтительно интактным моноклональным антителам (Mab), которые являются биологически активными, их вариантам и фрагментам. Термин также охватывает гетероантитела, которые состоят из двух или более антител или их фрагментов и/или имеют различные связывающие специфичности и связываются друг с другом. В зависимости от аминокислотной последовательности их константных участков антитела могут относиться к различным классам антител (иммуноглобулинов): IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Этот ряд может быть разделен далее на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Антитела обычно имеют молекулярный вес приблизительно 150 кДа и состоят из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Моноклональные антитела получают из популяции гомогенных клеток. Они являются высоко специфическими и направлены против одного эпитопа, в то время как поликлональные антитела охватывают различные антитела, которые направлены против различных эпитопов. Способы получения моноклональных антител включают, например, гибридомный способ, описанный Kohler и Milstein (Nature 256, 495 (1975)), а также у Burdon и др., (1985) «Технология моноклональных антител, получение и характеристика гибридом грызунов и человека», изд. Лабораторные способы в биохимии и молекулярной биологии, том 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Они могут быть получены, в частности, с помощью известных способов рекомбинантной ДНК (смотри, например, US 4816567). Моноклональные антитела также могут быть изолированы из библиотеки фаговых антител, например, с помощью методик, описанных у Clackson и др. (Nature, 352:624-628 (1991)) и Marks и др. (J.Mol.Biol., 222:58, 1-597(1991)).

Варианты и фрагменты: варианты (мутеины) антител представляют собой структурно родственные белки, например, такие, которые могут быть получены путем модификации первичной последовательности (аминокислотной последовательности), гликоинженерии (варианты сайтов гликозилирования или структур, а также дегликозизилированные белки), с помощью ПЭГилирования, посредством получения в модифицированных хозяйских клетках или с помощью других методик. Варианты в соответствии с изобретением не ограничены приведенными выше примерами, а включают все варианты антител в соответствии с изобретением, которые являются известными специалисту в данной области.

Фрагменты (частичные сегменты) антител представляют собой продукты расщепления полученных антител, например, с помощью ограниченного ферментативного переваривания с помощью папаина, пепсина и плазмина, или путем получения частичных сегментов при использовании генетической инженерии. Типичные частичные сегменты представляют собой, например, бивалентный фрагмент F(ab')2, моновалентный фрагмент Fab и фрагмент Fc (Lottspeich F., H. Zorbas (ред.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) стр.1035). Фрагменты в соответствии с изобретением не ограничиваются приведенными выше примерами, а включают все фрагменты антител в соответствии с изобретением, которые известны специалисту в данной области.

Фармацевтические препараты: термин «фармацевтическая композиция» и «фармацевтический препарат» используются как синонимы для целей настоящего изобретения.

Как используется в данной заявке термин «фармацевтически переносимый» относится к лекарственным средствам, осаждающим реагентам, наполнителям, вспомогательным веществам, стабилизаторам, растворителям и другим агентам, которые способствуют введению фармацевтических препаратов млекопитающему при отсутствии нежелательных побочных эффектов, таких, как, рвота, головокружение, проблемы с перевариванием пищи или тому подобное.

Если фармацевтические препараты предназначены для парентерального введения, то существует требование в отношении изотоничности, эугидрии, переносимости и безопасности композиции (низкая токсичность), используемых вспомогательных веществ и первичной упаковки. Неожиданно было обнаружено, что твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением предпочтительно обладают преимуществом, которое заключается в том, что является возможным непосредственное применение, поскольку используемые осаждающие реагенты представляют собой физиологически переносимые агенты и, таким образом, дополнительные этапы очистки для удаления токсикологически неприемлемых агентов, таких, как, например, высокие концентрации органических растворителей или других токсикологически неприемлемых вспомогательных веществ, не являются необходимыми перед применением твердых форм в соответствии с изобретением в фармацевтических композициях. Получение твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением преимущественно с одновременным высоким выходом нативного и фармацевтически приемлемого белка высокой чистоты является, таким образом, простым, экономящим время и недорогим.

Изобретение, таким образом, также относится к способу получения твердой формы анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, который приводит к получению биологически активного белка антитела, посредством растворения или суспендирования в водной среде, который отличается тем, что антитело и/или его варианты и/или фрагменты, растворенные или суспендированные в водном растворе, осаждают с помощью осаждающего реагента, а продукт осаждения отделяют. Осаждающие реагенты, используемые в способе в соответствии с изобретением, предпочтительно представляют собой полимеры, в частности, предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ), соли, в частности сульфат аммония, или органические растворители, в частности, предпочтительно этанол.

Твердая форма анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением может быть получена путем прибавления реагентов осаждения в соответствии с изобретением, упомянутых в Примере 1, предпочтительно полимеров, таких, как особенно предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ) в концентрации от 0,1 до 99,9% (мас./об.), который имеет средний молекулярный вес 200-80000, предпочтительно от 400 до 20,000, особенно предпочтительно 400-8000; солей, таких, как, в частности, предпочтительно сульфат аммония в концентрации 0,1-4,5 М, тригидрат ацетата натрия в концентрации 0,1-4,5 М, дигидрат цитрата динатрия в концентрации 0,1-1,5 М, фосфат калия в концентрации 0,1-1,2 М, хлорид калия в концентрации от 0,1 до 4,7 М, хлорид натрия в концентрации от 0,1 до 6,1 М, гидрофосфат дикалия в концентрации от 0,1 до 3,0 М, дигидрат гидрофосфата динатрия в концентрации от 0,1 до 0,5 М, или органических растворителей, таких, как, особенно предпочтительно этанол в концентрации 0,1-99,9% (об./об.), или их смесей, а также вспомогательных веществ, буферов и/или стабилизаторов, к раствору, включающему антитела в соответствии с изобретением в периодическом процессе, и инкубации смеси при значениях рН и температурах, упомянутых в Примере 1. С этой целью определенные объемы маточных растворов, включающие осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в Примере 1, в определенной концентрации преимущественно прибавляли к раствору, содержащему определенные концентрации EGFR антител (от 0,01 до 150 мг/мл, предпочтительно от 2 до 100 мг/мл, в частности, предпочтительно приблизительно 5-20 мг/мл), как полученные в своем препарате, и необязательно разводили водой или буфером (например, цитратным или фосфатным буфером, в концентрации от 1 мМ до 200 мМ, предпочтительно от 2 до 20 мМ, особенно предпочтительно приблизительно 10 мМ; также с прибавлением агентов изотоничности, таких, как, например, хлорид калия, хлорид натрия в концентрации 1-1000 мМ, предпочтительно 40 мМ - 310 мМ) до предварительно рассчитанной концентрации. Альтернативно, осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и стабилизаторы в соответствии с изобретением могут также прибавляться в твердой форме. Если антитела сами по себе находятся в твердом агрегатном состоянии, например, в виде лиофилизата, то твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут быть получены путем изначального растворения антител в соответствии с изобретением в воде или водном растворе, включающем один или более дополнительных ингредиентов, и последующего прибавления определенных объемов маточных растворов, включающих осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в Примере 1, в определенной концентрации. Осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы в соответствии с изобретением могут в дополнение также прибавляться в твердом агрегатном состоянии. Антитела в соответствии с изобретением могут предпочтительно непосредственно растворяться в растворе, включающем все осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы.

Изобретение также охватывает все гидраты, соли и производные упомянутых выше агентов, которые являются известными и доступными для специалиста в данной области.

Один или более агентов, упомянутых в изобретении, могут предпочтительно прибавляться во время или после завершения процесса осаждения и могут необязательно удаляться вновь для того, чтобы, например, осуществить дополнительный этап очистки.

Один или более реагентов осаждения, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в изобретении, могут преимущественно прибавляться во время или после завершения процесса получения антитела. Это можно предпочтительно осуществлять путем растворения антитела в соответствии с изобретением непосредственно в водном растворе, включающем один, множество или все дополнительные осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы на заключительном этапе очистки, который осуществляется после его получения. Для получения фармацевтического препарата в соответствии с изобретением соответствующий(ие) дополнительный(ые) ингредиент(ы) потом только должны быть добавлены в соответствующим образом меньших количествах или не будут прибавляться вообще. Является особенно предпочтительным, если соответствующий ингредиент растворен в водном растворе, включающем все дополнительные осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы на заключительном этапе очистки антитела после его получения. Таким образом, предпочтительно может быть получен раствор, который упаковывают или лиофилизуют непосредственно. Полученный раствор, включающий соответствующее антитело, доводят до значения рН от 4 до 10, предпочтительно от 5 до 9, стерильно фильтруют и, если это является необходимым, подвергают сублимационной сушке.

