Патент ссср 241620

 

24I620 .

ОПИСАНИЕ бо1оз Советских

Социалистических

РЯСО11)" A Й гуно цК1г;,-.. 10ТГ х,1И::Е:.11Л I

Авторы изобретения

H. Г. Беленький, Л. Б. Полонская, Н. Н. Чамин, С. С. Т и В. И. Чугаринов

Всесоюзный научно-исследовательский институт мясн промышленности

Заявитель

"и л"(фр 1

r,V - 1l!л".,"тЕ х

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЪ!Х

И ГОРМОНАЛЪНЬ!Х HPЕПАРАтОВ (1КЪ . ф

8) 1кх у

C I Л 9/у.

Cl 9 z(„. з|веспн I г1тособы:получения ферментов из поджелудочнОЙ железы IKpA пного рогатого icKoта, в клю чающие измельче ние, экстракцию, IBB1сали ванне и фильтрование. Указа нные способы предусматри вают, iB часпности, комплексное получение химотр1спси на, рибонуклеазы и дезокси рибонуклеазы. .По предлагаемому способу, IB отличие от

H3IBBcTHbIx, экстракцию производят ацетапныи буфер ны м раствором при рН 3,5 в присутствии 10%-ного хлористого натрия и температуре 5 — 8 С. Это позволяет в односм технологическом цикле получить рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, химотрипоин, химотрипсин В, липокаин, ингибитор трипсина, карбоMcHIIIcBTHBàçó, и наряду с ними инсулин.

П р и м e p . 3 а м О р О ж е н н у 10 п Одж ел уд 0 чн у! О железу измельчают и суспе ндируют в ацетатном буферном растворе при рН 3,5 в присутствии 10 -ного раствора хлористого натрия в cooTно ше нии 1: 2. 31сстра кци10 прoIBQQBT

15 — 16 час п ри 2 С и псриодичеоком помешп.ва нии, доба вляют IKpHcTBллический сульфат ам мония до концентрации 26 г/л и через час отделяют экстракт. Жмых повторно экстрагируют IB точенис 2 час и затем выделя1от HIHcvлин из вест11ым методом. Из объединенны.с экстракто в,добавлением сульфата аммония до концентрации 110 г!.г осаждают пер вый белко вый высол, кото "11й отделяют после стстаивания в течение 10 — 12 час нри 5 — 8 С и используют для выделения липокаи на. Фильтрат насыщают сульфатом аммония до IKQIHцен грации 220 г/.г и вновь отделяют осадок, 5 содержащий химотрипсин В, дезоксири бонуклеазу,,карбоксипе птидазу и ли покаи1н.

В фильпрат,доба вляют сульфат аммония при

5 С до конце нтрации 450 г/.г и отделяют осадочек, с од е р ж а щ11Й л и п О и а и н, х и м О тр и п с и н >

10 трипсин и ин гибитор трипси на. Добавлением сульфата aììoíHÿ,äî концентрации 560 г/л при 20 С выделяют осадок, содержащий рибонуклеазу. Белковые осадки, после разлив1ных стадии осаждения подвергают, дальнейшей

15 Очистке и,кристаллизации ферментов.

8 — 10 кг высушенного осадка, полученного после второго осаждения из экстракта 1000 кг поджелу дочноЙ жe;1BBB1 (220 e/.1 й.льфата wiмония) и очищенного QT слизистых вещеспв, 20 суслендируют,в 4 объемах воды, добавляют

0,25 от общего объема 1М ацетапного буферного раствора (pI! 4,5), перемсшива1от 1 «ас и, добавляют 0,2 объема насыщенного распвора сульфата аммония. Полученный OcagcIK

25 отделяют фильтрованием, IIIU001,1вают раствором, содержащим 4 объема 20%-ного раствора сульфата аммония и 1 объем !Ì ацетатного бвуферно,o раствора (рН 4), и:1тжимают.

Дальнейшая оч1 стка и кристаллиза1ия химо30 грипсина осуществляются 11звес гным 011000241620

3 бом. Промывные воды объединяют с фильтратом, до водят рН до, 5,5 и до ба вляют 1сульфат аммо1ния до IKoнцентрации, 550 г/л. Полученный оса1док ра1спворяют 1в 5 объемах 2,5 /о-1ного

pacTBoipa суль1фата магния 1при рН 4, 1нагревают illpH:перемеши1вании в течение 10 мин д10

45 С и охлаждают до 10 С. Вы1павший осадок отфильтро1вывают, трижды .по вторяют о1пи1санну ю Вы<ше 06pa60TKJ для пол ното и1звлечения карбоксипептидазы и дезоксирибонуклеазы и оста1вляют для получе1ния ли1покаи1на. Фильтрат разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и, соби1рают 1выдели вшийся осадо1к для получения 1карбокси пептидазы известным способом. К,фильтрату. доба1вляют сульфат аммония до ко нце1нтрации 200 г/л и отделяют осадо1к для выделения из1вестным методом дез01ис1ирибону1клеазы. Об ьеди1ненный осадо1к 1после перьвого и второго осаждения, оста1вленный для выделения ли по1каи1на, суепе1ндируют в восьми1кратном объеме 0,12 iH. сер1ной,кислоты и 1перемешивают 6 час. Нераствори1вшийся остато1к 1суспендируют в 1восьмикрапном объеме дистиллированной воды в течение 3 час, отфильтровывают и отбрасывают нерастворившуюся часть. Объеди нен1ные фильтраты нодвергают эле1ктродиализу через цело1фановую мембрану 1в течени1е 6 час,противев pHICTHJIJI»рова1н1ной 1воды. К образова1вшейся бел1ко1вой суспензии до16авляют трепел или 1кизелыгур (10 г/л), перемешивают 30 мин и. фильтруют.

