Способ восстановления эпителия тощей кишки лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к разработке способов лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления эпителия тощей кишки после воздействия ионизирующего излучения. Для этого старым лабораторным животным через 25-30 мин после воздействия ионизирующим излучением осуществляют внутривенную трансплантацию аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6×106 клеток/кг. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, способных обеспечивать регенераторный потенциал тканей, а именно антиапоптогенное действие, увеличение скорости клеточного обновления криптального эпителия тощей кишки, угнетенное воздействием ионизирующего излучения, при отсутствии осложнений лечения. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления эпителия тощей кишки лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения.

Природа радиационного поражения организма животного и человека интенсивно изучается уже несколько десятилетий. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) относится к критическим системам клеточного обновления млекопитающих при облучении. Под действием излучения в слизистой оболочке ЖКТ происходят резкие нарушения динамического равновесия между отдельными пулами, приводящие к тяжелым функциональным расстройствам в самой системе. В зависимости от выраженности расстройств это может иметь существенное значение для жизнедеятельности всего организма. Восполнение клеточной убыли составляет первостепенную задачу проводимой функциональной терапии, способствующей ослаблению первичных нарушений, угрожающих жизни. Первичным нарушением в тонком кишечнике является клеточное опустошение ворсинок и крипт.

Восстановление регенерации криптального эпителия после острого лучевого поражения можно свести к пролиферации клеток, сохранивших жизнеспособность, благодаря чему восполняется убыль популяции клеток, а следовательно, восстанавливается их функциональная полноценность (О.И.Василенко. Радиационная экология [Текст] /Василенко О.И., М.: Медицина, 2004. - 88 с.).

Следующим направлением в патогенетической терапии лучевых поражений эпителия кишечника является использование метаболических средств (Г.Л.Вышковский. Регистр лекарственных средств России (Текст)/ Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С.195).

Препарат - бутилированный гидрокситолуол может использоваться при лучевых поражениях слизистой оболочки кишечника, так как оказывает выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, противовоспалительное, регенерирующее действие.

Недостатками применения этих препаратов (метаболических средств и, в частности, бутилированного гидрокситолуола) являются побочные эффекты: аллергические реакции, уретрит, простатит.

Восстановление регенерации эпителия тощей кишки обеспечивается применением препаратов, повышающих регенераторный потенциал эпителиоцитов крипт. Типичным представителем препаратов, оказывающих стимулирующее действие на процессы регенерации, является дезоксинат (деринат). Деринат представляет собой натриевую соль ДНК, полученную из молок осетровых рыб. Данный препарат применяют не позднее 24 ч после облучения. Его вводят однократно внутримышечно или подкожно в объеме 15 мл (75 г активного вещества) (Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита [Текст]: учеб. пособие для студентов мед. Вузов / С.А.Куценко, Н.В.Бутомо, А.Н.Гребенюк. - СПб.: Фолиант, 2004. - 527 с.).

Однако применение препаратов данной группы сопряжено с побочными эффектами и противопоказаниями. Так, после инъекций водного раствора дезоксината через 1,5-3 ч возникает выраженная гипогликемия (Вышковский Г.Л. Регистр лекарственных средств России [Текст] / Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С. 303-304).

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению регенераторного потенциала ткани - эпителия тощей кишки старых лабораторных животных, угнетенных воздействием ионизирующего излучения, а также отсутствие их осложнений.

Технический результат достигается за счет внутривенной аллогенной трансплантации через 25-30 мин после облучения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты в количестве 6×106 клеток на 1 кг веса животного.

Сущность изобретения заключается в применении впервые для восстановления регенераторного потенциала эпителия тощей кишки ММСК, выделенных из плаценты.