Реакцию осуществляют с помощью способов, известных специалисту в данной области в приемлемом растворителе, в частности, в инертном растворителе. Приемлемые инертные растворители представляют собой этанол, глицерин, смеси с водой или чистую воду, или воду, включающую другие вспомогательные вещества, такие, как, например, соли, оказывающие буферирующее действие или действие, регулирующее изотоничность. Особое предпочтение отдается воде.

Способ, описанный в данной заявке, может, в частности, преимущественно осуществляться в периодическом формате. Твердые анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или их варианты и/или фрагменты, полученные способом в соответствии с изобретением, могут, в частности, предпочтительно превращаться в биологически активный белок антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде. С этой целью антитела и/или один из их вариантов и/или фрагментов, растворенные или суспендированные в водном растворе, в частности, предпочтительно осаждают с помощью осаждающего реагента, упомянутого в Примере 1, и реагент осаждения отделяют.

В зависимости от выбора концентрации осаждающего реагента, получают либо аморфные преципитаты, либо кристаллы. Преципитаты предпочтительно получают при относительно высокой концентрации осаждающего реагента, в то время, как кристаллы предпочтительно получают при относительно низкой концентрации осаждающего реагента. В результате приемлемого выбора концентрации осаждающего реагента, концентрации белка и других агентов в соответствии с изобретением, значения рН и температуры реакции может быть, таким образом, осуществлена в желательном направлении. Примеры 2 и 3 обеспечивают иллюстративные условия кристаллизации для Mab C225 (Эрбитукс™), а Примеры 4 и 5 обеспечивают иллюстративные условия осаждения. Процесс осаждения в соответствии с изобретением и процесс кристаллизации в соответствии с изобретением могут также объединяться.

Приемлемые значения температуры реакции составляют от -10 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С. Используемое давление предпочтительно составляет от 1 до 20 бар, в частности, предпочтительно представляет собой атмосферное давление. Используемое значение рН предпочтительно составляет от 4 до 10. Длительность реакции зависит от выбранных условий. Обычно длительность реакции составляет от 0,5 часа до 10 дней, предпочтительно от 1 до 24 часов, особенно предпочтительно от 2 до 12 часов.

Термин сольваты твердых форм в соответствии с изобретением взят для обозначения аддукции молекул инертного растворителя на твердых формах в соответствии с изобретением, которые образуются благодаря их взаимным силам притяжения. Сольваты представляют собой, например, гидраты, такие, как моногидраты или дигидраты, или алкоголяты, то есть аддитивные соединения со спиртами, такими, как, например, этанол.

Полученные твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут быть отделены от соответствующего раствора, в котором они получены (например, путем центрифугирования и промывания), и после отделения могут быть помещены в различные растворы, они также могут оставаться непосредственно в виде препарата раствора. Полученные твердые формы в соответствии с изобретением могут также быть помещены в желательные растворители для определенного применения. Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением являются преимущественно биологически активными после повторного растворения или повторного суспендирования, и денатурация антител преимущественно не происходит во время процесса в соответствии с изобретением. Биологическая эффективность белка, таким образом, предпочтительно сохраняется.

Неожиданно также было обнаружено, что стабильные фармацевтические композиции могут быть получены с помощью твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением. Эти композиции преимущественно имеют более высокую стабильность к физико-химическим воздействиям, таким, как, например, окисление, механические стрессы, неблагоприятные значения рН и температуры, чем традиционные белковые растворы антител. Сравнимая стабильность иначе обычно достигается только с помощью дорогих длительных способов, таких, как, например, прибавление стабилизаторов, хранение при низкой температуре, замораживание или сублимационная сушка. Высокая стабильность преимущественно способствует более простому и менее дорогому хранению, транспортировке и получению фармацевтически ценных композиций, таких, как, например, композиции, готовые к употреблению, композиции, которые имеют отсроченное высвобождение активного ингредиента или контролированное высвобождение в течение продолжительного периода времени.

Изобретение, таким образом, также относится к твердым формам анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в виде стабильных при хранении лекарственных средств.

Изобретение, в частности, предпочтительно также относится к фармацевтическим препаратам, включающим, по крайней мере, одну твердую форму анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной или суспендированной форме, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества и/или дополнительные фармацевтически активные ингредиенты.

Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением могут, таким образом, включать твердые формы в соответствии с изобретением в осажденной форме, то есть в виде преципитата или кристалла, или в повторно растворенной или ресуспендированной форме. Изобретение, таким образом, также относится к фармацевтическим препаратам, включающим, по крайней мере, один преципитат и/или кристалл анти-EGFR антитела, предпочтительно моноклонального анти-EGFR антитела, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их вариантов и/или фрагментов в осажденной, повторно растворенной или ресуспендированной форме, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества и/или дополнительные фармацевтические активные ингредиенты.

Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением предпочтительно позволяют получать высококонцентрированные композиции при отсутствии неблагоприятной или нежелательной агрегации антител в соответствии с изобретением или нежелательной возникающей высокой вязкости, как можно наблюдать в случае традиционных высококонцентрированных белковых растворов. Таким образом, готовые к употреблению растворы, имеющие высокое содержание активного ингредиента, могут быть повторно растворены или ресуспендированы в водных растворителях или в водной среде с помощью твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением. Крайне высококонцентрированные композиции белковых активных ингредиентов в настоящее время являются весьма необходимыми. Большинство применяемых для терапии антител используется в дозах в диапазоне мг/кг. Высокая доза и небольшие объемы, которые вводятся (например, от приблизительно 1 до 1,5 мл для подкожного введения), предъявляют требование в высококонцентрированных белковых препаратах, которые имеют концентрации, большие, чем 100 мг/мл. В дополнение к этому, высококонцентрированные белковые композиции могут иметь значительные преимущества в предварительных клинических опытах для изучения приемлемости и эффективности in vitro и in vivo (на животных моделях), в клинических опытах по изучению приемлемости и эффективности у людей и при клиническом применении в продукте (в частности, для подкожного введения). Их преимущества состоят, в частности, в относительно небольшом объеме используемого препарата. В противовес инфузии или инъекции белковых лекарственных средств с относительно низкой концентрацией, заявленные препараты позволяют, например, осуществлять подкожное введение белковых лекарственных средств пациенту. Подкожное введение белковых лекарственных средств может иметь различные причины. Например, специфическое нацеливание в связи с «терапевтическим окном» может быть желательным. Кроме того, подкожное введение имеет преимущество, которое заключается в том, что пациент может осуществлять введение самостоятельно, не полагаясь при этом на медицинский персонал. Пример инсулина ясно демонстрирует эти преимущества. Однако поскольку инъекции для подкожного введения могут иметь максимальный объем 1-1,5 мл, высококонцентрированные белковые композиции, содержащие более, чем 100 мг/мл белка, часто являются необходимыми.

Неожиданно было обнаружено, что фармацевтические препараты, которые позволяют достичь концентраций предпочтительно 10-200 мг/мл, особенно предпочтительно 50-150 мг/мл, в жидкой композиции могут быть получены с помощью твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением. Это является неожиданным, поскольку тенденция к нестабильности для высококонцентрированных белковых композиций является намного более высокой, чем для разведенных белковых композиций (Fields, G., Alonso, D., Stiger, D., Dill, K. (1992) «Теория агрегации белков и сополимеров» J. Phys. Chem. 96, 3974-3981). «Плотность упаковки» белковых молекул увеличивается при высокой концентрации белка. В соответствии с этим необходимо предполагать повышенное количество соударений, и в результате могут возникать случайные белковые ассоциации. Этот процесс в общем случае происходит с помощью механизмов образования и роста, при которых критические ядра часто представляют собой растворимые ассоциированные белки, которые, однако, могут быстро превращаться в нерастворимые белковые преципитаты (денатурированный белок) (Reithel, J.F. (1962) «Диссоциация и ассоциация белковых структур». Adv. Protein Chem. 18, 123). Размер белковых агрегатов увеличивается с увеличением концентрации белка, как было показано для β-лактоглобулина (Roefs, S.P.F.M., De Kruif, K.G. (1994) «Модель для денатурации и агрегации β+-лактоглобулина» Eur.J.Biochem. 226, 883-889).

Предел в известных высококонцентрированных композициях иммуноглобулинов обычно составляет 2-50 мг/мл (Humira®) в готовых к употреблению жидких композициях антител.