К 1прозрач1ному охлажденному до 5 С,фильтрату доба1вляют 0,5 объема спирта, 1подкисляют до рН 2 — 2,5 и отстаи1вают 3 — 5 час.

К,профильтрован1ному paicTBoipy медленно ври переме1шива1нии добавляют 5 объемо1в 1спи рта и опстаивают сутки при 0 — 5 С, вно1вь фильтруют и. доба1вляют еще 5 объемов 1епирта. Oicaдок, образова1вший1ся после 1выдержи1ва1ния смеси IB течение суток 1при 0 — 5 С, опфильтровывают и су1шат при тем1пературе 1не IBblше

40 С. Выделение химотри1псина из осадка 1после третьего осаждения (450 г/л сульфата аммо ния) осуществляют из1веспным спо1собом, а фильтрат Illoñëå,êðHcòàëëllçàöHH химотри1псина 1под1ки1сляют,до рН 3 и добавляют сульфат ам1мония до,ко нцентрации 320 г/л. Осадо1к отделяют, распво ряют i ди1стиллирова нной воде (1: 3), добавляют 2 объема (к 1ве су осадка) насыще н1ного раствора сульфата ам1мо1ния и по1сле отстаи1вания IllpH. 5 С отфильтро1вывают.

К фильтрату добавляют ра в1ный 01бъем навыще1нного распвора сульфата аммония, 1перемешивают, QTcTHHiBaIOT 5 — 8 час и опделяют осадо1к, IKQTopblй затем раст1воряют 1в 1дистиллиро,— ванной IBîäå (1: 2), до ба1вляют хлористый кальций до,ко нценпраци и 25 г/л,,доводят рН до 7,8 — 8 добавлением ги1д ра.га окиси, 1кальция и выдерживают ра спвор сутки 1при тем1пеpaTyipe 1не 1выше 5 С. Затем,доба1вляют 5 н. серную 1кислоту до, рН 2,5 — 3 и о1ксалат ам1мония до полного осаждения ионо1в кальция, фильтруют и, добавляют к фильтрату сульфат магния до,ко нцентрации 300 г/л. Белковый

55 б0

Способ получения ферментных и. 1гормональных 1препарато1в из поджелудоч1ной железы крупного рогатого скота, включаю1щий измельчение, экстракцию, IBblсаливание и, фильтро1ва1ние, отличающийся тем, что, с 1целью получения,в одном тежноло1гичес1ко1м ци1кле рибону1клеазы, дезо1ксирибонуклеазы, химотрипсина, химотрипси1на В, карбоксипептидазы, ли,по1каина, и1нгибито ра трипсина и наряду с ними и1н1сулина, экстракцию про во1дят ацетатным буферным раст1вором 1при рН 3,5 1в при1сутст,вии 10 /о-ного хлористого, натрия и температуре 5 — 8 С.

4 с о,г" осадок огстаивают в течение суток при 5 С, отделяют и растворяют в,минимальном количест1ве,борат1ного буферного раствора при

0 С. После очистки от слизистых вещеспв роводят рН до 7,6 — 7,8, добавляют ра вный объем на1сыщенного раствора сульфата магния, оста1вляют 1на 48 час при 0 С, 1кристаллический осадо1к отделяют фильтрацией и подсушивают. IB фильт рат, 1полученный после отделения трипси1на, доба вляют трихлоруксуcгпую кислоту до концентрации 5 и рН не менее 3,5, отделяют выделившийся осадок и рает1воряют его <В 0,1 н, серной 1ки1слоте.

К раствору 1при рН 1 добавляют трихлору.к15 сусную кислоту до концентрации 2,5О/о, нагревают 1до 70 С и выдержи1вают при 1перемеши1ва1нии 1 — 2 час, После охлаждения и, фильт1рова1ния к фильтрату доба1вляют трихлору1ксусную кислоту до 5 -ной,концентрации, и,про20 гре1вают 20 мин при 70 С. Выпадавший осадок отфи:IbTp0!BbliBaloT, paicTBOp охлаждают,и отфильтрова1н ный осадок. пять раз суопендируют в,пяти1кратном объеме ацетона и 1подсушивают, получая а1морф1ный 1препарат и1н1гибитора

25 трипсина.

Осадок 1после следующего осаждения (560 г/ г сульфата аммо1ния) pacTIBoipHIOT в

10-IKpaTHoli(1коли честве дистиллиро1ва1н1ной во ды, до1водят рН до 3,5 и смешивают с ра1в1ным

50 объемом 1насыщенного раствора 1сульфата а1ммо1ния. Осадок отбрасывают, а в фильтрате до1во1дят рН,до 4,2 и доба вляют сульфат аммо1ния,до концентрации 150 г/л. Белковый осадок о1тфильтровывают, растворяют в

35 5-крат ном 1количестве 20 /о-,ного .раствора сульфата аммония, доводят рН до 3 — 3,5, 1пропревают 5 мин 1при, 95 — 97 С, быстро охлахкдают до 1ком1натной тем1пературы и,перемеши1вают в тече1ние 2 час. Осадок QTiápacbllBaloT, а,в

40 фильтрате уста1на1вливают рН 4,2 и.добавляют сульфат амм1о1ния до степени насыщения 0,8.

Осадок отфильтровывают, распворяют IB paiBном объеме дистиллироваHIHOH воды,, фильтруют с кизельгуром и,кри1сталлизуют рибо45 нуклеазу путем добавления насыщенного раствора c)!ëüôàòà аммония до 1поя1вления слабой мути. После этого рН доводят,до 4,6 добавле,нием одкого натра (1 IH.) и через 1супки отделяют выпавшие кристаллы рибо1нуклеазы.

Предмет изобретения