Известно, что ММСК продуцируют весь спектр противовоспалительных цитокинов (IL - 4, 10, TGF - β). ММСК способны оказывать цитопротективное действие, выделяя белки теплового шока (HSP70), а также вырабатывая цитокин HIF-1α, могут приводить к снижению выраженности апоптоза. Указанный цитокиновый профиль может приводить к изменению клеточной популяции, к снижению степени выраженности воспалительной реакции и уменьшению зоны повреждения. Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и осуществлять функцию замещенных клеток. При внутривенной трансплантации аллогенных совместимых ММСК, выделенных из плаценты, в количестве 6×106 через 25-30 мин после ионизирующего излучения не возникает реакции отторжения трансплантата, так как ММСК обладают слабыми иммуногенными свойствами, а также не возникает реакции «трансплантат против хозяина» за счет иммуносупрессивных свойств ММСК. Именно эти свойства ММСК дают возможность их использовать для восстановления регенерации эпителиоцитов тощей кишки.

Из анализа научно-технической и патентной информации, использование ММСК, выделенных из плаценты, для восстановления регенерации эпителиоцитов тощей кишки нами не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты по получению культуры ММСК проведены на 8 крысах линии Wistar, массой 150-170 гр. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 мес. Производилось выделение плаценты в сроке гестации 18 дней. Образец ткани массой 2 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при рН 7.2, без ионов Са2+ и Mg2+, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин при 37°С). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных не измельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-MEM (ICN, США), содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл/см2 на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания). Культивирование производилось при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: Х=а*10000, где Х - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°С. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с фетальной бычьей сывороткой (10%) и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в концентрации 10000 кл/ см2.

Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).

Моделирование экстремального воздействия.

Эксперименты выполнены на 28 белых лабораторных крысах-самцах возраста 6-8 месяцев, массой 200-220 г. Изучалось воздействие ионизирующего излучения (ИИ) дозой 3 Гр (мощность поглощенной дозы 15 сГр/мин). Тотальное облучение крыс осуществлялось однократно γ-излучением. В качестве источника γ-квантов был использован 60Со. Контрольную группу составили животные, не подвергшиеся облучению. В каждой группе насчитывалось 14 крыс. Внутри группы было выделено 2 подгруппы по 7 животных в каждой. Крысам парентерально производилось введение: животным первой подгруппы внутривенно вводилась суспензия ММСК 6×106 клеток на 1 кг веса, вторая подгруппа крыс являлась контролем в каждой из групп, животным вводили физиологический раствор 0,5 мл внутривенно.

Внутривенные введения осуществлялись через 25-30 мин после облучения однократно в указанных выше дозах (таблица 1).

Таблица 1
Доза ИИ Препарат Путь введения Доза препарата Время проведения аутопсии органов
24 часа 7 суток
3 Гр ММСК в/в 2 млн. кл. в 0,5 мл физ. раствора. 7 шт. 7 шт.
NaCl в/в 0,5 мл 7 шт. 7 шт.

Для осуществления морфометрического анализа во всех сериях экспериментов производилась аутопсия тощей кишки. Заливку проводили в парафин и готовили срезы с соблюдением строгой ориентации ворсин и крипт толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

- Оценивали пролиферативную активность кишечного эпителия с помощью определения митотического индекса (МИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты в состоянии митоза, встречаемые на 3000-3500 клеток, полученный результат выражали в процентах.

Морфологическая верификация и количественная оценка апоптоза осуществлялись при флуоресцентной микроскопии с использованием двух флуорохромов: акридин оранжевым (производство Финляндия) и Annexin V - FITC fluorescence microscopy (производство США). Анализ осуществлялся с помощью флуоресцентного микроскопа Micmed - 2 вариант 12 (увеличение 40*10) при длине возбуждающего света 495 нм.

- Оценивали уровень запрограммированной гибели эпителиоцитов с помощью определения апоптотического индекса (АИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты с выявляемой картиной апоптоза, встречаемые на 3000 клеток, полученный результат выражали в процентах

- Среднюю клеточность в одной крипте (СКК) определяли как отношение общего числа подсчитанных криптальных клеток к

- количеству анализированных крипт, выраженному в процентах (Труфакин В.А. и др., 1990).

Гистологические препараты тощей кишки анализировались с помощью микроскопа Micros МС - 50 (Австрия) при увеличении 100·15. Полученные данные обрабатывали методами математической статистики с использованием t критерия Стьюдента.

В контрольной и опытной подгруппах на первые сутки после воздействия ИИ установлено выраженное угнетение митотической активности эпителиоцитов крипт, снижение средней клеточности в 1 крипте. Анализируя количество эпителиоцитов в состоянии апоптоза, установлено существенное повышение уровня запрограммированной клеточной гибели (таблица 2).