С помощью твердых форм в соответствии с изобретением, однако, могут быть получены высоко концентрированные стабильные композиции, что является неожиданным. Таким образом, этап осаждения или кристаллизации может давать высококонцентрированные стабильные композиции антитела, которые после ресуспендирования или повторного растворения имеют сниженную вязкость по сравнению с жидкими композициями антитела той же концентрации, и, таким образом упрощает приготовление в случае парентерального введения.

Изобретение, таким образом, также относится к фармацевтическим препаратам, включающим, по крайней мере, одну твердую форму анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или один из его вариантов и/или фрагментов в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной или суспендированной форме, где содержащееся антитело является биологически активным, при этом фармацевтические препараты отличаются тем, что концентрация антитела предпочтительно составляет 10-200 мг/мл, особенно предпочтительно 50-150 мг/мл.

Изобретение также относится к способу получения высококонцентрированного фармацевтического препарата в соответствии с изобретением, отличающегося тем, что, по крайней мере, одна твердая форма анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или один из его вариантов и/или один из его фрагментов является растворенным или ресуспендированным в растворе в соответствии с изобретением, а концентрация антитела предпочтительно составляет 10-200 мг/мл, особенно предпочтительно 50-150 мг/мл.

Водные препараты могут быть получены путем растворения или суспендирования твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в водном растворе и необязательного прибавления вспомогательных веществ. С этой целью определенные объемы маточных растворов, включающих указанные дополнительные вспомогательные вещества в определенных концентрациях, предпочтительно прибавляют к раствору или суспензии, которая имеет определенную концентрацию твердых форм в соответствии с изобретением, а смесь необязательно разводят водой до предварительно рассчитанной концентрации. Альтернативно, вспомогательные вещества могут прибавляться в твердой форме. Количества маточных растворов и/или воды, которые необходимы в каждом случае, последовательно прибавляют к полученному водному раствору или суспензии.

Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут также преимущественно быть растворены или суспендированы непосредственно в растворе, содержащем все дополнительные вспомогательные вещества.

Растворы или суспензии, содержащие антитела и имеющие значение рН от 4 до 10, предпочтительно имеющие значение рН от 5 до 9, и осмоляльность от 250 до 350 мОсмолей/кг, могут предпочтительно быть получены из твердых форм в соответствии с изобретением при восстановлении в водных растворителях. Ресуспендированный или повторно растворенный препарат может, таким образом, вводиться непосредственно без боли внутривенно, внутриартериально, а также подкожно. В дополнение, препарат также может прибавляться к растворам для инфузии, таким, как, например, раствор глюкозы, изотонический физиологический раствор или раствор Рингера, которые также могут содержать активные ингредиенты, что также обеспечивает возможность введения относительно больших количеств активного ингредиента.

Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением могут также включать смеси преципитатов и/или кристаллов в соответствии с изобретением в осажденной или кристаллической и/или повторно растворенной или ресуспендированной форме.

Препараты в соответствии с изобретением являются физиологически хорошо переносимыми, легкими в приготовлении, могут точно отмеряться и являются преимущественно стабильными в отношении количественного анализа, продуктов разложения и агрегатов при хранении и транспортировке, а также во время многократных процессов замораживания и оттаивания. Они могут предпочтительно храниться в стабильном состоянии в течение периода времени, по крайней мере, от трех месяцев до двух лет при температуре холодильника (2-8°С) и при комнатной температуре (23-27°С) и 60%-ной относительной атмосферной влажности (отн. вл.). Неожиданно было обнаружено, что препараты в соответствии с изобретением являются предпочтительно стабильными при хранении в течение, по крайней мере, шести месяцев даже при повышенных температурах и высокой атмосферной влажности, например, при температуре 40°С и 75%-ной относительной атмосферной влажности.

Например, твердые формы в соответствии с изобретением могут храниться в стабильном состоянии при высушивании, и когда необходимо, превращаться в готовый к употреблению препарат при растворении или суспендировании. Возможные способы высушивания представляют собой, например, без ограничения этими примерами, высушивание в газообразном азоте, высушивание в вакуумной печи, лифилизацию, промывание органическими растворителями и последующее высушивание на воздухе, высушивание в жидкостном слое, высушивание в псевдоожиженном слое, высушивание распыливанием, роллерное высушивание, послойную сушку, высушивание на воздухе при комнатной температуре и другие способы.

Термин «эффективное количество» означает количество лекарственного средства или фармацевтически активного ингредиента, которое вызывает медицинский ответ в ткани, системе, животном или человеке, к которому стремятся или который является желательным, например, для исследователя или практикующего врача.

В дополнение, термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое, по сравнению с соответствующим индивидуумом, которому не вводили это количество, имеет следующее последствие: улучшенное лечение, заживление, предотвращение или устранение заболевания, синдрома, болезненного состояния, осложнения, расстройства или предотвращение побочных эффектов или также снижение развития заболевания, осложнения или расстройства. Термин «терапевтически эффективное количество» также охватывает количества, которые являются эффективными для усиления нормальной физиологической функции.

Лекарственные средства могут вводиться в форме единичных доз, которые включают предварительно определенное количество активного ингредиента на единичную дозу. Единица этого типа может включать, например, от 0,5 мг до 1 г, предпочтительно от 1 мг до 800 мг, активного ингредиента в соответствии с изобретением, в зависимости от болезненного состояния, которое подвергается лечению, способа введения и возраста, веса и состояния здоровья пациента. Предпочтительные композиции единичной дозы представляют собой такие, которые включают суточную дозу или поддозу, как указано выше, или ее соответствующую фракцию активного ингредиента. Кроме того, лекарственные средства этого типа могут быть получены с помощью одного из способов, которые хорошо известны в области фармацевтики.

Лекарственные средства могут быть адаптированы для введения любым желательным приемлемым путем, например, с помощью перорального (включая буккальный, или подъязычный), ректального, легочного, назального, местного (включая буккальный, подъязычный или трансдермальный), вагинального или парентерального (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный или внутрикожный) путей введения. Лекарственные средства этого типа могут быть получены с помощью всех способов, известных в области фармацевтики, путем, например, сочетания активного ингредиента с наполнителем(ями) или вспомогательным(и) веществом(ами).

Парентеральное введение является преимущественно приемлемым для введения лекарственных средств в соответствии с изобретением. В случае парентерального введения, внутривенное или подкожное введения являются особенно предпочтительными. В случае внутривенного введения инъекцию осуществляют непосредственно или также в виде добавки к растворам для инфузии.

Лекарственные средства для подкожного введения являются особенно приемлемыми, поскольку стабильные, высококонцентрированные композиции могут быть получены с помощью твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением. Высококонцентрированные композиции, необходимые для парентерального или подкожного введения, и вводимые небольшие объемы могут быть достигнуты таким образом.

Подкожное введение имеет преимущество, которое заключается в том, что пациент может вводить лекарственное средство самостоятельно без квалифицированной медицинской помощи. Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением являются также приемлемыми для получения вводимых парентерально лекарственных средств, которые содержат активный ингредиент для медленного, отсроченного и/или контролируемого высвобождения. Преципитаты и/или кристаллы в соответствии с изобретением находятся предпочтительно в форме суспензии и растворяются в течение длительного и/или контролируемого периода времени и после этого пребывают в нативном и эффективном состоянии. Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением являются также приемлемыми для получения композиций отсроченного высвобождения, которые обеспечивают преимущества для пациента, поскольку является необходимым только введение при относительно больших временных интервалах. Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением могут также быть введены непосредственно в опухоль и, таким образом, развивают свое действие непосредственно в намеченном сайте.

Лекарственные средства, адаптированные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, содержащие антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и жидкую фазу, с помощью которых композиция приобретает изотоничность, аналогичную таковой крови реципиента, которого подвергают лечению; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспензионную среду и загустители. Композиции могут поставляться в контейнерах для одной дозы, многодозовых контейнерах, например, как запечатанные ампулы и флаконы, и храниться в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, так, что является необходимым только прибавление стерильной жидкости носителя, например, воды для инъекционных целей, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии, полученные в соответствии с композицией, могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток.

Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, необязательно в повторно растворенной форме, могут также вводиться в форме систем, которые обеспечивают доставку с помощью липосом, таких, как, например, небольшие однослойные носители, большие однослойные носители или многослойные носители. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких, как, например, холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.

Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением их варианты в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме могут также сливаться с растворимыми полимерами как нацеленными лекарственными наполнителями. Такие полимеры могут охватывать поливинилпирролидон, пирановый сополимер, полигидроксипропилметакриламидофенол, полигидроксиэтиласпартамидофенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный радикалами пальмитоила. Твердые формы анти-EGFR антител могут также быть слитыми с классом биоразлагаемых полимеров, которые являются приемлемыми для достижения медленного высвобождения лекарственного средства, например, полимолочной кислотой, поли-эпсилон-капролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэстерами, полиацеталями, полигидроксипиранами, полицианоакрилатами, полимолочной-согликолевой кислотой, полимерами, такими, как конъюгаты декстрана и метакрилатов, полифосфоэстерами, различными полисахаридами и полиаминами и поли-эпсилон-капролактоном, альбумином, хитозаном, коллагеном или модифицированным желатином и поперечно связанными или амфипатическими блок-сополимерами или гидрогелями.

Лекарственные средства, адаптированные для трансдермального введения, могут доставляться как независимые пластыри для продолжительного, тесного контакта с эпидермисом реципиента. Таким образом, например, активный ингредиент может поступать из пластыря с помощью ионофореза, как описано в общих чертах в Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986).

Лекарственные средства, адаптированные для местного введения, могут быть рецептированы в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, аэрозолей или масел.

Для лечения глаз или другой наружной ткани, например, рта или кожи, композиции предпочтительно вводятся в виде местной мази или крема. В случае пребывания композиции в виде мази, активный ингредиент может использоваться либо с парафиновой, либо со смешиваемой с водой основой крема. Альтернативно, активный ингредиент может быть рецептирован с получением крема на кремовой основе масло-в-воде или вода-в-масле.

Лекарственные средства, адаптированные для местного введения для глаз, включают глазные капли, в которых активный ингредиент растворен или суспендирован в приемлемом наполнителе, в частности, в водном растворителе.

Лекарственные средства, адаптированные для ректального введения, могут доставляться в форме суппозиториев или клизм.

Лекарственные средства, адаптированные для введения путем ингаляции, охватывают порошки или аэрозоли, содержащие мелкие частицы, которые могут быть получены при использовании различных типов раздаточных механизмов под давлением, включающих аэрозоли, распылители или инсуффляторы. Для целей настоящего изобретения особое предпочтение отдается порошкам твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением для введения в виде формы для ингаляций.

Лекарственные средства, адаптированные для вагинального введения, могут доставляться в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или композиций для распыления.

Само собой разумеется, что кроме составляющих, в частности, упомянутых выше, лекарственные средства в соответствии с изобретением могут также включать другие агенты, которые обычно используются в этой области в отношении частного типа фармацевтической композиции.

Изобретение также относится к наборам (комплектам), которые состоят из отдельных пакетов

a) эффективного количества преципитата и/или кристалла анти-EGFR антитела, предпочтительно моноклонального анти-EGFR антитела, в частности, предпочтительно Mab C225 (цетуксимаба) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их вариантов или фрагментов в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме, и

b) эффективного количества дополнительного лекарственного активного ингредиента.

Набор включает приемлемые контейнеры, такие, как коробки или картонные упаковки, индивидуальные бутылочки, пакеты или ампулы. Набор может, например, содержать отдельные ампулы, каждая из которых содержит эффективное количество твердой формы в соответствии с изобретением, необязательно в повторно растворенной форме, и эффективное количество дополнительного лекарственного активного ингредиента в растворенной или лиофилизированной форме.

Терапевтически эффективное количество твердой формы анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением зависит от ряда факторов, в том числе, например, от возраста и веса, от определенного болезненного состояния, требующего лечения, от его тяжести, природы композиции и способа введения, и в конечном счете, определяется лечащим врачом или ветеринаром. Однако эффективное количество анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением для лечения неопластического роста, например, рака кишечника или молочной железы, обычно находится в пределах от 0,1 до 100 мг/кг веса тела реципиента (млекопитающего) в сутки и, в частности, типично в интервале от 1 до 10 мг/кг веса тела в сутки. Таким образом, фактическое количество в сутки для взрослого млекопитающего весом 70 кг будет находиться обычно в пределах от 70 до 700 мг, где это количество может вводиться в виде одной дозы в сутки или обычно в виде ряда поддоз (таких, как, например, две, три, четыре, пять или шесть) в сутки, так, чтобы общая суточная доза была такой же. Приемлемый титр антитела определяется с помощью способов, известных специалисту в данной области. Дозы, предлагаемые для введения, в общем случае являются достаточными для достижения желаемого действия в отношении ингибирования опухоли. Однако при этом доза должна также быть выбрана, чтобы она была настолько низкой, насколько это возможно, чтобы не возникало никаких побочных эффектов, таких, как нежелательные перекрестные реакции, анафилактические реакции или тому подобное.

Изобретение также относится к применению твердых форм в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства, которое включает биологически активное антитело и/или один из его вариантов и/или один из его фрагментов в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной или суспендированной форме.

Лекарственные средства в соответствии с изобретением могут использоваться, в частности, для профилактики и/или лечения заболеваний и болезненных состояний. Изобретение, таким образом, относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, предпочтительно моноклональных анти-EGFR антител, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаба) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их вариантов или фрагментов в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний.

Было продемонстрировано в различных исследованиях in vitro и in vivo, что блокирование EGFR с помощью антител против опухолей может происходить на различных уровнях, например, путем ингибирования раковых клеток, снижения опосредованного опухолью ангиогенеза, индукции апоптоза раковых клеток и повышения токсических эффектов радиационной терапии и традиционной химиотерапии.

Лекарственные средства, содержащие твердые формы антител в соответствии с изобретением в повторно растворенной или суспендированной форме являются способными эффективно регулировать, модулировать или ингибировать EGFR и могут, таким образом, использоваться для предотвращения и/или лечения заболеваний в связи с нерегулируемой или нарушенной активностью EGFR. В частности, твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут, таким образом, использоваться для лечения определенных форм рака и при заболеваниях, вызванных патологическим ангиогенезом, таких, как диабетическая ретинопатия или воспаление.

Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, вызванных, опосредованных и/или распространяемых EGFR и/или с помощью сигнальной трансдукции, опосредованной EGFR.

Лекарственные средства в соответствии с изобретением являются особенно приемлемыми для лечения и/или профилактики рака, в том числе солидных карцином, таких, как, например, карциномы (например, легких, поджелудочной железы, щитовидной железы, мочевого пузыря или кишечника), миелоидных заболеваний (например, миелоидной лейкемии) или аденомы (например, ворсинчатой аденомы ободочной кишки), патологического ангиогенеза и метастатической миграции клеток. Лекарственные средства также являются полезными при лечении хронических воспалений, зависимых от активации комплемента (Niculescu и др. (2002) Immunol. Res., 24:191-199) и иммунодефицита, индуцированного ВИЧ-1 (вирусом иммунодефицита человека типа 1) (Popik и др. (1998) J Virol, 72: 6406-6413).

В дополнение, лекарственные средства в соответствии с изобретением являются приемлемыми в качестве фармацевтических активных ингредиентов для млекопитающих, в частности, для людей, при лечении заболеваний, индуцированных EGFR. Термин «заболевания, индуцированные EGFR» относится к патологическим состояниям, которые зависят от активности EGFR. EGFR является непосредственно или опосредованно вовлеченным в пути сигнальной трансдукции различных активностей клеток, в том числе в пролиферацию, адгезию и миграцию, а также в дифференциацию. Заболевания, ассоциированные с активностью EGFR, включают пролиферацию опухолевых клеток, патологическую неоваскуляризацию, которые способствуют росту солидных опухолей, неоваскуляризации в глазу (диабетическая ретинопатия, старческая дегенерация желтого пятна и тому подобное) и воспаление (псориаз, ревматоидный артрит и тому подобное).

Заболевания, обсуждаемые в данной заявке, обычно подразделяют на две группы, гиперпролиферативные и негиперпролиферативные заболевания. В этой связи псориаз, артрит, воспаление, эндометриоз, рубцевание, дорброкачественная гиперплазия предстательной железы, иммунологические заболевания, аутоиммунные заболевания рассматриваются как нераковые заболевания, где артрит, воспаление, иммунологические заболевания, аутоиммунные заболевания и иммунодефицитные состояния обычно рассматриваются как негиперпролиферативные заболевания.

В этой связи рак мозга, рак легких, карцинома чешуйчатых клеток, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени, рак почки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головы, рак шеи, рак пищевода, гинекологический рак, рак щитовидной железы, лимфома, хроническая лейкемия и острая лейкемия рассматриваются как раковые заболевания, все из которых обычно причисляются к группе гиперпролиферативных заболеваний. В частности, рост раковых клеток и особенно рост раковых клеток, опосредованный прямо или косвенно EGFR, представляет собой заболевание, которое представляет цель настоящего изобретения.