Таблица 2
Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки зрелых лабораторных животных на 1 сутки, М±m, n=7
Параметры Содержание клеток после воздействия ИИ
После введения NaCl После введения ММСК
Митотический индекс, % 5,73±0,86 4,82±1,16
Апоптотический индекс, % 12,77±1,71 13,85±1,32*
Средняя клеточность 1 крипты 55,82±3,74 49,20±4,80
Примечание: * отличие от подгруппы зрелых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с p<0,05.

В контрольной подгруппе на 7 сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в криптах, подсчете средней клеточности в 1 крипте, отмечено восстановление перечисленных показателей до значений нормы. В то же время уровень содержания клеток в состоянии апоптоза оставался существенно выше значений нормы (АИ: 6,60±0,63%, p<0,05).

В подгруппе лабораторных животных, которым была произведена внутривенная трансплантация аллогенных ММСК, на 7 сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в эпителиоцитах крипт, установлено существенное повышение числа митотически делящихся клеток. Митотический индекс был на 36% выше, чем в контроле. При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза отмечено снижение выраженности апоптоза по сравнению с контрольной подгруппой (АИ: 4,75±0,72%, p<0,05), и показатель, характеризующий запрограммированную гибель клеток, существенно не отличался от значений нормы. Анализируя среднюю клеточность в 1 крипте, выявлено восстановление и повышение содержания криптального эпителия по сравнению с контрольной подгруппой на 21% (таблица 3).

Таблица 3
Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки зрелых лабораторных животных на 7 сутки, М±m, n=7
Параметры Содержание клеток после воздействия ИИ
После введения NaCl После введения ММСК
Митотический индекс, % 8,92±0,92 12,08±0,92*
Апоптотический индекс, % 6,60±0,63 4,75±0,72*
Средняя клеточность 1 крипты 72,82±4,02 88,15±4,42*
Примечание: * отличие от подгруппы зрелых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с p<0,05.

Таким образом, полученные данные позволяют считать ММСК цитопротективными в отношении эпителиоцитов слизистой оболочки тощей кишки.

На основании проведенных исследований можно сформулировать следующие выводы:

1. В условиях воздействия ионизирующего излучения трансплантированные аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки вызывают увеличение скорости клеточного обновления криптального эпителия тощей кишки.

2. В условиях воздействия ионизирующего излучения аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оказывают антиапоптогенное действие.

Способ восстановления эпителия тощей кишки старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения, который осуществляют через 25-30 мин после облучения путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6·106 клеток/кг.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиофармакологии, и может быть использовано для моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной и клинической медицине. .

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования под воздействием кинетической энергии травмы любой локализации, а также для создания модели очагового поражения головного мозга с целью изучения патоморфологических и патофизиологических процессов, отработки патогенетических методов лечения.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при исследовании влияния наночастиц металлов на опухолевый рост. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в лечении больных с перстневидноклеточным раком желудка. .

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной токсикологии, и может быть использовано для профилактики токсического действия молибдена у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано при исследовании хронического токсического действия тяжелых металлов на организм.

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологии движений и электрофизиологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной нефрологии и может быть использовано для моделирования хронической токсической нефропатии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной токсикологии и может быть использовано для профилактики токсического действия молибдена у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к стресспротекторному средству. .
Изобретение относится к медицине и предназначено для улучшения качества десны перед устранением рецессии десны у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию антиоксидантного средства. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии, педиатрии, нутрициологии. .

Изобретение относится к соединению, представленному следующей формулой [I-D1] или к его фармацевтически приемлемой соли: где каждый символ определен в формуле изобретения.

Изобретение относится к производным 4-аминокарбонилпиримидина формулы (I) и их применению в качестве антагонистов P2Y12 рецептора для лечения и/или профилактики заболеваний или болезненных состояний периферических сосудов, а также сосудов, снабжающих внутренние органы, сосудов печени и почек, при лечении и/или профилактике сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний и состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов, включая тромбоз у человека и млекопитающих.