Можно показать, что лекарственные средства в соответствии с изобретением имеют in vivo антипролиферативное действие в ксенотрансплантатных модельных опухолях. Лекарственные средства в соответствии с изобретением вводятся пациенту с гиперпролиферативным заболеванием, например, для ингибирования опухолевого роста, для снижения воспаления, ассоциированного с лимфопролиферативным заболеванием, для ингибирования отторжения трансплантата или при неврологическом повреждении вследствие заживления ткани, и т.д. Лекарственные средства в соответствии с настоящим изобретением являются полезными для профилактических и терапевтических целей. Как используется в данной заявке, термин «лечение» используется в качестве ссылки как на предотвращение заболеваний, так и для лечения существующих осложнений. Предотвращение пролиферации достигается путем введения лекарственных средств в соответствии с изобретением перед развитием выраженного заболевания, например, для предотвращения опухолевого роста, предотвращения метастатического роста, снижения рестеноза, ассоциированного с сердечно-сосудистой хирургией, и т.д. Альтернативно, эти лекарственные средства используются для лечения продолжающихся заболеваний путем стабилизации или улучшения клинических симптомов пациента.

Хозяин или пациент могут принадлежать к любому виду млекопитающих, например, к виду приматов, в частности, человеку; грызунам, в том числе мыши, крысам и хомякам; кроликам, лошадям, коровам, собакам, котам и т. п. Животные модели представляют интерес для экспериментальных исследований, обеспечивая модель для лечения заболеваний человека.

Чувствительность определенной клетки к лечению с помощью лекарственных средств в соответствии с изобретением может быть определена в анализах in vitro. Типично, культуру клеток инкубируют с лекарственным средством в соответствии с изобретением при различных концентрациях в течение периода времени, который является достаточным для того, чтобы позволить активным ингредиентам индуцировать смерть клеток или ингибировать миграцию, обычно он составляет от приблизительно одного часа до одной недели. Анализы in vitro могут осуществляться при использовании культивированных клеток из образца биопсии. Живые клетки, оставшиеся после обработки, потом подсчитывают.

Доза варьирует в зависимости от используемых специфических лекарственных средств, специфического заболевания, состояния пациента, и т.п. Обычно терапевтическая доза является достаточной для того, чтобы значительно уменьшить нежелательную популяцию клеток в целевой ткани, в то время как жизнеспособность пациента поддерживается. Лечение в общем случае продолжают до тех пор, пока не возникает существенное снижение, например, снижение, по крайней мере, приблизительно на 50% числа специфических клеток. Лечение можно продолжать до тех пор, пока существенно не будет выявляться никаких нежелательных клеток в организме.

Различные аналитические системы являются доступными для идентификации ингибиторов EGFR. В сцинтилляционном анализе близости (Sorg и др., J. of Biomolecular Screening, 2002, 7, 11-19) и способе электролитического покрытия радиоактивное фосфорилирование белка или пептида в качестве субстрата измеряют при использовании γ-АТФ. В присутствии ингибиторного соединения можно определить пониженный радиоактивный сигнал или не определить его вообще. Кроме того, методики гомогенного переноса резонансной энергии флуоресценции с временным разрешением (HTR-FRET) и флуоресцентной поляризации (FP) являются полезными в качестве аналитических способов (Sills и др., J. of Biomolecular Screening, 2002, 191-214).

Другие нерадиоактивные методы анализа ELISA используют специфические фосфо-антитела (фосфо-АТ). Фосфо-АТ только связывают фосфорилированный субстрат. Это связывание может определяться с помощью второго конъюгированного с пероксидазой анти-баранього антитела при использовании хемолюминисценции (Ross и др., 2002, Biochem. J., в печати, рукопись BJ 20020786).

Существует множество болезненных состояний, ассоциированных с нерегулируемой клеточной пролиферацией и смертью клеток (апоптоз). Заболевания и болезненные состояния, которые могут подвергаться лечению, предотвращаться или облегчаться с помощью лекарственных средств в соответствии с изобретением, включают заболевания и болезненные состояния, приведенные ниже, но не ограничиваются ими. Лекарственные средства в соответствии с изобретением являются полезными при лечении и/или профилактике ряда различных заболеваний и болезненных состояний, которые вовлекают пролиферацию и/или миграцию клеток гладкой мускулатуры и/или воспалительных клеток в интимальном слое сосуда, что приводит к ограниченному потоку крови через этот сосуд, например, к неоинтимальным окклюзивным повреждениям. Представляющие интерес окклюзивные заболевания трансплантантных сосудов включают атеросклероз, коронарное васкулярное заболевание после трансплантации, стеноз трансплантантов вен, перианастомотический рестеноз протеза, рестеноз после пересадки сосудов или замена стента и тому подобное.

Настоящее изобретение относится к применению лекарственных средств в соответствии с изобретением для лечения или предотвращения рака. Изобретение, таким образом, особенно предпочтительно относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики опухолей и/или опухолевых метастазов, где опухоль особенно предпочтительно является выбранной из группы, которая состоит из опухоли мозга, опухоли мочеполового тракта, опухоли лимфатической системы, опухоли желудка, опухоли гортани, моноцитарной лейкемии, аденокарциномы легких, мелкоклеточной карциномы легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы и карциномы молочной железы, не ограничиваясь, однако этими опухолями.

Изобретение также относится к применению лекарственных средств в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, выбранных из группы, которая состоит из карциномы чешуйчатых клеток, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака печени, рака почки, колоректального рака, рака молочной железы, рака головы, рака шеи, рака пищевода, гинекологического рака, рака щитовидной железы, лимфомы, хронической лейкемии и острой лейкемии.

Лекарственные средства в соответствии с изобретением могут вводиться пациентам для лечения рака. Настоящие лекарственные средства ингибируют опухолевый ангиогенез и, таким образом, оказывают влияние на рост опухолей (J.Rak и др. Cancer Research, 55: 4575-4580, 1995). Ингибирующие ангиогенез свойства лекарственных средств в соответствии с изобретением являются также приемлемыми для лечения определенных форм слепоты, ассоциированной с ретинальной неоваскуляризацией.

Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, вызванных, опосредованных или распространяемых с помощью ангиогенеза.

Заболевания этого типа, вовлекающие ангиогенез, представляют собой глазные заболевания, такие, как, ретинальная васкуляризация, диабетическая ретинопатия, старческая дегенерация желтого пятна и тому подобное.

Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, выбранных из группы, состоящей из ретинальной васкуляризации, диабетической ретинопатии, старческой дегенерации желтого пятна и/или воспалительных заболеваний.

Изобретение также относится к применению лекарственных средств в соответствии с изобретением для лечения и/или профилактики заболеваний выбранных из группы, которая состоит из псориаза, ревматоидного артрита, контактного дерматита, реакции гиперчувствительности замедленного типа, воспаления, эндометриоза, рубцевания, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, иммунологических заболеваний и иммунодефицитных заболеваний.

Изобретение также относится к применению лекарственных средств в соответствии с изобретением для лечения и/или профилактики патологий костей, выбранных из группы, состоящей из остеосаркомы, остеоартрита и рахита.

Лекарственные средства в соответствии с изобретением могут также использоваться для обеспечения аддитивного или синергетического эффекта в известных существующих раковых химиотерапиях и способах с использованием облучения, и/или могут использоваться для восстановления эффективности известных существующих способов раковой химиотерапии и способов с использованием облучения.

Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, при которых терапевтически эффективное количество твердой формы в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме вводится в комбинации с соединением, выбранным из группы, состоящей из 1) модулятора рецептора эстрогена, 2) модулятора рецептора андрогена, 3) модулятора ретиноидного рецептора, 4) цитотоксического агента, 5) антипролиферативного агента, 6) ингибиторов пренилпротеинтрансферазы, 7) ингибиторов HMG-CoA редуктазы, 8) ингибиторов протеазы ВИЧ, 9) ингибиторов обратной транскриптазы, 10) ингибиторов рецептора фактора роста и 11) ингибиторов ангиогенеза.

Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, при которых терапевтически эффективное количество твердой формы в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме вводится в комбинации с радиотерапией и соединением, выбранным из группы, состоящей 1) модулятора рецептора эстрогена, 2) модулятора рецептора андрогена, 3) модулятора ретиноидного рецептора, 4) цитотоксического агента, 5) антипролиферативного агента, 6) ингибиторов пренилпротеинтрансферазы, 7) ингибиторов HMG-CoA редуктазы, 8) ингибиторов протеазы ВИЧ, 9) ингибиторов обратной транскриптазы, 10) ингибиторов рецептора фактора роста и 11) ингибиторов ангиогенеза.

Лекарственные средства в соответствии с изобретением могут, таким образом, также вводиться вместе со всеми хорошо известными терапевтическими агентами, которые выбирают в соответствии с их особой полезностью в отношении состояния, которое подвергают лечению. Например, в случае состояний, связанный с костной системой, комбинации, которые будут полезными, включают такие с антирезорбтивными бисфосфонатами, такими, как алендронат и ризедронат; блокаторами интегрина (как определено ниже), такими, как ανβ3 антагонисты; конъюгированными эстрогенами, используемыми в гормон-заместительной терапии, такими, как Премпро®, Премарин® и Эндометрион®; селективными модуляторами рецептора эстрогена (SERM), такими, как ралоксифен, дролоксифен, СР-336,156 (Пфайзер) и лазофоксифен; ингибиторами катепсина К и ингибиторами АТФ протонного насоса.

Настоящие лекарственные средства также являются приемлемыми для комбинации с известными противораковыми агентами. Такие известные противораковые агенты включают следующие: модулятор рецептора эстрогена, модулятор рецептора андрогена, модулятор ретиноидного рецептора, цитотоксический агент, антипролиферативные агенты, ингибиторы пренилпротеинтрансферазы, ингибиторы HMG-CoA редуктазы, ингибиторы протеазы ВИЧ, ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы рецептора фактора роста и ингибиторы ангиогенеза. Данные соединения являются особенно приемлемыми для введения одновременно с осуществлением радиотерапии.

«Модуляторы рецептора эстрогена» относятся к соединениям, которые взаимодействуют с рецептором или ингибируют связывание эстрогена с рецептором независимо от механизма. Примеры модуляторов рецептора эстрогена включают, но не ограничены таковыми, тамоксифен, ралоксифен, идоксифен, LY353381, LY 117081, торемиксен, фулвестрант, 4-[7-(2,2-диметил-1-оксопропокси-4-метил-2-[4-[2-(1-пиперидинил)этокси]фенил]-2Н-1-бензопиран-3-ил]фенил-2,2-диметилпропаноат, 4,4'-дигидроксибензофенон-2,4-динитрофенилгидразон и SH646.

«Модуляторы рецепторов андрогена» относится к соединениям, которые взаимодействуют с рецептором или ингибируют связывание андрогенов с рецептором, независимо от механизма. Примеры модуляторов рецептора андрогена включают финастерид и другие ингибиторы 5α-редуктазы, нилутамид, флутамид, бикалутамид, лиарозол и ацетат абиратерона.

«Модуляторы ретиноидного рецептора» относится к соединениям, которые взаимодействуют с рецептором или ингибируют связывание ретиноидов с рецептором, независимо от механизма. Примеры модуляторов рецептора андрогена включают бексаротен, третиноин, 13-цис-ретиноевую кислоту, 9-цис-ретиноевую кислоту α-дифторметилорнитин, ILX23-7553, транс-N-(4'-гидроксифенил)ретинамид и N-4-карбоксифенилретинамид.

«Цитотоксические агенты» относится к соединениям, которые приводят к смерти клеток в основном путем непосредственного воздействия на клеточную функцию или ингибируют, или вмешиваются в мейоз клеток, и включают алкилирующие агенты, факторы некроза опухоли, интеркалирующие агенты, ингибиторы микротубулина и ингибиторы топоизомеразы. Примеры цитотоксических агентов включают, но не ограничиваются таковыми, тирапазимин, сертенеф, кахектин, ифосфамид, тазонермин, лонидамин, карбоплатин, алтретамин, преднимустин, дибромодульцитол, ранимустин, фотемустин, недаплатин, оксалиплатин, темозоломид, гептаплатин, эстрамустин, импросульфан тозилат, трофосфамид, нимустин, хлорид диброспидия, пумитепа, лобаплатин, сатраплатин, профиромицин, цисплатин, ирофульвен, дексифосфамид, цис-аминдихлор-(2-метилпиридин)платина, бензилгуанин, глюфосфамид, GPX100, (транс,транс,транс)-бис-му-(гексан-1,6-диамин)-му-[диамин-платина(II)]бис[диамин(хлор)платина(II)] тетрахлорид, диаризинил-спермин, триоксид мышьяка, 1-(11-додециламино-10-гидроксиундецил)-3,7-диметилксантин, зорубицин, идарубицин, даунорубицин, бисантрен, митоксантрон, пирарубицин, пинафид, вальрубицин, амрубицин, антинеопластон, 3'-дезамино-3'-морфолино-13-дезоксо-10-гидроксикарминомицин, аннамицин, галарубицин, элинафид, MEN 10755 и 4-деметокси-3-дезамино-3-азиридинил-4-метилсульфонилдаунорубицин (смотри WO 00/50032). Примеры ингибиторов микротубулина включают паклитаксел, сульфат виндезина, 3'4'-дидегидро-4'-дезокси-8'-норвинкалеукобластин, доцетаксол, ризоксин, доластатин, мивобулин изетионат, ауристатин, цемадотин, RPR109881, BMS184476, винфлунин, криптофицин, 2,3,4,5,6-пентафтор-N-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамид, ангидровинбластин, N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-L-пролин-т-бутиламид, TDX258 и BMS188797.

Некоторые примеры ингибиторов топоизомеразы представляют собой топотекан, гикаптамин, иринотекан, рубитекан, 6-этоксипропионил-3',4'-O-эксобензилиденчартреузин, 9-метокси-N,N-диметил-5-нитропиразол[3,4,5-кл]акридин-2-(6Н)пропанамин, 1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':b,7]индолизино[1,2b]хинолин-10,13(9Н,15Н)-дион, луртотекан, 7-[2-(N-изопропиламино)этил]-(20S)камптотецин, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, фосфат этопозида, тенипозид, собузоксан, 2'-диметиламино-2'-дезоксиэтопозид, GL331, N-[2-(диметиламино)этил]-9-гидрокси-5,6-диметил-6Н-пиридо[4,3-b]карбазол-1-карбоксамид, азулакрин, (5а,5аВ,8аа,9b)-9-[2-[N-[2-(диметиламино)этил]-N-метиламино]этил]-5-[4-гидрокси-3,5-диметоксифенил]-5,5а,6,8,8а,9-гексогидрофуро(3',4':6,7)нафто(2,3-d)-1,3-диоксол-6-он, 2,3-(метилендиокси)-5-метил-7-гидрокси-8-метоксибензо[с]фенантридиний, 6,9-биc[(2-aминoэтил)aминo]бeнзo[g]изoxинoлин-5,10-диoн, 5-(3-аминопропиламино)-7,10-дигидрокси-2-(2-гидроксиэтиламинометил)-6Н-пиразол[4,5,1-де]акридин-6-он, N-[1-[2-(диэтиламино)этиламино]-7-метокси-9-оксо-9Н-тиоксантен-4-илметил]формамид, N-(2-(димeтилaминo)этил)aкpидин-4-карбоксамид, 6-[[2-(диметиламино)этил]амино]-3-гидрокси-7Н-индено[2,1-с]хинолин-7-он и димесна.

«Антипролиферативные агенты» включают антисмысловые РНК и ДНК олигонуклеотиды, такие, как G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 и INX3001, а также антиметаболиты, такие, как эноцитабин, кармофур, тегафур, пентостатин, доксифлуридин, триметрексат, флударабин, капецитабин, галоцитабин, цитарабин, оксфосфат, гидрат фостеабина натрия, ралтитрексед, палтитрексед, эмитефур, тиазофурин, децитабин, нолатрексед, пеметрексед, нелзарабин, 2'-дезокси-2'-метилиденецитидин, 2'-фторметилен-2'-дезоксицитидин, N-[5-(2,3-дигидробензофурил)сульфонил]-N'-(3,4-дихлорфенил)мочевина, N6-[4-дезокси-4-[N2-[2(E),4(E)-тeтpaдeкaдиeнoил]глицилaминo]-L-глицepo-B-L-манногептопиранозил]аденин, аплидин, эктейнасцидин, троксацитабин, 4-[2-амино-4-оксо-4,6,7,8-тетрагидро-3Н-пиримидино[5,4-b]-1,4-тиазин-6-ил-(S)-этил]-2,5-тиеноил-L-глютаминовая кислота, аминоптерин, 5-фторурацил, аланозин, эстер 11-ацетил-8-(карбамоилоксиметил)-4-формил-6-метокси-14-окса-1,11-диазатетроцикло(7.4,1,0,0)тетрадека-2,4,6-триен-9-илуксусной кислоты, свайнозонин, лометрексол, декразоксан, метиониназа, 2'-циано-2'-дезокси-N4-пальмитоил-1-В-D-арабинофуранозилцитозин и 3-аминопиридин-2-карбоксальдегид тиосемикарбазон. «Антипролиферативные агенты» также включают моноклональные антитела против факторов роста, отличных от тех, что приведены выше под наименованием «ингибиторы ангиогенеза», такие, как трастузумаб, и гены супрессии опухоли, такие, как р53, которые могут доставляться с помощью опосредованного вирусом переноса генов (смотри, например, патент США №6069134). Лекарственные средства в соответствии с изобретением могут также вводиться в комбинации со всеми другими терапевтическими антителами, известными специалисту в данной области, или с фармацевтическими активными ингредиентами, которые являются приемлемыми в связи с упомянутыми выше заболеваниями.