Изобретение относится к новым амидным производным общей формулы [1] в любой из версий (А) или (В) или его фармацевтически приемлемой соли, которые обладают свойствами ингибитора тирозинкиназы BCR-ABL и могут найти применение для лечения хронического миелолейкоза, острого лимфобластного лейкоза и острого миелобластного лейкоза.

Изобретение относится к соединению, представленному формулой (Ib) в которой R1 представляет (1) -N(R 1A)SO2-R1B, (2) -SO2NR 1CR1D, (3) -COOR1E, (4) -OR1F , (5) -S(O)mR1G, (6) -CONR1H R1J, (7) -NR1KCOR1L, или (8) циано, где m представляет 0, 1 или 2; Х представляет собой связь или спейсер, содержащий 1-3 атома, в качестве основной цепи; R1A, R1B, R1C, R1D , R1E, R1F, R1G, R1H , R1J, R1K и R1L каждый независимо представляет собой (1) атом водорода, (2) С1-8алкильную группу, которая может иметь заместитель(заместители), выбранные из группы, состоящей из [1] гидрокси группы, [2] карбокси группы, [3] С1-6алкокси группы, которая может быть замещена галогеном, и [4] моно- или дизамещенного аминозамещенного С1-8 алкильной группой или (3) тетрагидропиран, пиперазин, пиперидин, азетидин, пирролидин или морфолин, каждый из которых может иметь заместитель (заместители), выбранные из группы, состоящей из гидрокси, галогена, С1-8алканоила и C1-10галогеналкила, и где R1C и R1D или R1H и R1J вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать пиперазин, пиперидин, азетидин, пирролидин или морфолин, каждый из которых может иметь заместитель (заместители), выбранные из группы, состоящей из гидрокси, галогена, С1-8алканоила и C1-10галогеналкила; кольцо А представляет собой бензольное кольцо или пиридиновое кольцо, каждое из которых может иметь заместитель (заместители), выбранные из группы, состоящей из С1-8алкила, нитро, C1-6алкокси и галогена; кольцо В представляет собой бензольное кольцо, пиридиновое кольцо или пиразиновое кольцо, каждое из которых может иметь заместитель (заместители), выбранные из группы, состоящей из С1-8алкила; R51 представляет собой (1) С1-8алкил, С2-8алкенил или С2-8алкинил, каждый из которых может иметь заместитель (заместители) бензола или (2) бензол, пиразол, пиридин, изоксазол, тиофен, бензотиазол, каждый из которых может иметь заместитель (заместители), выбранные из группы, состоящей из С1-4алкокила, C1-6алкокси, C1-6алкилтио, С1-6алкилсульфинила, C1-6алкилсульфоинила и галогена; R52 представляет собой атом водорода; R53 представляет собой (1) С1-8алкил, С2-8алкенил или С2-8алкинил, каждый из которых может иметь заместитель (заместители) бензола или (3) бензол, пиразол, пиридин, тиофен, бензодиоксан, циклогексан или тетрагидропиран, каждый из которых может иметь заместитель(заместители), выбранные из группы, состоящей из [1] гидрокси группы, [2] циано, [3] карбомоила, [4] аминокарбонила, замещенного одним или двумя заместителями выбранными из (а) гидрокси группы, (b) амино, (с) С1-4алкокси, (d) моно или дизамещенного амина, замещенного С1-8углеводородной группой, (е) карбоксила и (f) C1-6алкоксикарбонила, [5] карбокси, [6] галогена, [7] C1-6алкокси, [8] С1-6алкилсульфонила, [9] амино, [10] C1-6ациламино, [11] алкил-сульфониламино, [12] циклического аминокарбонила и [13] С1-8углеводородная группа, замещенная 1 или 2 заместителями, выбранными из (а) гидрокси, (b) амино, (с) С1-4алкокси, (d) моно или дизамещенного амина, замещенного С1-8углеводородной группой, и (е) аминокарбонила, замещенного С1-8углеводородной группой; к его соли, его N-оксиду, его сольвату.
Изобретение относится к медицине, в частности к косметологии. .

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к разработке способов лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления эпителия тощей кишки после воздействия ионизирующего излучения

Наверх