Кроме того, твердые формы в соответствии с изобретением антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме могут использоваться для изоляции и исследования активности или экспрессии EGFR. В дополнение, они являются, в частности, приемлемыми для использования в диагностических методах для заболеваний в связи с нерегулируемой или нарушенной регуляцией активности EGFR. Изобретение, таким образом, также относится к применению твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме в качестве активаторов или ингибиторов EGFR, особенно предпочтительно в качестве ингибиторов EGFR.

Для диагностических целей антитела в соответствии с изобретением могут быть, например, радиоактивно меченными. Предпочтительный способ мечения представляет собой йодогенный способ (Fraker и др., 1978). Для диагностических целей особенно предпочтительно используемые антитела представляют собой F(ab')2 фрагмент. Таким образом достигаются отличные результаты, однако при этом необходимым является вычитание фона. Фрагменты этого типа можно получить с помощью известных способов (например, Herlyn и др., 1983). В общем случае переваривание с помощью пепсина осуществляют при кислом значении рН, и фрагменты отделяют от непереваренного IgG и фрагментов тяжелых цепей белка при использовании белок А Сефароза™ хроматографии.

Преципитат и/или кристаллы в соответствии с изобретением предпочтительно демонстрируют благоприятную биологическую активность, которая может быть легко определена в ферментных анализах, как описано в примерах. В ферментных анализах этого типа антитела в соответствии с изобретением предпочтительно демонстрируют и вызывают ингибирующий эффект, который обычно документально подтверждают значениями IC50 в приемлемом интервале, предпочтительно в микромолярном интервале и более предпочтительно в наномолярном интервале.

Способы определения:

В отношении способов определения настоящее изобретение охватывает все способы определения, известные специалисту в данной области из литературы.

Кристаллические структуры могут быть определены, например, в отношении спектра дифракции при измерении дифракции в рентгеновских лучах. В частности, кристаллические структуры антител в соответствии с изобретением могут быть определены с помощью микроскопических исследований при использовании поляризационных фильтров. Дополнительные способы определения без ограничения таковым охватывают электронные микрофотографии.

Определения размера белка, структурной целостности, чистоты или модели гликозилирования твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной, повторно растворенной или суспендированной форме охватывает, без ограничения таковыми SE-HPLC, пептидное картирование (переваривание), N-терминальное секвенирование, SDS-полиакриламидный гель-электрофорез, Трис/глициновый градиентный гель (невосстановительный), FTIR способ (инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье), CD (циркулярный дихроизм), RAMAN спектроскопию, углеводное окрашивание (PAS метод), олигосахаридное профилирование, определение моносахаридного состава и изоэлектрическое фокусирование.

Стабильность твердых форм или композиций в соответствии с изобретением может быть определена, например, без ограничения таковыми, с помощью программ стабильности, например, в условиях хранения при 25°С и 60%-ной относительной атмосферной влажности и при 40°С и 70%-ной относительной атмосферной влажности в течение продолжительного периода и определения стабильности или структурной целостности белка через регулярные интервалы времени, например, в помощью упомянутых выше способов определения (SE-HPLC, FT-IR, SDS-ПАГЭ (восстановительный и невосстановительный)).

Способы определения биологической активности или эффективности твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной кристаллической, осажденной некристаллической, растворенной или суспендированной форме охватывают, например, без ограничения таковыми, ELISA, биологический клеточный анализ, FTIR или CD.

Способы для определения пониженной тенденции к агрегации твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной кристаллической, осажденной некристаллической, растворенной или суспендированной форме и, таким образом, возможности получения высококонцентрированных композиций, размера кристаллов или размера преципитата охватывают, например, без ограничения таковыми, визуальную проверку, анализ частиц меньше видимого размера, нефелометрию или турбидиметрию или динамическую характеристику рассеивание света.

Выше и ниже все температуры указаны в °С. В следующих примерах «традиционная обработка» означает, что воду прибавляли в случае необходимости, и если необходимо, рН доводили до значения от 2 до 10, в зависимости от состава конечного продукта.

Пример 1: Агенты и условия осаждения и/или кристаллизации, которые могут использоваться в соответствии с изобретением

Следующий список включает в каждом случае все пригодные гидраты, родственные соли и производные указанных соединений, которые являются известными специалисту в данной области.

1. Осаждающие реагенты:

1.1 Соли:

например, тригидрат ацетата натрия, хлорид калия, хлорид натрия, дигидрат цитрата тринатрия, гидрофосфат дикалия, дигидрат гидрофосфата динатрия, сульфат аммония, ацетат аммония, бромид аммония, хлорид аммония, цитрат триаммония, гидроцитрат диаммония, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат диаммония, тартрат диаммония, моногидрат лимонной кислоты, имидазол, ацетат калия, бромид калия, моногидрат цитрата трикалия, дигидрофосфат калия, сульфат калия, тетрагидрат ацетата магния, гексагидрат бромида магния, гексагидрат хлорида магния, гептагидрат сульфата магния, моногидрат дигидрофосфата натрия, декагидрат сульфата натрия, пролин, янтарная кислота, дигидрат ацетата цинка, гептагидрат сульфата цинка

1.2 Полимеры:

например, полиэтиленгликоль (ПЭГ):

циклодекстрины, декстран, карбоксиметилцеллюлоза натрия (Na-CMC), полоксамер, полиакриловая кислота, монометиловый этер полиэтиленгликоля (mPEG), полипропиленгликоль (PPG), поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP).

1.3 Органические растворители:

например, этанол, глицерин.

2. Вспомогательные вещества:

например, вещества, модифицирующие вязкость, детергенты (например, Твин®, Солютол® HS 15, Плюроник®, Кремофор® EL, Авацел® 20, полиоксиэтиленсорбитмоноолеат), восстанавливающие агенты (глютатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол), комплексирующие агенты (EDTA, EGTA).

3. Буферы:

например, фосфатный буфер: фосфат Na (или К); также с добавлением агентов для регуляции изотоничности (например, NaCl (или КС1)), возможное значение рН составляет приблизительно 6,0-8,2;

цитратный буфер: цитрат Na или лимонная кислота, возможное значение рН составляет приблизительно 2,2-6,5; также с добавлением агентов для регуляции изотоничности (например, NaCl); другие соли также являются приемлемыми для изотонизации;

сукцинатный буфер: рН приблизительно 4,8-6,3;

ацетатный буфер: ацетат натрия, рН приблизительно 2,5-6;

гистидиновый буфер: рН приблизительно 6,0-7,8;

глутаминовая кислота: от рН 8,0 до 10,2;

глицин (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин): рН приблизительно от 8,6 до 10,6;

глицинатный буфер: рН приблизительно 6,5-7,5;

имидазол: рН от 6,2 до 7,8;

хлорид калия: рН приблизительно от 1,0 до 2,2;

лактатный буфер: рН приблизительно 3,0-6,0;

малеатный буфер: рН приблизительно 2,5-5,0;

тартратный буфер: рН приблизительно 3,0-5,0

Трис: рН приблизительно 6,8-7,7;

фосфатно/цитратный буфер.

4. Интервалы рН:

Теоретически возможное значение рН составляет 4-10, предпочтительно значение - рН 5-9.

5. Интервалы температуры:

Теоретически возможный интервал температур составляет от -10°С до 40°С,

предпочтительно 0-25°С, особенно предпочтительно от 4°С до 20°С.

6. Стабилизаторы:

6.1 Аминокислоты:

например, аргинин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серин, пролин.

6.2 Сахара и сахарные спирты:

например, сахароза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, трегалоза, глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота.

6.3 Антиоксиданты:

например, ацетон бисульфит натрия, аскорбиновая кислота, эстеры аскорибиновой кислоты, бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВНТ), цистеин, нордигидрогуаретовая кислота (NDGA), монотиоглицерин, бисульфит натрия, метабисульфит натрия, токоферолы, глютатион.

6.4 Консерванты:

например, м-крезол, хлоркрезол, фенол, бензиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, фенил нитрат ртути, фенил ацетат ртути, тимерсал, хлорид бензалкония, хлорид бензетония.

6.5 Циклодекстрины:

например, гидроксипропил-п-циклодекстрин, сульфобутилэтил-п-циклодекстрин, γ-циклодекстрин, α-циклодекстрин.

6.6 Альбумины:

например, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), бычий сывороточный альбумин (БСА).

6.7 Многоатомные спирты:

например, глицерин, этанол, маннитол.

6.8 Соли:

например, ацетатные соли (к примеру, ацетат натрия), хлорид магния, хлорид кальция, трометамин, EDTA (например, Na-EDTA)

7. Изотонические агенты:

например, хлорид натрия, хлорид калия, глюкоза, глицерин, декстроза, хлорид натрия, сульфат натрия.

Пример 2: Кристаллизация Эрбитукса™ с помощью сульфата аммония

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ фосфата, рН 8,0) 400 мкл буфера (10 мМ фосфата, рН 8,0).

100 мкл осаждающего вещества (насыщенный раствор сульфата аммония в 10 мМ фосфата, рН 8,0).

Прибавление осаждающих реагентов к белковому раствору осуществляли в растворе (периодический процесс). После пипетирования образец следует смешать путем ручного перемешивания. Процесс можно осуществлять при комнатной температуре или при 4°С.

Пример 3: Кристаллизация Эрбитукса™ с помощью этанола

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

400 мкл буфера (10 мМ цитрата, рН 5,5).

100 мкл осаждающего вещества (50% (об./об.) этанола в 10 мМ цитрата, рН 5,5)

или

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

500 (мкл осаждающего вещества (50% (об./об.) этанола в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

Прибавление осаждающих реагентов к раствору белка осуществляли в растворе (периодический процесс). После пипетирования образец следует смешать путем ручного перемешивания. Процесс можно осуществлять при комнатной температуре или при 4°С.

Пример 4: Осаждение Эрбитукса™ с помощью сульфата аммония

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ фосфата, рН 8,0) 500 мкл осаждающего вещества (насыщенный раствор сульфата аммония в 10 мМ фосфата, рН 8,0)

или

200 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ фосфата, рН 8,0) 800 мкл осаждающего вещества (насыщенный раствор сульфата аммония в 10 мМ фосфата, рН 8,0).

или

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5)

500 мкл осаждающего вещества (насыщенный раствор сульфата аммония в 10 мМ цитрата, рН 5,5)

или

200 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5) 800 мкл осаждающего вещества (насыщенный раствор сульфата аммония в 10 мМ цитрата, рН 5,5)

Прибавление осаждающих реагентов к раствору белка осуществляли в растворе (периодический процесс). После пипетирования образец следует смешать путем ручного перемешивания. Процесс можно осуществлять при комнатной температуре или при 4°С.

Пример 5: Осаждение Эрбитукса™ с помощью ПЭГа

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ фосфата, рН 8,0).

500 мкл осаждающего вещества (50% (вес./об.) ПЭГа 4000 в 10 мМ фосфата, рН 8,0)

или

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

500 мкл осаждающего вещества (50% (вес./об.) ПЭГа 4000 в 10 мМ цитрата, рН 5,5)

или

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ фосфата, рН 8,0).

500 мкл осаждающего вещества (50% вес./об.) ПЭГа 8000 в 10 мМ фосфата, рН 8,0)

или

500 мкл белка (20 мг/мл в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

500 мкл осаждающего вещества (50% (вес./об.) ПЭГа 8000 в 10 мМ цитрата, рН 5,5).

Прибавление осаждающих реагентов к раствору белка осуществляли в растворе (периодический процесс). После пипетирования образец следует смешать путем ручного перемешивания. Процесс можно осуществлять при комнатной температуре или при 4°С.

Пример 6: Микроскопическое исследование кристаллической формы

Кристаллы, полученные в Примерах 1 и 2, изучали с помощью микроскопа. Определяли как двоякопреломляющие свойства, которые являются типичными для кристаллов, так и способность к окрашиванию Кумасси бриллиантовым голубым, что является типичным для белков.

Обнаруживали кристаллы, имеющие размер приблизительно 50-200 мкм.

Пример 7: Исследование преципитатов на нативность

Преципитаты, полученные в Примерах 4 и 5, повторно диспергировали и исследовали с помощью FT-IR спектрометрии.

Амидные I-2, отклонение спектров исходного материала перед осаждением и повторно суспендированного преципитата были конгруэнтными.

Пример 8: Осуществление способа кристаллизации, описанного в WO 02072636

Для того чтобы проверить результаты, полученные из патентной заявки WO 02072636, сначала попытались в контрольном эксперименте, как описано в WO 02072636, получить кристаллы, которые могут быть последовательно использоваться как кристаллы затравки, с помощью Wizard I сита. Несмотря на то, что кристаллы игольчатой формы были получены в условиях осаждения при использовании хлорида кальция или ацетата кальция, они, однако, также образовались в цитратном буферном растворе без белка. Таким образом, описанные игольчатые кристаллы получают как из белкового раствора, так и из негативного контроля (без белка) при использовании процесса, описанного в WO 02072636. Из этого понятно, что эти кристаллы предположительно представляют собой, в лучшем случае, включения в кристаллах осаждающего реагента.

1. Кристаллическая форма анти-EGFR антитела и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, которая в результате обеспечивает получение биологически активного белка антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде, отличающаяся тем, что анти-EGFR антитело представляет собой Mab С225(цетуксимаб) или Mab h425(EMD 7200).

2. Кристаллическая форма антитела Mab С225(цетуксимаб) и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, которая в результате обеспечивает получение биологически активного белка антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде.

3. Кристаллическая форма антитела Mab h425(EMD 7200), и/или одного из его вариантов, и/или фрагментов, которая в результате обеспечивает получение биологически активного белка антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде.

4. Способ получения кристаллической формы по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что антитело, и/или один из его вариантов, и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водном растворе, осаждают с помощью осаждающего реагента, а именно сульфата аммония, ацетата натрия, цитрата натрия, фосфата калия, ПЭГ и/или этанола, и этот продукт преципитации отделяют.

5. Фармацевтическая композиция, включающая, по крайней мере, одну кристаллическую форму по любому из пп.1-3 и необязательно наполнители, и/или вспомогательные вещества, и/или дополнительные фармацевтически активные ингредиенты.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что концентрация антитела составляет 10-200 мг/мл.

7. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что концентрация антитела составляет 50-150 мг/мл.

8. Применение кристаллической формы по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства, которое включает биологически активное антитело, и/или один из его вариантов, и/или один из его фрагментов.

9. Применение по п.8 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики опухолей и/или опухолевых метастазов.

10. Применение по п.9, где опухоль является выбранной из группы, которая состоит из опухоли мозга, опухоли мочеполового тракта, опухоли лимфатической системы, опухоли желудка, опухоли гортани, моноцитарной лейкемии, аденокарциномы легкого, мелкоклеточной карциномы легкого, рака поджелудочной железы, глиобластомы и карциномы молочной железы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается способов и композиций для повышения эффективности антител для лечебных целей с использованием соединений, потенцирующих NK-клетки.

Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярной и экспериментальной онкологии, и представляет собой фармацевтическую комбинацию для одновременного, раздельного или последовательного введения, которая содержит ингибитор сайта фосфорилирования на субстратах СК2, который включает пептид Р15 (CWMSPRHLGTC) вместе с цитостатическим веществом, фармацевтически приемлемо смешанным с соответствующими переносчиками.
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной онкологии, может быть использовано для лечения онкозаболеваний. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к средствам для профилактики и лечения алкоголизма и наркомании. .

Изобретение относится к области получения высокодисперсных порошков органических лекарственных субстанций и может быть использовано при изготовлении новых лекарственных форм.

Изобретение относится к области медицины. .

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии. .

Изобретение относится к области медицины и направлено на создание и применение системы направленного транспорта лекарственных веществ в раковые клетки. .

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к биологическим препаратам, и может найти применение для лечения ран, ожогов, опухолей и коррекции обменных процессов.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано при лечении пациентов с заболеваниями органов дыхания бактериальной этиологии.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, и касается назальных фармацевтических композиций, предназначенных для лечения аллергического ринита, содержащих беклометазон в виде водной суспензии, обладающих специфическим профилем распределения размеров частиц.
Наверх